第六章 酶化学

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1、第六章第一部分酶化学本部分内容：本部分内容：酶的概述酶的概述酶的作用机制酶的作用机制酶促动力学酶促动力学酶的应用及发展酶的应用及发展 酶的概述酶的概述一、酶催化作用的特点一、酶催化作用的特点二、酶的化学本质及组成二、酶的化学本质及组成三、酶的命名与分类三、酶的命名与分类四、酶的结构与功能的关系四、酶的结构与功能的关系酶酶(Enzyme)的概念的概念:酶是活细胞产生的，具有催化生物酶是活细胞产生的，具有催化生物反应功能的蛋白质大分子及核酸。反应功能的蛋白质大分子及核酸。酶的概念酶的概念酶的概念酶的概念一、酶催化一、酶催化作用作用特点：特点：与一般化学催化剂相比，与一般化学催化剂相比，其共性有其共

2、性有：1、用量少而催化效率高；、用量少而催化效率高；2、不改变化学反应的平衡点；、不改变化学反应的平衡点；3、可降低反应的活化能：、可降低反应的活化能：酶的概念酶的概念酶的概念酶的概念l活化能活化能(Activationenergy)：l分子由常态转变为活化状态所需的能量。在一分子由常态转变为活化状态所需的能量。在一定温度下定温度下1mol底物全部进入活化态所需要的自底物全部进入活化态所需要的自由能。由能。（一）催化效率高：（一）催化效率高：l通常要高出非生物催化剂催化活性的通常要高出非生物催化剂催化活性的1061013倍。倍。2H2O22H2O +O21mol过氧化氢酶过氧化氢酶5106mo

3、lH2O21molFe+2610-4molH2O2（二）、具高度专一性（二）、具高度专一性l 一种酶只能催化一种酶只能催化一种一种或或一类一类十分相似的反应。十分相似的反应。l底物（底物（substrate，S)：酶作用的物质酶作用的物质。l绝对专一性绝对专一性：只作用：只作用一种一种底物。底物。l相对专一性相对专一性：作用于：作用于一类一类底物。底物。酶作用的专一性酶作用的专一性酶酶的的专专一一性性：一一种种酶酶仅仅能能作作用用于于一一种种底底物物，或或一一类类分分子子结结构构相相似似的的物物质质，并并催催化化某某种种类类型型的的反反应应。这这种种特特性性称称为为酶酶的的专专一一性性，又又叫

4、叫做做酶酶的的特异性或选择性。特异性或选择性。酶酶作用的作用的专一性专一性结构专一性结构专一性立体异构专一性立体异构专一性族（基团）专一性族（基团）专一性绝对专一性绝对专一性族族（基团）（基团）专一性：可作用于一类或一些结构很相似专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。的底物。RCOO-+R OH+H+酯酶酯酶：RCOR+H2OOOCH2OHOHOHOH15-葡萄糖葡萄糖苷酶苷酶O R+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ROH绝对专一性：只能作用于某一底物。绝对专一性：只能作用于某一底物。脲酶脲酶：H2NCNH2+H2OO2NH3+CO2胰蛋白酶的基团专一性胰蛋白酶的基团专一性消化道

5、几种蛋白酶的专一性立体异构专一性立体异构专一性立体异构专一性立体异构专一性l酶酶只能催化一种立体异构体发生某种化只能催化一种立体异构体发生某种化学反应，而对另一种立体异构体则无作学反应，而对另一种立体异构体则无作用。用。（三）、酶易失活：（三）、酶易失活：l凡使凡使pr变性的因素都可使酶破坏变性的因素都可使酶破坏,l酶在温和条件下作用。酶在温和条件下作用。（四）（四）、酶活性受多种方式调控：酶活性受多种方式调控：l如：抑制剂、反馈抑制、酶原激活、激如：抑制剂、反馈抑制、酶原激活、激素等。素等。（五）、有些酶的活性与辅酶、辅基五）、有些酶的活性与辅酶、辅基及金属离子有关。除去，酶失活。及金属离子

6、有关。除去，酶失活。酶的概念酶的概念酶的概念酶的概念二、酶的化学本质二、酶的化学本质1、大多数酶是蛋白质大多数酶是蛋白质：元素组成与分子量元素组成与分子量化学结构与空间结构；化学结构与空间结构；理化性质理化性质:两性性质；胶体性质；两性性质；胶体性质；变性失活；可被蛋白酶分解；结晶；测序。变性失活；可被蛋白酶分解；结晶；测序。2、某些某些RNA具有催化活性具有催化活性,将本质为将本质为RNA的酶称的酶称核酶（核酶（ribozymes)。酶的概念酶的概念酶的概念酶的概念三、酶的命名与分类三、酶的命名与分类（一）酶的命名一）酶的命名酶的命名有两种方法：系统名、惯用名酶的命名有两种方法：系统名、惯用

7、名惯用名：命名原则惯用名：命名原则根据酶催化反应的性质来命名。根据酶催化反应的性质来命名。如催化水解反应的酶如催化水解反应的酶-水解酶水解酶催化氧化反应的酶催化氧化反应的酶-氧化酶或脱氢酶氧化酶或脱氢酶 催化转移氨基的酶催化转移氨基的酶-转氨酶转氨酶根据被作用的底物兼顾反应的性质来命名。根据被作用的底物兼顾反应的性质来命名。根据酶的来源命名。如细菌淀粉酶、胃蛋白酶。根据酶的来源命名。如细菌淀粉酶、胃蛋白酶。酶的命名与分类酶的命名与分类酶的命名与分类酶的命名与分类系统名系统名:根根据据酶酶催催化化反反应应的的类类型型分分为为六六大大类类：分分别别用用1，2，3，4，5，6编号编号1、氧氧化化还还

8、原原酶酶类类2、转转移移酶酶类类3、水水解解酶酶类类4、裂裂分分酶酶类类5、异异构酶类构酶类6、合成酶类、合成酶类根根据据底底物物的的性性质质和和反反应应键键的的性性质质，每每一一类类又又可可分分为为若若干干亚亚类类及及次亚类。仍然用次亚类。仍然用1，2，3，编号。编号。在次亚类中编号。在次亚类中编号。：乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 EC 1.1.1.27EC(Enzyme Commision)第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号每个酶有两个名称每个酶有两个名称：系统名、惯用名系统名、惯用名l惯用名惯用名：简单、便于使用；：简单、便于使用；

9、l系统名系统名：明确标明酶的底物及催化：明确标明酶的底物及催化反应的性质。反应的性质。酶的命名与分类酶的命名与分类酶的命名与分类酶的命名与分类（二）酶的分类（二）酶的分类1、根据酶的组成分类：、根据酶的组成分类：（1）、单纯酶）、单纯酶（简单蛋白质）：（简单蛋白质）：其活性仅取决于其蛋白质结构。其活性仅取决于其蛋白质结构。如：蛋白酶、淀粉酶等。如：蛋白酶、淀粉酶等。酶的命名与分类酶的命名与分类酶的命名与分类酶的命名与分类（2）结合酶：酶蛋白）结合酶：酶蛋白+辅因子辅因子=全酶全酶 辅因子辅因子(cofacter)：热稳定的非蛋白小分热稳定的非蛋白小分子。子。l按分子组成：按分子组成：金属离子金

10、属离子：Mg2+、Mn2+小分子有机物小分子有机物：NAD+、NADP+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸按与酶的结合程度按与酶的结合程度:辅酶辅酶(coenzyme):结合较结合较松松，可透析去除可透析去除；辅基辅基(prostheticgrup)：结合较结合较紧紧，透析不易除去透析不易除去。酶蛋白酶蛋白负责专一性；负责专一性；辅因子辅因子负责电子、原子或基团转移。负责电子、原子或基团转移。同一辅因子可与多种不同酶蛋白结合，同一辅因子可与多种不同酶蛋白结合，显示不同催化活性。显示不同催化活性。2.按酶的分子特点分：按酶的分子特点分：（1）

11、、单体酶：）、单体酶：一条肽链构成。一条肽链构成。（2）、寡聚酶：）、寡聚酶：几条到多条肽链（相同或不同）几条到多条肽链（相同或不同）组成。组成。（3）、多酶体系：）、多酶体系：几种酶彼此嵌合的复合体，几种酶彼此嵌合的复合体，有利于一系列反应连续进行。有利于一系列反应连续进行。l3.国际酶学委员会国际酶学委员会(Enzyme Commision)根据酶催化反应的类型分类根据酶催化反应的类型分类 （1）、氧化还原酶、氧化还原酶（2）、转移酶）、转移酶（3）、水解酶）、水解酶（4）、裂解酶）、裂解酶（5）、异构酶）、异构酶（6）、合成酶）、合成酶酶的命名与分类酶的命名与分类酶的命名与分类酶的命名与

12、分类酶的编号酶的编号EC为为EnzymeCommision酶学委员会缩写酶学委员会缩写 酶的命名与分类酶的命名与分类酶的命名与分类酶的命名与分类（一）酶的分类（一）酶的分类1.氧化还原酶类氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递的氧化主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。还原反应。AH2 +B（O2）供氢体供氢体受氢体受氢体A+BH2（H2O2，H2O）根据受氢体的性质，氧化还原酶类可分为：根据受氢体的性质，氧化还原酶类可分为：（1）脱氢酶类）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。：催化直接从底物上脱氢的反应。AH2+BA+BH2（需需辅酶辅酶或辅酶或辅酶）（2）氧化酶类）氧化酶类催化

13、底物脱氢，氧化生成催化底物脱氢，氧化生成H2O2：AH2+O2A+H2O2（需需FAD或或FMN）催化底物脱氢，氧化生成催化底物脱氢，氧化生成H2O：2AH2+O22A+2H2O（3）过氧化物酶）过氧化物酶ROO+H2O2RO+H2O+O2（其它）（其它）（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）O2+OHOHC=OC=OOHOH（顺，顺顺，顺-已二烯二酸）已二烯二酸）2.转移酶类转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。：催化化合物中某些基团的转移。AX+BA+BX根据根据X分成分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含

14、氮基、烃基、含氮基、含磷基（激酶含磷基（激酶）和含硫基的酶。和含硫基的酶。已糖激酶已糖激酶葡萄糖葡萄糖+ATP-6磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖+ADPMg+3.水解酶类水解酶类：催化加水分解作用。催化加水分解作用。4.AB+H2OAOH+BH5.4.裂解酶类裂解酶类：催化非水解性地除去基团而形成双键的反催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆反应。应或逆反应。CH3C=OCOOHCC键CH3C=OH+CO2 （脱羧酶、醛缩酶）CO键CH2COOHHOCHCOOHHCCOOHHOOCCH+H2O（脱水酶）脱水酶）CN键COOHCHNH2CH2COOHCOOHCHHCCOOH+NH3（脱氨酶）脱氨酶）5

15、.异构酶异构酶：催化催化各种异构体之间的互变。各种异构体之间的互变。AB常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。6.合成酶类合成酶类：催化有催化有ATP参加的合成反应参加的合成反应。A+B+ATPAB+ADP+Pi四、四、酶的结构与功能的关系酶的结构与功能的关系一、酶的活性中心一、酶的活性中心（一）（一）酶的活性中心酶的活性中心概念：概念：活性中心：活性中心：酶分子中能同底物结合并起催化作用的酶分子中能同底物结合并起催化作用的空间部位。空间部位。羧肽酶的活性中心羧肽酶的活性中心l实验：实验：酶蛋白经酶蛋白经水解切去部分肽水解切去部分肽链

16、后，残留部分链后，残留部分仍有活性。仍有活性。l说明：说明：参与催化参与催化反应的只是其中反应的只是其中一小部分，即一小部分，即活活性中心。性中心。活性中心的实质活性中心的实质活性中心即酶分子活性中心即酶分子中在三维结构上中在三维结构上相互靠近的几个相互靠近的几个aa残基或其上的残基或其上的某些基团。某些基团。活性中心以外的部活性中心以外的部分对酶催化次要分对酶催化次要但对活性中心形但对活性中心形成提供结构基础。成提供结构基础。胰凝乳蛋白酶的活性中心胰凝乳蛋白酶的活性中心（三）活性中心的特点：三）活性中心的特点：1、仅为酶体积的很小部分；、仅为酶体积的很小部分；2、具有一定的空间构象；、具有一

17、定的空间构象；3、S与与E靠次级键结合；靠次级键结合；4、是由特定空间构象维持、是由特定空间构象维持的一个的一个裂隙裂隙。酶促反应机理酶促反应机理溶菌酶活性中心（四）研究酶活性中心的方法：（四）研究酶活性中心的方法：1、通过研究专一性底物判断确定、通过研究专一性底物判断确定E活性中活性中心的结构；心的结构；2、用化学修饰法共价修饰、用化学修饰法共价修饰E分子的一些功分子的一些功能基团，以查出哪些基团是活性必需的；能基团，以查出哪些基团是活性必需的；3、X-衍射直接探明活性中心。衍射直接探明活性中心。酶促反应机理酶促反应机理二、酶原的激活二、酶原的激活没有活性的酶的前体称为没有活性的酶的前体称为

18、酶原酶原。酶原转变成有活性。酶原转变成有活性的酶的过程称为的酶的过程称为酶原的激活酶原的激活。这个过程实质上是酶。这个过程实质上是酶活性部位形成和暴露的过程。活性部位形成和暴露的过程。在在组织细胞中，某些酶以酶原的形式存在，可组织细胞中，某些酶以酶原的形式存在，可保护分泌这种酶的组织细胞不被水解破坏保护分泌这种酶的组织细胞不被水解破坏。胰蛋白酶的激活胰蛋白酶的激活缬缬 天天 天天天天天天赖赖 异异异异缬缬 甘甘组组S SS S丝丝丝丝S SS S肠激酶（激活作用）肠激酶（激活作用）肠激酶（激活作用）肠激酶（激活作用）缬缬 天天 天天天天天天赖赖异异异异甘甘 组组SS丝丝丝丝缬缬SS活性中心活性

19、中心活性中心活性中心胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶原原原原胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶提问：为什么不直接以酶形式存在呢提问：为什么不直接以酶形式存在呢？答案：保护正常组织不受伤害。答案：保护正常组织不受伤害。活性部位三、三、同工酶同工酶(isoenzyme)能催化相同的化学反应，但在蛋白质分子的结能催化相同的化学反应，但在蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。一组酶。乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（LDH）MHMM MMM4HMMMM3HMMHHM2H2MHHHMH3HHHHH4抗体酶抗体酶既是抗体又具有催化功能的蛋白质既是抗

20、体又具有催化功能的蛋白质.酶的作用机制酶的作用机制 l酶的酶的催化作用，过渡态，活化能催化作用，过渡态，活化能l中间产物学说中间产物学说l决定酶作用专一性的机制决定酶作用专一性的机制l过渡态互补过渡态互补l抗体酶抗体酶l使酶具有高催化效率的因素使酶具有高催化效率的因素一一酶的催化作用与分子活化能酶的催化作用与分子活化能化学反应自由能方程式化学反应自由能方程式G=H-TS（G是总是总自由能的变化，自由能的变化，H是总是总热能的变化，热能的变化，S是熵是熵的变化）的变化）当当G0，反应不能自发进行。反应不能自发进行。当当G0，反应能自发进行。反应能自发进行。活化能活化能：分子由常态转变为活化状态所

21、需的能量。是指分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，在一定温度下，1mol反应物全部进入活化状态所需的自反应物全部进入活化状态所需的自由能。由能。促使化学反应进行的途径：促使化学反应进行的途径：1.用加热或光照给反应体系提供能量。用加热或光照给反应体系提供能量。2.使用催化剂降低反应活化能。使用催化剂降低反应活化能。酶和酶和一般催化剂的作用就是降低化学反应所一般催化剂的作用就是降低化学反应所需的活化能，从而使活化分子数增多，反应需的活化能，从而使活化分子数增多，反应速度加快。速度加快。酶与底物间的作用酶与底物间的作用酶的作用机制酶的作用机制二二.中间产物学说：中间产物学说：1、

22、学说认为：、学说认为：当酶催化一化学反应时，首当酶催化一化学反应时，首先先E和和S结合形成中间产物结合形成中间产物ES，然后它然后它再分解成产物再分解成产物P并释放并释放酶酶E。S+E ES E+P酶的作用机制酶的作用机制2、中间产物、中间产物1）中间产物比底物需较少的活化能就可分）中间产物比底物需较少的活化能就可分解成产物并放出酶。解成产物并放出酶。2）ES决定酶促反应速度。决定酶促反应速度。3）中间产物形成的实验依据：）中间产物形成的实验依据：1.同位素同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）；标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）；2.吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。吸收光谱法

23、（过氧化物酶与过氧化氢结合）。酶的作用机制酶的作用机制羧肽酶羧肽酶A的结构的结构由于结合了底由于结合了底物而改变物而改变A:未结合底物未结合底物B:E-S中间复合物中间复合物酶的作用机制酶的作用机制三、决定酶作用专一性的机制三、决定酶作用专一性的机制（一）（一）锁钥学说锁钥学说：1894年年E.Fischer提出：提出：S分子或分子或其一部分像钥匙其一部分像钥匙一样楔入一样楔入E活性活性中心部位。中心部位。此学说强调此学说强调E与与S结构互相吻合结构互相吻合(刚性模板刚性模板)。酶的作用机制酶的作用机制（二）诱导契合学说（二）诱导契合学说1958年年Koshland提提出：当出：当E与与S接近

24、时，接近时，E蛋白蛋白受受S分子的诱分子的诱导，其构象发生有导，其构象发生有利于利于S结合的变化结合的变化，E与与S在此基础上互在此基础上互补契合、进行反应。补契合、进行反应。酶的作用机制酶的作用机制四四.过渡态互补：过渡态互补：Pauling提出提出过渡态理论认为过渡态理论认为：E与与S的过渡态互补，亲和力最强，释的过渡态互补，亲和力最强，释放的结合能使放的结合能使反应活化能反应活化能降低，有利于降低，有利于S跨越能垒，使反应加速。跨越能垒，使反应加速。证明证明：人工合成了过渡态类似物；人工合成了过渡态类似物；用过渡态类似物制备出抗体酶。用过渡态类似物制备出抗体酶。酶的作用机制酶的作用机制五

25、五.使酶具高催化效率的因素：使酶具高催化效率的因素：1.邻近定向效应：邻近定向效应：S分子向分子向E活性中心靠近，且趋向活性中心靠近，且趋向E催化部位，催化部位，使活性中心这一局部区域使活性中心这一局部区域S增加，并增加，并使使S分子分子发生扭曲，易于断裂，降低反应所需活化能。发生扭曲，易于断裂，降低反应所需活化能。从而加快反应速度。从而加快反应速度。2.“张力张力”和和“形变形变”：lX衍射证实：衍射证实：E使使S分子中敏感键中某分子中敏感键中某些基团的电子密度些基团的电子密度变化，产生电子张变化，产生电子张力力，使其发生变形，使其发生变形，更易于断裂。更易于断裂。酶高效的因素酶高效的因素A

26、：S变形变形B：S和和E都变形都变形3.酸碱催化：酸碱催化：指指E分子上某分子上某些基团作为质些基团作为质子供体和质子子供体和质子受体对受体对S进行进行（广义的）酸（广义的）酸碱催化。碱催化。1、醛的水合作用2、肽的水解作用酶高效的因素酶高效的因素4.共价催化：共价催化：E分子中的亲核基团提分子中的亲核基团提供电子，供电子，对对S中亲电子中亲电子的碳原子进行攻击，的碳原子进行攻击，生成生成ES使反应活化能使反应活化能降低降低，S可越过较低的可越过较低的能垒而形成产物。能垒而形成产物。酶高效的因素酶高效的因素酶促反应动力学酶促反应动力学一：酶活力的测定：一：酶活力的测定：1.酶活力（酶活性酶活力

27、（酶活性enzymeactivity):：指酶催化一定化学反应的能力。指酶催化一定化学反应的能力。用酶所催化的某一用酶所催化的某一化学反应速度化学反应速度的快的快慢来表示酶的含量和存在。慢来表示酶的含量和存在。酶促反应速度的测定：酶促反应速度的测定：（1）测定单位时间底物的消耗量）测定单位时间底物的消耗量（2）测定单位时间产物的生成量）测定单位时间产物的生成量2.表示方法：表示方法：（1）、酶活力单位）、酶活力单位（activeunit,U，I.U）：）：特定条件下（特定条件下（25），在），在1分钟内能转分钟内能转化化1微摩尔底物的酶量。微摩尔底物的酶量。（2）、酶的转换）、酶的转换数（数（

28、katal，kat）：）：在最适条件下（在最适条件下（30）,每秒钟可使每秒钟可使1mol底物转化的酶量。底物转化的酶量。1kat=6107I.U酶促反应动力学酶促反应动力学（3）、酶的比活力）、酶的比活力：指每指每mg酶蛋白所具有的酶活力，一般用酶蛋白所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白表示。蛋白表示。（4）、）、用反应用反应初速度初速度（v）来表示来表示：l测单位时间内、单测单位时间内、单位体积中底物减少位体积中底物减少或产物增加量来表示或产物增加量来表示浓度浓度/单位时间单位时间.酶促反应动力学酶促反应动力学二、影响酶促反应速度的因素二、影响酶促反应速度的因素酶促反应动力学酶促反应动力学是

29、研究酶促反应的速是研究酶促反应的速度及影响此速度的各种因素的科学。度及影响此速度的各种因素的科学。1.酶浓度对酶作用的影响酶浓度对酶作用的影响在底物足够过量，不含抑制酶活性的在底物足够过量，不含抑制酶活性的物质及其他不利于酶发挥作用的因素物质及其他不利于酶发挥作用的因素时时V=kE 酶促反应动力学酶促反应动力学（二）酶浓度对酶作用的影响二）酶浓度对酶作用的影响在有足够底物足够底物和其他条件不变的情况下：v=k E 本人认为不完善本人认为不完善 v0=k E原因：原因：1.逆反应速度增加逆反应速度增加2.底物底物浓度下降浓度下降3.酶会因环境因素的影响而失活酶会因环境因素的影响而失活4.产物成为

30、酶的产物成为酶的抑制剂抑制剂2 底物浓度对酶作用的影响底物浓度对酶作用的影响SvVmax一级反应 v=k S零级反应 v=k E米氏方程米氏方程 Michaelis&Menten根据中间产物根据中间产物学说推导出表示酶促反应中底物学说推导出表示酶促反应中底物浓度与反应速度关系的公式称浓度与反应速度关系的公式称。米氏方程：米氏方程：Km+SVS=酶促反应动力学酶促反应动力学米氏方程的推导：米氏方程的推导：根据中间产物学说：根据中间产物学说：式中K1,K2,K3分别为各反应常数，可知：ES形成速度=K1 E S ES分解速度=(K2,+K3)ES当反应达恒稳态时,二速度相等,即:K1 E S=(K

31、2,+K3)ESS+E ES E+PK1K2K3酶促反应动力学酶促反应动力学整理并令：由于E 与ES之和为总的酶浓度Et,即:Et=E+ES E=EtES将代入:ESK1=E S (K2,+K3)KmES=(EtES)SKm酶促反应动力学酶促反应动力学整理得:酶促反应速度由ES决定,而=K3 ES ES=将代入整理得:ES=EtSKm+SK3=EtSKm+SK3此时达到最大反应速度Vmax:Vmax=K3 Et 将代入,得米氏方程:当S 升高,所有E为S所饱和时,即:Et=ES=SKm+SVmax酶促反应动力学酶促反应动力学米氏方程的变化：米氏方程的变化：a、KmS时时：=VS/Km初速度与初

32、速度与S成正比成正比的一级反应。的一级反应。b、若若SKm时时：=V零级反应零级反应c、若若S=Km时时：=1/2V酶反应速度与酶反应速度与S的关系的关系米氏常数米氏常数Km的意义的意义a、概念概念：反应速度为最大反应速度一半时的底反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度物浓度。b、单位单位：mol/L或或mmol/Lc、意义意义：Km是酶的特征性物理常数。是酶的特征性物理常数。只只与与E性质有关，与性质有关，与E无关；无关；测测Km可鉴别酶。可鉴别酶。在一定条件下某酶对某一底物有一定在一定条件下某酶对某一底物有一定的的Km值。值。因此，测某酶的因此，测某酶的Km数值，可鉴别酶数值，可鉴别酶。酶

33、促反应动力学酶促反应动力学同一同一E有几个有几个S就有几个就有几个Km，Km最小的为最最小的为最适适S或天然或天然S。Km大，大，E与与S亲和力弱；亲和力弱；Km小，小，E与与S亲和力强亲和力强。d、实际用途：实际用途：1）可由所要求的）可由所要求的V求求S；例：求反应速度达最大反应速度例：求反应速度达最大反应速度99%时的底物浓时的底物浓度度2）根据已知）根据已知S求该反应求该反应V。99%V=VSKm+S=S99Km酶促反应动力学酶促反应动力学测米氏常数的方法：测米氏常数的方法：将米氏方程两侧取倒数，以将米氏方程两侧取倒数，以1/对对1/S作图得直线作图得直线,得得Lineweaver-B

34、urk方程：方程：Lineweaver-Burk作图法作图法（双倒数作图法）（双倒数作图法）Km求法求法:1、量截距；、量截距；2、量一个截距求斜率、量一个截距求斜率酶促反应动力学酶促反应动力学3.温度对酶作用的影响温度对酶作用的影响l在一定范围内（在一定范围内（0-40）E活性随温度上升而加快；活性随温度上升而加快；l温度达到一定高度（温度达到一定高度（60以上）以上）E活性不再增高，活性不再增高，反而下降。反而下降。酶的影响因素酶的影响因素(1)、酶促反应最适温度：、酶促反应最适温度：酶促反应速度达到最大时的温度。酶促反应速度达到最大时的温度。因因E种、种、E源不同而异。源不同而异。(2)

35、、温度影响酶促反应的机理：、温度影响酶促反应的机理：1）低于低于最适温度：反应最适温度：反应速度随温度上升速度随温度上升而而加快；加快；2）高于高于最适温度：最适温度：E蛋白蛋白随温度上升而变随温度上升而变性失活。性失活。酶的影响因素酶的影响因素l例例1、蔬菜干制蔬菜干制(霸王花、黄花菜霸王花、黄花菜)l酶促褐变条件：酚酶、酚类底物、酶促褐变条件：酚酶、酚类底物、O2l例例2、加工豆奶加工豆奶l豆腥味产生条件：脂氧化酶、油脂、豆腥味产生条件：脂氧化酶、油脂、O2l例例3、加工绿茶加工绿茶l工艺：鲜叶工艺：鲜叶杀青杀青揉捻揉捻干燥干燥l红红茶茶加加工工工工艺艺：鲜鲜叶叶萎萎雕雕揉揉捻捻发发酵酵干

36、燥干燥4.pH对酶作用的影响对酶作用的影响(1)、最适、最适pH：超出则酶活下降。超出则酶活下降。植物、微生物：植物、微生物：最最适适pH：4-6.5；动物动物：最适最适pH：6.5-8l为酶特性之一、受各种为酶特性之一、受各种因素影响。因素影响。酶的影响因素酶的影响因素(2)、pH影响的机理：影响的机理：1）pH影响影响E活性中心及附近有关基团的解活性中心及附近有关基团的解离离，使之，使之易易或或不易不易与与S结合；结合；2）pH影响影响S的极性基团的极性基团，从而影响这些基，从而影响这些基团与团与E的结合；的结合；3）过酸、过碱可）过酸、过碱可使酶变性失活使酶变性失活。酶的影响因素酶的影响

37、因素5.激活剂对酶作用的影响激活剂对酶作用的影响(1)、概念、概念：凡能提高酶活力的物质称激活剂。凡能提高酶活力的物质称激活剂。(2)、种类：、种类：1）无机离子的激活作用：）无机离子的激活作用：作为作为活性部位的组分活性部位的组分；作为作为辅助因子的组分辅助因子的组分；由由无机离子无机离子与与E、S或或ES结合引起。结合引起。如如：Mg2+、Ca2+、Co2+、Mn2+等。等。酶的影响因素酶的影响因素2）中等大小的有机分子）中等大小的有机分子：包括还原剂（使二硫键还原）、包括还原剂（使二硫键还原）、EDTA（去除重金属杂质）等。去除重金属杂质）等。3）蛋白质类大分子物质：）蛋白质类大分子物质

38、：激活酶原激活酶原、解除抑制剂的抑制作用解除抑制剂的抑制作用。如：如：pr与重金属离子结合，解除抑制剂的与重金属离子结合，解除抑制剂的抑制。抑制。酶的影响因素酶的影响因素6.抑制剂抑制剂(1)、概念：、概念：l抑制剂（抑制剂（inhibitor,I)：凡与凡与E结合后，结合后，使使E的活性部位结构和的活性部位结构和性质改变而引起性质改变而引起E活性降低或丧失的物活性降低或丧失的物质，叫质，叫。l抑制作用抑制作用(inhibition)：任何任何使使E活性降低或丧失的作用统称为活性降低或丧失的作用统称为.酶的影响因素酶的影响因素(2)、抑制作用的类型：、抑制作用的类型：1）不可逆抑制：）不可逆抑

39、制：通常通常I以较牢固的共价键以较牢固的共价键与与E蛋白中的基蛋白中的基团结合团结合，引起，引起E失活。失活。l透析、超滤不能除去透析、超滤不能除去I。酶的影响因素酶的影响因素不可逆抑制剂不可逆抑制剂：l有机磷、烷化剂：作用于有机磷、烷化剂：作用于Ser、Thr的的-OH；如：有机磷农药、二战毒气等作用于催如：有机磷农药、二战毒气等作用于催化乙酰胆碱水解的胆碱酯酶，引起化乙酰胆碱水解的胆碱酯酶，引起一系列神经中毒症状；一系列神经中毒症状；临床用羟肟酸缓解症状。临床用羟肟酸缓解症状。常用农药常用农药:有机磷农药、有机氯农药、有机汞农药有机磷农药、有机氯农药、有机汞农药抗菌素抗菌素:酶的影响因素酶

40、的影响因素2）可逆抑制：可逆抑制：lI与与E的结合往往是非共价键结合的结合往往是非共价键结合，是可，是可逆结合，可用透析法除去逆结合，可用透析法除去I。l可逆抑制根据可逆抑制根据I与与S的关系分三类：的关系分三类：竞争性抑制：竞争性抑制：非竞争性抑制：非竞争性抑制：反竞争性抑制：反竞争性抑制：酶的影响因素酶的影响因素竞争性抑制：竞争性抑制：I在在分子结构分子结构上与上与S类似类似，I与与S竞争性竞争性与与E结合，使酶促反应速度下降。结合，使酶促反应速度下降。但，但，若若S高，则此效应减小高，则此效应减小。酶的影响因素酶的影响因素反应通式：反应通式：E+SSEE+P+IEI特点特点：I与与S结构

41、类似；抑制程度取决于结构类似；抑制程度取决于I和和S以及以及与与E的亲和力；可通过增加的亲和力；可通过增加S来减轻或解除抑制。来减轻或解除抑制。竞争性抑制机理：竞争性抑制机理：lI占了占了S的位子；的位子；lE与与I或或S结合后构结合后构象发生变化，象发生变化，l产生不利于另一个产生不利于另一个结合的构象。结合的构象。应用：应用：药物设计的依据。药物设计的依据。如磺胺、如磺胺、对氨基苯甲酸(PABA)对氨基苯磺酰胺非竞争性抑制：非竞争性抑制：lS与与I可可同时结合同时结合在在酶的不同部位上，酶的不同部位上，形成形成ESI，因此酶因此酶活性降低。活性降低。l此类此类I与与E活性中活性中心以外的基

42、团结合，心以外的基团结合，其结构可能与其结构可能与S无无关。关。酶的影响因素酶的影响因素特点：特点：通过通过I与与E的结合，的结合，l改变酶结构和性质；改变酶结构和性质；lVmax减小；减小；l抑制取决于抑制取决于I。非竞争抑制的通式反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用：抑制剂必须在酶与底物结抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成合后才能进一步形成ESI复合物。复合物。S+EESE+P+IESIE+Pv=V1+I ki Skm1+Iki+SSvkmkm三者动力学区别三者动力学区别l竞争性抑制竞争性抑制：Vmax不变不变；Km增大，增大，增加增加S可克服。可克服。l非竞争性抑制：非竞争性抑制：Km

43、 不变；不变；Vmax减小，减小，增加增加S不可克服。不可克服。反竞争性抑制反竞争性抑制:Vmax减小减小;Km减小减小7.别构效应别构效应(1)、概念：、概念：亦称亦称变构酶变构酶，是一类重，是一类重要的调节酶。要的调节酶。一般为寡聚酶（两个以一般为寡聚酶（两个以上亚基组成），易发生构上亚基组成），易发生构象改变。其上有二个重要象改变。其上有二个重要部位：部位：活性部位活性部位和和别构部位别构部位Asp转氨甲酰酶(2)别构酶结构的部位别构酶结构的部位1）活性部位：）活性部位：负责负责E对对S的结合与的结合与催化；催化；2）别构部位：）别构部位：可结合调节物，负可结合调节物，负责调节酶反应速度

44、责调节酶反应速度。这两部位可在不同亚基这两部位可在不同亚基或同一亚基不同部位上或同一亚基不同部位上。酶活性的调节酶活性的调节(3)、别构效应：、别构效应：1）概念：）概念：当当S或或S以外的物质与以外的物质与E的别构部位非共价的别构部位非共价结合后，通过结合后，通过E分子构象的变化影响分子构象的变化影响E催化催化活性的效应称活性的效应称。酶活性的调节酶活性的调节2）别构效应剂：）别构效应剂：引起别构效应的物质。分两种：引起别构效应的物质。分两种：l别构激活剂别构激活剂：正协同，加快反应速度的，多正协同，加快反应速度的，多为为S。如：如：ATP对对ATCase(天冬氨酸转氨甲酰酶天冬氨酸转氨甲酰

45、酶)。l别构抑制剂：别构抑制剂：负协同，减慢反应速度，多为代谢终产物。负协同，减慢反应速度，多为代谢终产物。如如：CTP对对ATCase。酶活性的调节酶活性的调节别构酶通常为代谢途径第一个酶别构酶通常为代谢途径第一个酶或分支点上第一个或分支点上第一个酶酶。3、别构酶动力学曲线：大多数别构酶不大多数别构酶不符合米氏方程。符合米氏方程。1、非调节酶曲线、非调节酶曲线2、正协同别构酶、正协同别构酶3、负协同别构酶、负协同别构酶曲线2中S的变化所引起的速度变化的反应几乎是“全”或“无”酶的应用与发展酶的应用与发展l分离纯化分离纯化l酶的应用酶的应用一、酶的分离纯化一、酶的分离纯化（一）目的：（一）目的

46、：1、为了研究酶的理化性质或鉴定酶；、为了研究酶的理化性质或鉴定酶；2、作为生化试剂或药物。、作为生化试剂或药物。（二）根据酶在体内作用的部位分：（二）根据酶在体内作用的部位分：胞外酶、胞内酶；胞外酶、胞内酶；（三）步骤：（三）步骤：选材选材破碎破碎抽提抽提分离纯化分离纯化保存保存酶酶在在细胞中的分布：胞中的分布：胞胞外外酶酶：水水解解酶酶类，易易收收集集，不不必必破破碎碎细胞胞，缓冲冲液液或或水水浸浸泡泡细胞胞或或发酵酵液液离离心心得得到到上上清清液液即即为含含酶酶液。液。胞内酶：除水解酶类外的其它酶类，需破碎胞内酶：除水解酶类外的其它酶类，需破碎细胞，不同的酶分布部位不同，最好先将酶存细胞

47、，不同的酶分布部位不同，最好先将酶存在的细胞器分离后再破碎该细胞器，然后将酶在的细胞器分离后再破碎该细胞器，然后将酶用适当的缓冲溶液或水抽提。用适当的缓冲溶液或水抽提。原原则：在在增增加加酶酶得得率率和和纯度度的的同同时，尽尽可可能能避避免免高高温温、过酸酸、过碱碱、剧烈烈的的震震荡及及其其它它可可能能使使酶酶丧失失活活力力的的一一切切操操作作过程。程。尽最大可能保存尽最大可能保存酶酶的活力。的活力。分离提分离提纯：1.1.酶酶的抽提：将的抽提：将酶酶溶解出来就称溶解出来就称为抽提。抽提。胞胞外外酶酶：固固体体培培养养的的菌菌体体加加水水或或适适当当缓冲冲溶溶液液浸浸泡泡过滤即即可可。液液体体

48、培培养养的的菌菌体体将将发酵酵液液离离心心分分离离除除去去菌菌体体收收集集离离心心液液即即可。可。胞内酶：先破碎细胞，再用水或适当的缓冲溶液抽提。胞内酶：先破碎细胞，再用水或适当的缓冲溶液抽提。2.2.酶酶的的纯化：化：纯化化的的关关键是是维持持酶酶的的活活性性，因因为随随着着酶酶的的逐逐渐提提纯，一一些些天天然然的的可可保保持持酶酶活活力力的的其其它它成成分分逐逐渐减减少少，酶酶的的稳定定性性变差差，所所以以整个整个纯化化过程程应维持低温。持低温。（1 1）酶酶的沉淀方法：与蛋白的沉淀方法：与蛋白质的沉淀方法相同，常用：的沉淀方法相同，常用：A A盐析法：常用硫酸析法：常用硫酸铵盐析，有分段

49、析，有分段盐析和一次性析和一次性盐析两种方法。析两种方法。B B有有机机溶溶剂沉沉淀淀法法：用用乙乙醇醇、丙丙酮等等。应低低温温操操作作，溶溶剂少少量量分分批加入。批加入。（2 2）酶酶的的纯化方法：化方法：有吸附有吸附层析、离子交析、离子交换层析、凝胶析、凝胶过滤层析、析、亲和和层析等。析等。3.3.酶酶的的结晶：晶：纯化以后的化以后的酶酶液再次沉淀，仍采用沉淀法。液再次沉淀，仍采用沉淀法。4.酶的保存：酶的保存：一般在一般在-20以下低温保存。以下低温保存。注意：注意：l低温；低温；0-5，有机溶剂在，有机溶剂在-15-20；l加加EDTA，防止金属离子使酶失活；防止金属离子使酶失活；l加

50、巯基乙醇，避免酶蛋白巯基氧化失活；加巯基乙醇，避免酶蛋白巯基氧化失活；l不要过度搅拌。应常测酶活。不要过度搅拌。应常测酶活。酶的分离纯化酶的分离纯化酶的分离纯化酶的分离纯化酶的应用酶的应用工业上酶应用的优点：工业上酶应用的优点：1.专一性高，副反应很少，后处理容易。专一性高，副反应很少，后处理容易。2.催化效率高，酶用量少。催化效率高，酶用量少。3.反应条件温和，可以在近中性的水溶液中进行反应。反应条件温和，可以在近中性的水溶液中进行反应。4.4.酶的催化活性可以进行人工控制。酶的催化活性可以进行人工控制。5.缺点：缺点：1.酶易失活，酶反应的温度、酶易失活，酶反应的温度、PH、离子强度等离子

51、强度等要很好控制。要很好控制。6.2.酶不易得到，价格昂贵。酶不易得到，价格昂贵。7.3.酶不易保存。酶不易保存。l1 1、酶在工业中的应用不断扩大。、酶在工业中的应用不断扩大。l酶在食品工业的应用：酶在食品工业的应用：l1)1)、酿造米酒、酿造米酒 浸米浸米蒸饭蒸饭拌曲拌曲装缸装缸糖化发酵糖化发酵压榨压榨成品成品l l 酒曲酒曲l2)2)、果葡糖浆酶法生产：、果葡糖浆酶法生产：l 液化酶液化酶 糖化酶糖化酶 葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶 l 淀粉乳淀粉乳-糊精糊精-葡萄糖葡萄糖-果葡糖浆果葡糖浆l3)3)、果汁澄清：、果汁澄清：l 果胶酶果胶酶l 果汁果汁-澄清果汁澄清果汁l酶在轻工、化工领域的

52、应用：酶在轻工、化工领域的应用：l1)1)、蛋白酶用于皮革工业的脱毛。、蛋白酶用于皮革工业的脱毛。l2)2)、-淀粉酶、纤维素酶用了牛仔服的生产。淀粉酶、纤维素酶用了牛仔服的生产。l3)3)、碱性蛋白酶、碱性脂肪酶应用于洗涤剂的生产。、碱性蛋白酶、碱性脂肪酶应用于洗涤剂的生产。l2 2、酶在医学中应用、酶在医学中应用l1)1)、酶在疾病诊断中的地位越来越重要。、酶在疾病诊断中的地位越来越重要。l2)2)、酶作为治疗疾病的药物在临床上的应用不断扩大。、酶作为治疗疾病的药物在临床上的应用不断扩大。l 某些作为药物使用的酶某些作为药物使用的酶l 酶酶 临床应用临床应用l 淀粉酶淀粉酶 治疗消化不良治

53、疗消化不良l 菠萝蛋白酶菠萝蛋白酶 治疗手术后的浮肿、炎症、伤口化脓、消化不良治疗手术后的浮肿、炎症、伤口化脓、消化不良l 尿激酶尿激酶 溶解血栓溶解血栓l 左旋糖酐酶左旋糖酐酶 预防龋齿预防龋齿l 天冬酰胺酶天冬酰胺酶 治辽癌症治辽癌症l3.3.工具酶在生物学研究中的应用工具酶在生物学研究中的应用l 利用酶的专一性催化作用，可以进行生物大分子的分析、改造和利用酶的专一性催化作用，可以进行生物大分子的分析、改造和l生物物质的处理。用于这样目的酶称为生物物质的处理。用于这样目的酶称为-工具酶工具酶工具酶工具酶。l例如：各种例如：各种 蛋白酶蛋白酶 已用于蛋白质分子的一级结构分析。已用于蛋白质分子

54、的一级结构分析。l DNADNA聚合酶聚合酶 已用于已用于DNADNA一级传结构分析。一级传结构分析。l 各种各种 DNADNA限制性内切酶限制性内切酶 能将地断裂能将地断裂DNADNA成为片断，这是基因工程能够实成为片断，这是基因工程能够实现的重要前提之一。现的重要前提之一。l 在处理细菌细胞时，可以用在处理细菌细胞时，可以用 溶菌酶、纤维素酶溶菌酶、纤维素酶 等破碎细胞。等破碎细胞。二、酶工程二、酶工程酶工程：酶工程：指酶制剂在工业上的大规模生产指酶制剂在工业上的大规模生产和应用。和应用。1、化学酶工程：、化学酶工程：由酶学与化学工程技术相结合而形成。由酶学与化学工程技术相结合而形成。通过

55、化学修饰、固定化处理、甚至化学通过化学修饰、固定化处理、甚至化学合成法等手段改善酶的性质，以提高催合成法等手段改善酶的性质，以提高催化效率及降低成本。化效率及降低成本。酶学发展及动向酶学发展及动向酶学发展及动向酶学发展及动向固定化酶固定化酶概念：概念：将分离纯化得到的水溶性酶用物理或化学将分离纯化得到的水溶性酶用物理或化学的方法处理，使酶与载体（琼脂糖、聚丙烯酰的方法处理，使酶与载体（琼脂糖、聚丙烯酰胺等）连接，作成具催化活性的水不溶的酶。胺等）连接，作成具催化活性的水不溶的酶。应用：应用：此技术可提高酶的稳定性和使用寿命；使此技术可提高酶的稳定性和使用寿命；使反应过程连续化、自动化，简化工艺

56、；提高产反应过程连续化、自动化，简化工艺；提高产品质量。品质量。此技术以广泛用于工农业生产、医药卫生、此技术以广泛用于工农业生产、医药卫生、环境保护、生物化工等方面。环境保护、生物化工等方面。酶学发展及动向酶学发展及动向酶学发展及动向酶学发展及动向l 某些作为药物使用的酶某些作为药物使用的酶l l固定化酶的优点固定化酶的优点：l1)1)、重复使用、重复使用l2)2)、不污染产物、不污染产物 l3)3)、有利于连续化和自动化生产、有利于连续化和自动化生产 l4)4)、节约能源和设备投资、节约能源和设备投资 l l缺点缺点：1)1)、酶经固定化后活力降低、酶经固定化后活力降低 2)2)、对、对大分

57、子底物和气体底物不利大分子底物和气体底物不利.l酶固定化方法：酶固定化方法：1)1)、吸附法、吸附法 2)2)、共价偶联、共价偶联法法 3)3)、包埋法、包埋法 4)4)、交联法固定化、交联法固定化l酶的应用：酶的应用：1)1)、固定化葡萄糖异构酶将葡萄糖转、固定化葡萄糖异构酶将葡萄糖转变为果糖变为果糖 l 2)2)、固定化木瓜蛋白酶澄清啤酒、固定化木瓜蛋白酶澄清啤酒2、生物酶工程：、生物酶工程：是在化学酶工程基础上发展起来的，是以酶学是在化学酶工程基础上发展起来的，是以酶学和和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。包括：结合的产物。包括：1）用）用DNA重组技术大量生产酶；重组技术大量生产酶；2）对酶基因进行修饰，产生突变酶；）对酶基因进行修饰，产生突变酶；3）设计新的酶基因，合成自然界不曾有过的、）设计新的酶基因，合成自然界不曾有过的、性能稳定、催化效率更高的新酶。性能稳定、催化效率更高的新酶。酶学发展及动向酶学发展及动向酶学发展及动向酶学发展及动向