第六章 质谱技术与质谱仪2

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1、第六章 质谱技术与质谱仪赵进郑州大学蛋白质组学技术平台一、概述1、质谱仪的发展史1912年:世界第一台质谱装置40年代:质谱仪用于同位素测定50年代：分析石油60年代：研究GC-MS联用技术70年代：计算机引入80年代：研究LC-MS联用技术90年代：研究蛋白质分析技术2、质谱的概念质谱分析法（MassSpectroscope,MS）是将化合物形成离子或碎片离子，按质荷比(m/e)的不同进行测定，从而进行成分分析和结构分析的一种方法。质谱（massspectrum，MS）是将带电原子、分子或分子碎片按其质量或质荷比（m/e）大小顺序排列而成的图谱。质谱仪（massspectrometer）是将

2、待测物样品在一定条件下转化成气态离子并通过质量分析器，按其质量或m/e大小顺序进行分离、记录的分析仪器。3、质谱的特点信息量大，应用范围广，是研究分子结构的有力工具。由于分子离子峰可以提供样品分子的相对分子量的信息，所以质谱法也是测定分子量的常用方法。分析速度快、灵敏度高、高分辨率的质谱仪可以提供分子或离子的精密测定。质谱仪器较为精密，价格昂贵，工作环境要求较高。二、质谱技术的基本原理1、进样化合物通过汽化引入离子化室；2、离子化在离子化室，组分分子被一束加速电子碰撞（能量约70eV），撞击使分子电离形成正离子；MM+e或与电子结合，形成负离子M+eM3、离子也可因撞击强烈而形成碎片离子：4、

3、荷电离子被加速电压加速，产生一定的速度v，与质量m、电荷e及加速电压V有关，其动能与加速电压及电荷遵循5、加速离子进入一个强度为H的磁场，发生偏转，半径为：将（1）（2）合并：因此，当 r为仪器设置不变时，改变加速电压或磁场强度，则不同m/e的离子依次通过狭缝到达检测器，形成质量谱，简称质谱。二、质谱仪的基本结构质谱仪的分类质谱的结构（一）真空系统为了保证离子源中灯丝的正常工作，保证离子在离子源和分析器正常运行，消减不必要的离子碰撞，散射效应，复合反应和离子-分子反应，减小本底与记忆效应,因此，质谱仪的离子源和分析器都必须处在高真空中才能工作，一般应在10-510-6Pa。一般真空系统由机械真

4、空泵和扩散泵或涡轮分子泵组成。（二）进样系统要求：高效重复的将样品引入到离子源中并且不能造成真空度的降低，而样品导入离子源的方式决定于样品的物理性质。方式：1.间歇式进样系统 2.直接进样系统 3.色谱进样系统（从HPLC、GC及CE）1.间歇式进样系统可用于气体、液体和中等蒸汽压的固体样品进样，通过可拆卸式的试样管将少量固体或液体试样引入试样储存器中。由于进样系统的低压强及储存器的加热装置，使试样保持气态。加之进样系统的压强比离子源的压强大，样品分子或离子可以通过分子漏隙以分子流的形式渗透进高真空的离子源。2.直接进样系统对那些在间歇式进样系统的条件下无法变成气体的固体、热敏性固体及非挥发性

5、液体试样，可直接引入到离子源中。通常将试样放入小杯中，通过真空闭锁装置将其引入离子源，可以对样品杯进行冷却或加热处理。3.色谱进样系统气相色谱-质谱联用仪 从毛细管气相色谱柱流出的成分可直接引入质谱仪的离子化室。液相色谱-质谱联用仪 采用离子喷雾及电喷雾技术除去流动相使样品离子进入质谱分析仪。对于蒸汽压低的样品进行衍生化后进样例如：葡萄糖变成三甲基硅醚的衍生物OCH2OHOHOHHOHOOCH2OSiMe3OSiMe3OSiMe3Me3SiOMe3SiOMe3SiCl（三）离子源 质谱仪中产生离子的装置称为离子源，其功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。不同的分子离子化所需要的能量不同

6、，因此，应选择不同的离解方式：硬电离：能给予样品较大能量的电离方法。软电离：给予较小能量的电离方法，适用于易破裂或易电离的样品。质谱研究中的几种离子源名称简称类型离子化试剂应用年代电子轰击离子化（ElextronBombIonization）EI气相高能电子1920化学电离（ChemicalIonization）CI气相试剂离子1965场电离（FieldIonization）FI气相高电势电极1970场解吸（FieldDesorption）FD解吸高电势电极1969快原子轰击（FastAtomBombandment）FAB解吸高能电子1981二次离子质谱（SecondaryIonMS）SIMS

7、解吸高能离子1977激光解析（LaserDesorption）LD解吸激光束1978电流体效应离子化(离子喷雾)（ElectrohydrodynamicIonization）EH解吸附高场1978热喷雾离子化（ThermosprayIonization）ES荷电微粒能量19851.电子轰击离子化（EI）电子轰击源是质谱通用型的电离源，硬电离方法，由此产生的图谱称为EI-MS。灯丝与接收极之间的电压为70伏，发射出能量为70eV的高能电子束，撞击来自进样系统的以气体形式进入离子源的样品分子，使样品分子电离，产生正离子，获得加速，经过狭缝进一步准直后进入质量分析器。可在平行电子束的方向附加一弱磁场

8、，使可在平行电子束的方向附加一弱磁场，使电子沿螺旋轨道前进，增加碰撞机会，提电子沿螺旋轨道前进，增加碰撞机会，提高灵敏度。高灵敏度。当电离源有足够的能量使带有较大内能时，可能进一步发生键的断裂，形成大量的各种低质量数的碎片正离子和自由基或中性分子。由分子离子可以确定化合物分子由分子离子可以确定化合物分子量量,由碎片离子可以得到化合物由碎片离子可以得到化合物的结构。的结构。在电子轰击下，样品分子可能有四种不同途径形成离子：（1）样品分子被打掉一个电子形成分子离子；（2）分子离子进一步发生化学键断裂形成碎片离子；（3）分子离子发生结构重排形成重排离子；（4）通过分子离子反应生成加合离子；（5）同位

9、素离子特点：v碎片离子多，结构信息丰富，有标准化合物质谱库；v不能汽化的样品不能分析，主要用于挥发性和分子量较小样品的电离；v有些样品得不到分子离子。2.化学电离（CI）结构与EI同，但是在离子化室充CH4，电子首先将CH4离解，其电离过程如下：CH4+eCH4+2eCH4+CH4CH5+CH3生成的气体离子再与样品分子M反应：CH5+MCH4+MH+通过离子-分子反应的软离子化技术。特点：v得到一系列准分子离子（M+1）+，（M-1）+，（M+2）+等等；vCI源的的碎片离子峰少，图谱简单，易于解释；v不适于难挥发成分的分析。3.场电离（FI）FI是利用强电场诱发样品分子的电离，属于软电离。

10、最重要的部件是电极，正负极间施加高达10KV的电压差，两极的电压梯度可达107108Vcm-1。若具有较大偶极矩或高极化率的样品分子通过两极间时，受到极大的电压梯度的作用（量子隧道效应）而发生电离。特点：分子离子峰（或准分子离子峰）强度较大，而碎片离子峰很少；图谱较简单。+气体分子气体分子试样分子试样分子+准分子离子准分子离子电子电子(M+1)+、(M+17)+、(M+29)+4.场解吸电离法（FD）与FI类似的有场解吸源，它把样品溶液置于阳极发射器的表面，并将溶剂蒸发除去，在强电场中，样品离子直接从固体表面解吸并奔向阴极。FD是一种软电离技术。特点：一般只产生分子离子峰和准分子离子峰，碎片离

11、子峰极少，图谱很简单；特别适用于热不稳定性和非挥发性化合物的质谱分析。5.快原子轰击电离法（FAB）为了获得高动能，首先让稀有气体原子电离，并通过电场加速，然后再与热的气体原子碰撞而导致电荷和能量的转移，获得快速运动的原子，它们撞击涂有样品的金属极，通过能量转移而使样品分子电离，生成二次离子。通常将样品溶于惰性的非挥发性溶剂，并以单分子层覆盖于探针表面，以提高电离效率，而悬浮样品不适用。属于软电离，一般用作磁式质谱的离子源。特点：分子离子或准分子离子峰强；碎片离子也丰富；适合于热不稳定、难挥发的样品，如肽类；其缺点是溶解样品的溶剂也会被电离而使图谱复杂化。（四）质量分析器质谱仪的质量分析器位于

12、离子源和检测器之间，依据不同的方式将样品离子按质荷比分开。1单聚焦分析器（singlefocusingmassanalyzer）2双聚焦分析器（doublefocusingmassanalyzer）3飞行时间分析器(timeofflight）4四极杆滤质器(quadrupolemassfilter)5离子阱分析器(Iontrap)1.单聚焦质量分析器 结构：扇形磁场（可以是1809060等）。离子束经加速后飞入磁极间的弯曲后区，飞行轨道在磁场的作用下发生偏转，分离开的离子信号由检测器检出。设质量为m，带有电荷为e的正离子，若其初始能量为0，在离子室中受到加速电压V的作用，到达离子室的出口狭缝即

13、分析器的进口狭缝S1，离子具有的动能为:当离子进入分析器的磁场后，受到洛伦兹力的作用而作半径为R的圆周运动，圆周运动的离心力要与洛伦兹力平衡，即：合并以上两式，得到:式中H为磁分析器的磁场强度 正离子的电荷数用Z表示，的相对质量单位数用M表示，H的单位为高斯（1高斯=10-4特），V的单位为伏特，R的单位为cmV可见，R取决与 M/Z、H、V，若仪器的H、V一定，则 ，Z一般为1，所以 ，表明磁分析器可以把不同质量的离子分离开，这叫做质量色散，而对于相同质量、以不同方向进入扇形磁分析器的离子有会聚作用，起到了方向聚焦的作用，而且仅有方向聚焦，故称为单聚焦质量分析器。对于一定的质谱仪器来说，离子

14、源的出口狭缝S1及分析器出口狭缝S2的位置是固定的，离子收集器（检测器）的位置也是固定的，表明R是一定的。进行质谱分析是可以用固定的加速电压V而连续改变磁场强度H或固定H连续改变V，使不同的离子依次通过S2到达检测器，而获得质谱图。前者称为磁场扫描，后者称为电压扫描。特点单聚焦分析结构简单，操作方便但其分辨率很低。不能满足有机物分析要求，目前只用于同位素质谱仪和气体质谱仪。单聚集质谱仪分辨率低的主要原因在于它不能克服离子初始能量分散对分辨率造成的影响。2.双聚焦质量分析器在单聚焦分析器中，离子源产生的离子在进入加速电场之前，其初始能量并不为零，且各不相同，表明离子源中的离子有一定的能量分散。为

15、了消除离子能量分散对分辨率的影响，通常在扇形磁场前加一扇形电场。质量相同而能量不同的离子经过静电电场后会彼此分开。即静电场有能量色散作用。如果设法使静电场的能量色散作用和磁场的能量色散作用大小相等方向相反，就可以消除能量分散对分辨率的影响。只要是质量相同的离子，经过电场和磁场后可以会聚在一起。另外质量的离子会聚在另一点。改变离子加速电压可以实现质量扫描。这种由电场和磁场共同实现质量分离的分析器，同时具有方向聚焦和能量聚焦作用，叫双聚焦质量分析器。离子通过静电场分析器时，由于受此电场力的作用，会改变运动方向成曲线运动，其离心力等于电场作用力，即：式中Rc为离子在电场分析器的运动曲率半径，E为分析

16、器的电场强度。则 离子运动的轨道半径可以通过外加静电场加以控制。只有能动相同的离子才能通过中间狭缝，实现能量聚焦，然后再进行方向聚焦。特点双聚焦质量分析器的最大优点是大大提高了仪器的分辨率。但仪器昂贵，调整、操作、维护均较为困难。3.飞行时间质量分析器（TOF）TOF是一种无磁动态质量分析器，根据不同质荷比的离子在无场分离区中的速度不同，引起漂移时间的差异而实现分离。TOF有直线型或反射型等不同方式。TOF的主要部分是一个离子漂移管。样品受到阴极灯丝发出的电子轰击后变成离子，栅极G1上的负脉冲将离子引出离子室，G1，G2间的直流电压差使离子受到加速并进入无场漂移管，最终按质荷比值不同先后到达离

17、子接收极。1-电离室；2-电子接收极；3-阴极；4-离子接收极 离子在加速电压V作用下得到动能，则有：1/2mv2=eV或v=(2eV/m)1/2离子以速度v进入自由空间（漂移区），假定离子在漂移区飞行的时间为T，漂移区长度为L，则：T=L/v=L(m/2eV)1/2对于具有不同m/e的离子，在飞行管中的飞行时间差为：可见t取决于不同离子的m/e平方根之差，对于能量相同的离子，离子的质量越大，达到接收器所用的时间越长，质量越小，所用时间越短，根据这一原理，可以把不同质量的离子分开。适当增加漂移管的长度可以增加分辨率。分辨率低时间分散空间分散能量分散分子离子目前，采用离子延迟引出技术和离子反射技

18、术，可以在很大程度上克服上述3个原因造成的分辨率下降。通过离子反射技术，质量相同能量不同的离子进入反射器后，能量大的离子速度快，但走的距离远，能量小的离子速度慢，但走的距离近，经过反射后，二者同时到达检测器，这样就消除了由于能量分散造成的分辨率降低。TOF-MS特点仪器结构简单,不需要磁场、电场等；扫描速度快，可在10-5s内观察到整段图谱；无聚焦狭缝，灵敏度很高；可用于大分子的分析（几十万原子量单位），在生命科学中用途很广。4.四极杆滤质器也称四级杆质量分析器，是一种非磁性结构的动态质量分析器。由四根截面为双曲面或圆形的棒状电极组成，两组电极间施加一定的直流电压和频率为射频范围的交流电压。相

19、对两根电极间加有电压（Vdc+Vrf），另外两根电极间加有-（Vdc+Vrf）（直流电压Vdc，射频电压Vrf或V0cost），即加在两对极杆之间的总电压为（Vdc+Vrf）。在四极之间的空间处于射频调制的直流电压的两种力作用下的射频场中，离子进入此射频场时，只有合适的离子才能通过稳定的振荡穿过电极间隙而进入检测器。在一定的（Vdc/Vrf)下，改变Vrf可实现扫描。特点无磁分析器；体积小，重量轻；操作方便，扫描速度快；分辨率较高；适用于色谱质谱联用仪器；准确度和精密度低于磁偏转型质量分析器。5.离子阱检测器（ITD）ITD是一种通过电场或磁场将气相离子控制并贮存一段时间的装置。离子阱的主体是

20、一个环电极和上下两端盖电极，环电极和上下两端盖电极都是绕Z轴旋转的双曲面，并满足r02=2Z02。直流电压U和射频电压Vrf加在环电极和端盖电极之间，两端盖电极都处于地电位。在稳定区内的离子，轨道振幅保持一定大小，可以长时间留在阱内，不稳定区的离子振幅很快增长，撞击到电极而消失。对于一定质量的离子，在一定的U和Vrf下，可以处在稳定区。改变U或Vrf的值，离子可能处于非稳定区。如果在引出电极上加负电压，可以将离子从阱内引出，由电子倍增器检测。因此，离子阱的质量扫描方式与四极杆类似，是在恒定的U/Vrf下，扫描Vrf获取质谱。特点结构小巧，质量轻；灵敏度高；而且还有多级质谱功能；它可以用于 GC

21、-MS，也可以用于 LC-MS。（五）检测与记录电子倍增器是现代质谱仪广泛使用的检测装置。一般具有1020个电极（铍铜合金或其他材料）。电子倍增器响应快，灵敏度高。随着使用时间的延长，电极会老化，增益会降低，具有一定的寿命。近代质谱仪中常采用隧道电子倍增器，其工作原理与电子倍增器相似，因为体积小，多个隧道电子倍增器可以串列起来，用于同时检测多个m/z不同的离子，从而大大提高分析效率。质谱仪常用的检测器还有闪烁检测器、法拉第杯和照相底板等。记录对信号的记录可采用一组检流计检出，或用紫外记录仪记录到光敏记录纸上。现代质谱仪一般都配有高性能计算机，应用功能强大的操作软件，设置仪器工作参数，采集和处理

22、数据，打印出报告。四、质谱仪主要性能指标灵敏度(sensitivity)分辨率(resolution)质量范围(mass range)质量范围质谱仪的质量测量范围表示质谱仪所能够进行分析的样品的相对原子质量（或相对分子质量）范围，通常采用以12C来定义的原子质量单位来量度。在非精确测定质量的场合中，常采用原子核中所含质子和中子的总数即“质量数”来表示质量的大小，其数值等于相对质量数的整数。气体质谱仪：2100u，有机质谱仪：几十几千分辨率指质谱仪能分辨相邻两个最小质量差的质谱峰的能力，常用R表示。一般定义是：对两个相等强度的相邻峰，当两峰间的峰谷不大于其峰高10%时，则认为两峰已经分开，其分辨

23、率：其中m1、m2为质量数，故在两峰质量较小时，要求仪器分辨率越大。灵敏度质谱仪的灵敏度有绝对灵敏度、相对灵敏度和分析灵敏度等几种表示方法。绝对灵敏度是指仪器可以检测到的最小样品量；相对灵敏度是指仪器可以同时检测的大组分与小组分含量之比；分析灵敏度则是指输入仪器的样品量与仪器输出的信号之比。五、质谱图及其判读（一）质谱的表示法质谱表：将质荷比和其相对强度以表的形式表示，以多巴胺的质谱表为例质谱图：横坐标为质荷比；纵坐标为离子的相对丰度，又称相对强度。质谱中的最强峰的高度定为100%，其它峰的强度就以该峰为基准。这个最强峰又称基峰。（二）质谱峰类型 质谱信号十分丰富。分子在离子源中可以产生各种电

24、离，即同一种分子可以产生多种离子峰，其中比较主要的有分子离子峰、同位素离子峰、碎片离子峰、重排离子峰、亚稳离子峰等。1.分子离子峰 试样分子在高能电子撞击下产生正离子，即：MeM+2e M+称为分子离子或母离子(parrent ion）。分子离子是分子失去一个电子所得到的离子，所以其数值等于化合物的相对分子量，是所有离子峰中m/e最大的（除了同位素离子峰外），所以若质谱图中如有分子离子峰出现，必位于谱的最右边，这在谱图中具有特殊意义。同时分子离子必然符合“氮律”。分子量“氮律”：分子中若含有偶数个氮原子，则相对分子质量将是偶数；反之，将是奇数。2.碎片离子分子离子产生后可能具有较高的能量，将会

25、通过进一步碎裂或重然而释放能量，碎裂后产生的离子形成的峰称为碎片离子峰。通过各种碎片离子相对峰高的分析，有可能获得整个分子结构的信息。（1）游离基引发的断裂（断裂）（2）正电荷引发的断裂（诱导断裂或i断裂）（3）断裂 与碎片离子相关的符号和缩写游离基引发的断裂（断裂）在奇电子离子中，定域的自由基位置（即游离基中心）由于有强烈的电子配对倾向，它即提供了孤电子与毗邻（位）的原子形成新的键，导致-原子另一端的键断裂。这种断裂通常称为断裂。该键断裂时，两个碎片各得一个电子，因此是均裂，产生一个偶电子离子和一个自由基。其通式可表达为：.烯烃：电离时失去一个电子，则键上的自由基中心引发断裂。如果是端烯则发

26、生烯丙基断裂，形成稳定的典型烯丙基离子含饱和官能团的化合物：如胺、醇、醚、硫醇、硫醚、卤代物等。电离后构成杂原子上的自由基中心，引发了断裂。举例正电荷引发的断裂（诱导断裂或i断裂）在奇电子（OE）或偶电子（EE）离子中，由于正电荷的诱导效应，吸引了邻键上的一对成键电子而导致该键的断裂，称为诱导断裂。此时，断裂键的一对电子同时转移到一个碎片上，因此属于“异裂”，可表达为：一般情况下，电负性强的元素诱导力也强。在有些情况下，诱导断裂和断裂同时存在，由于i断裂需要电荷转移，因此，i断裂不如断裂容易进行。表现在质谱中，相应断裂的离子峰强，i断裂产生的离子峰较弱。例如乙醚的断裂：断裂 如果化合物分子中具

27、有键，如烃类化合物，则会发生键断裂。键断裂需要的能量大，当化合物中没有电子和n电子时，键的断裂才可能成为主要的断裂方式。断裂后形成的产物越稳定，这样的断裂就越容易进行，阳碳离子的稳定性顺序为叔仲伯，因此，碳氢化合物最容易在分支处发生键的断裂。并且，失去最大烷基的断裂最容易进行。例如：正正己己烷烷3.同位素离子大多数元素都是由具有一定自然丰度的同位素组成。这些元素形成化合物后,其同位素就以一定的丰度出现在化合物中。化合物质谱中就会有不同同位素形成的离子峰,通常把由重同位素形成的离子峰叫同位素离子峰。在同位素离子中，可能是单一个同位素原子的离子，也可能是多种元素的同位素原子组合的离子，故其质量数可

28、能有M、M1、M2，M为最轻的同位素分子离子峰，其他碎片离子峰也是类似。以甲烷(CH4)为例：在甲烷的质谱图中可以观察到m/z=16的分子离子峰和 m/z=17、m/z=18即M+1和M+2由同位素贡献的同位素峰，M、M+1、M+2峰构成同位素簇。同样，碎片离子也存在同位素簇 某些常见元素的天然同位素丰度元素最大丰度同位素相对于最大丰度同位素为100的其他同位素的丰度氢1H2H0.016碳12C13C1.08氮14N15N0.37氧16O17O0.0418O0.20硫32S33S0.7834S4.40氯35Cl37Cl32.5溴79Br81Br98.0在一般有机分子鉴定时，可以通过同位素峰的统

29、计分布来确定其元素组成，分子离子的同位素离子峰相对强度之比总是符合统计规律的。例如，只含C、H、O、N化合物中，重同位素的丰度都较小，同位素峰很弱。其相对强度可按经验公式粗略估算：仅含C、H、O的化合物对于分子只含有同一种卤原子时，同位素离子强度之比，可用二项式展开式各项之比二项式展开式各项之比表示：(a+b)(a+b)n n 式中：a-某元素轻同位素的丰度；b-某元素重同位素的丰度；n-同位素个数。例如，某化合物分子中含有三个氯，其分子离子的三种同位素离子强度之比，由上式计算得：则n=3、a=3、b=1(a+b)3=a3+3a2b+3ab2+b3=27+27+9+1则M:M+2:M+4:M+

30、6 27:27:9:1 如果知道了同位素的元素个数，可以推测各同位素离子强度之比。同样，如果知道了各同位素离子强度之比，可以估计出元素的个数。同位素离子峰的强度比在推断化合物分子式时很有用处。4.重排离子在分子离子的裂解过程中，伴随着化学键断裂，还可能出现原子或原子团的重排，产生比较稳定的重排离子，因此在质谱图上出现重排离子峰。麦氏重排 具有不饱和官能团 C=X（X为O、S、N、C等）及其-H原子结构的化合物，-H原子可以通过六元环空间排列的过渡态，向缺电子的部位转移，发生-H的断裂，同时伴随 C=X的键断裂（属于均裂），这种断裂称为麦克拉弗梯重排，简称麦氏重排，通式为：5.亚稳离子质量为m1

31、的离子在离开离子源受电场加速后，在进入质量分析器之前，由于碰撞等原因很容易进一步分裂失去中性碎片而形成质量为m2的离子，即m1m2+m，由于一部分能量被中性碎片带走，此时的m2离子比在离子源中形成的m1离子能量小，故将在磁场中产生更大偏转，观察到的m/z较小。则把这种在飞行中发生裂解的母离子称为亚稳离子，由它形成的质谱峰为亚稳峰，此峰可看成m1和m2的“混合峰”，因此形成“宽峰”，极易识别。质荷比一般不是整数，与母离子和子离子有如下关系：通过亚稳离子峰可以获得有关裂解信息，通过对m*峰观察和测量，可找到相关母离子的质量m1与子离子的质量m2，从而确定裂解途径。6.准分子离子利用CI电离法时常得

32、到比分子质量多或少1个质量单位的离子，称准分子离子。（三）质谱的应用一张化合物的质谱包含着有关化合物的很丰富的信息。在很多情况下，仅依靠质谱就可以确定化合物的相相对对分分子子量量、化化学学分分子子式式和和分分子子结结构构。而且，质谱分析的样品用量极微，因此，质谱法是进行有机物鉴定的有力工具。当然，对于复杂的有机化合物的定性，还要借助于红红外外光光谱谱，紫紫外外光谱，核磁共振光谱，核磁共振等分析方法。1.相对分子质量根据分子离子峰质荷比可确定相对分子量，通常分子离子峰位于质谱图最右边，但由于分子离子的稳定性及重排等，质谱图上质荷比最大的峰并不一定是分子离子峰。如何辩认分子离子峰呢？1）原则上除同

33、位素峰外，分子离子峰是最高质量的峰。但要注意“醚、胺、脂的(M+H)+峰”及“芳醛、醇等的(M-H)+峰”。2）分子离子峰应符合“氮律”。在C、H、O组成的化合物中，分子离子峰的质量数一定是偶数；在含C、H、O、N化合物中，含偶数个N的分子量为偶数，含奇数 个N的分子量为奇数。3）分子离子峰与邻近峰的质量差是否合理。有机分子失去碎片大小是有规律的：如失去H、CH3、H2O、C2H5.，因而质谱图中可看到M-1，M-15，M-18，M-28等峰，而不可能出现M-3，M-14，M-24等峰，如出现这样的峰，则该峰一定不是分子离子峰。4）EI 源中，当电子轰击电压降低，强度不增加的峰不是分子离子峰。

34、2.化学分子式a）高分辨质谱：可分辨质荷比相差很小的分子离子或碎片离子。如CO和N2分子离子的m/z均为28，但其准确质荷比分别为28.0040和27.9949，高分辨质谱可以识别它们。b)低分辨质谱则不能分辨m/z相差很小的碎片离子，如CO和N2。通常通过同位素相对丰度法来确定分子的化学式。对于化合物CwHxNyOz，其同位素离子峰(M+1)+和(M+2)+与分子离子峰的强度比分别为：3.结构鉴定在一定的实验条件下，各种分子都有自己特征的裂解模式和途径，产生各具特征的离子峰，包括其分子离子峰、同位素离子峰及各种碎片离子峰。根据这些峰的质量及强度信息，可以推断化合物的结构。如果从单一的质谱信息

35、还不足以确定化合物的结构或需进一步确证的话，可借助于其他的手段，如红外光谱法、核磁共振波谱法、紫外可见吸收光谱法等。六、生物质谱技术简介生物质谱主要用于解决两个生物大分子的分析问题：其一是精确测定生物大分子，如蛋白质、核苷酸和糖类等的分子量，并提供它们的分子结构信息；其二是对存在于生命复杂体系中的相互作用。按离子源的类型：电喷雾电离（ESI）和基质辅助激光解吸电离（MALDI）（一）生物质谱的软电离技术生物大分子电喷雾电离快原子轰击电离基质辅助激光解吸电离离子喷雾电离大气压电离1.电喷雾电离（ESI）ESI是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，

36、随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。特点是一种软电离方式；是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比（m/z）降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围；它适合于分析极性强的大分子有机化合物，如蛋白质、肽、糖等；可以方便地与多种分离技术联合使用，如液质联用（LCMS）。2.基质辅助激光解吸电离（MALDI）基质辅助激光解吸电离工作原理MALDI引入了固体基质，使样品液与基质液混合，滴于靶面，在真空中快速干燥，制成极细的混晶。当激光束照射在涂有样品和基质混晶的靶面上时，基质

37、的有机分子在固态混晶中共振吸收能量，并将能量传递到基质有机物晶体的晶格中，使晶格受到瞬时强烈扰动而解吸出离子或中性分子，并通过这些离子或分子将吸收的能量传递给生物大分子而使其电离。MALDI Matrix 应具有的特性 能够嵌入样品分子间并能起到隔离样品分子之间的相互作用(如形成共结晶);能溶解于可溶解样品分子的溶剂;在真空状态下是稳定的;可吸收激光,既与激光形成共振吸收;可激发样品分子离子化.常用基质特点 基质辅助激光解吸离子化中，激光的能量大量消耗于晶格扰动中，并不是直接作用与生物大分子使之裂解，因此是一种软电离方式；激光采用N2激光源，波长为337nm，为脉冲式工作方式；基质辅助激光解吸

38、电离源与飞行时间质量分析仪所构成的质谱仪，得到的质谱信息主要是分子离子、准分子离子，而碎片离子和多电荷离子较少。通常用飞行时间检测器作为质量分析器，构成基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱。可用于生物大分子物质分子量的测定；蛋白质高通量鉴定；有机小分子化合物分子量测定；寡核苷酸的分析；基因的单核苷酸多态性的分析等。MALDI-TOF MS抗高盐和非挥发性杂质干扰抗高盐和非挥发性杂质干扰高通量高通量飞行时间质谱仪的源后裂解离子在飞行过程中如果发生裂解，新产生的离子仍然以母离子速度飞行。因此在直线型漂移管中观测不到新生成的离子。如果采用带有反射器的漂移管，因为新生成的离子与其母离子动能不同，可在反射

39、器中被分开。这种操作方式称为源后裂解(Postsourcedecomposition，PSD)。通过PSD操作可以得到结构信息。因此，可以认为反射型TOFMS也具有MS-MS功能。利用PSD谱图，结合数据库检索可以迅速、高特异性地鉴定蛋白质。（二）质谱联用技术色谱-质谱联用分离鉴定串联质谱1.色质联用A、气相色谱质谱(GC-MS)B、液相色谱质谱(LC-MS)C、毛细管电泳质谱(CE-MS)GC-MS联用应用十分广泛，从环境污染分析、食品香料分析鉴定到医疗检验分析、药物代谢研究等。而且GC-MS联用是国际奥委会进行兴奋剂药检的有力工具之一。对于热稳定性差、不易汽化的样品，GS-MS联用有一定的

40、困难，因此，近年来又发展了LC-MS联用技术。CE-MS是色质联用中新的发展方向。LC-MS2.串联质谱样品品酶解解酶解片断解片断一一级质谱PMF肽指指纹图谱串串联质谱对库检索索序列数据序列数据库成功成功鉴定定PSMs及后及后筛选序列分析序列分析未知蛋白未知蛋白肽谱鉴定流程一级质谱蛋白质经过酶解后，送入质谱仪，得到一级质谱。目前来说，由MALDI-TOF质谱仪产生的质谱图精度较高，而由ESI质谱仪产生的质谱图精度相对较低。二级质谱在一级质谱图中，选择其中的一个峰，对其进行CID过程，就得到一张二级质谱图。从一级质谱图里选出部分峰做二级质谱一级质谱图二级质谱图裂解方式碰撞诱导分解（Collisi

41、on Induced dissociation，CID）源后衰减（Post source decay，PSD）三级四极质谱仪（ESI-Q-Q-Q MS）三级四极质谱仪有三组四极杆，第一组四级杆用于质量分离(MS1)，第二组四极杆用于碰撞活化(CID)，第三组四极杆用于质量分离(MS2)。在串联质谱中采用碰撞活化解离(Collisionactivateddissociation,CAD)技术把离子“打碎”。碰撞活化分解也称为碰撞诱导解离(CollisionInduceddissociation,CID)，在碰撞室内进行，带有一定能量的离子进入碰撞室后，与室内惰性气体的分子或原子（也可以是空气）发

42、生碰撞，离子发生碎裂。扫描方式子离子扫描方式：由MS1选定质量，CID碎裂之后，由MS2扫描得子离子谱。母离子扫描方式：由MS2选定一个子离子，MS1扫描，检测器得到的是能产生选定子离子的那些离子，即母离子谱。中性丢失谱扫描方式：MS1和MS2同时扫描。只是二者始终保持一定固定的质量差(即中性丢失质量)，只有满足相差固定质量的离子才得到检测。多离子反应监测方式：由MS1选择一个或几个特定离子，经碰撞碎裂之后，由其子离子中选出一特定离子，只有同时满足MS1和MS2选定的一对离子时,才有信号产生。用这种扫描方式的好处是增加了选择性，即便是两个质量相同的离子同时通过了MS1，但仍可以依靠其子离子的不

43、同将其分开。电喷雾离子化四极杆时间飞行质谱ESI-Q-TOF MS与LC联用脱盐质量范围大可从头测序MALDI-TOF/TOF-MS/MSIon Source#2Ion Source#1Precursor Ion Selector(TIS)Collision CellMassAnalyzer#2DetectorMassAnalyzer#1GeneratesandAcceleratesIonsTOF1SeparatesIonsInduces CID Fragmentation of PrecursorRe-AcceleratesFragmentsTOF2withMirrorSeparatesFr

44、agmentsSelectsIons抗高盐干扰抗高盐干扰高通量高通量质量范围大质量范围大可从头测序可从头测序（三）应用举例一、生物质谱在蛋白质和多肽研究中的应用二、生物质谱在多糖结构测定中的应用三、生物质谱在核酸分析中的应用生物质谱在蛋白质和多肽研究中的应用1.相对分子质量测定2.肽谱测定3.肽序列测定4.蛋白质翻译后修饰1.相对分子质量测定MALDI-TOF的准确度高达0.1%0.01%，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术，目前可测定生物大分子的分子量高达600KDa。SARS病毒N蛋白整体分子量2.肽谱测定肽质量指纹谱（PeptideMassFingerprinting,P

45、MF）是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的肽片段的质量图谱。采用MALDI-TOF-MS测得。由于每种蛋白的氨基酸序列（一级结构）都不同，当蛋白被水解后，产生的肽片段序列也各不相同，因此其肽质量指纹图也具有特征性。通过MALDI-TOF质谱仪得到的肽指纹图质量相近的多肽多肽多肽M+H+M+H+DGAPLESSSRDGAPLESSSR1019.04901019.0490REGESTPSRREGESTPSR1019.05201019.0520DFPIANGERDFPIANGER1019.09401019.0940DPLASSSWRDPLASSSWR1019.09401019.0940YV

46、PLKDQRYVPLKDQR1019.18001019.1800HLQLPAPSRHLQLPAPSR1019.18301019.1830VLFLNGIDKVLFLNGIDK1019.22001019.2200Peakm/z:1019.08串联质谱鉴定：对一个或者多个未被解析的肽段MS/MS数据进行对库比较从而进行蛋白鉴定。是目前应用最广的高通量鉴定蛋白质方法，鉴定准确度更高，无需人工序列解析，可以实现混合蛋白的鉴定。PSD质谱3.肽序列测定肽序列测定技术C端酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，灵敏度低。质谱法：灵敏度高，准确性好，易操作，具有普适性。N端化学降解法：用探针试剂氨基酸苯异硫氰酸

47、酯与游离氨基作用，再用各种层析技术分离；测序速度慢，样品用量大、纯度要求高。用串联质谱（MS/MS）可以进行多肽的从头测序（denovosequencing），并搜索数据库以鉴定蛋白质。化学辅助De-novo测序法，是以一种类似Edman降解的试剂进行肽段N-端修饰衍生的方法，让肽段的N-端带上负电荷，从而肽段在MS/MS碎裂时候产生的b系列离子将被中和，而只出现y系列离子，从而大大简化图谱，利用y系列离子的质量差值，便可以很容易的得到各个氨基酸序列。蛋白质鉴定的图示质谱图质谱图De-novo Sequencing序列数据库序列数据库一级质谱一级质谱二级质谱二级质谱PMF数据库检索数据库检索后

48、筛选后筛选蛋白质蛋白质未知多肽未知多肽PSMs4.蛋白质翻译后修饰蛋白质糖基化修饰的研究最近也有报道，主要是利用蛋白质组结合生物质谱技术，通过核素标记研究N-糖基化蛋白质。蛋白质修饰的研究一般采用二维电泳-免疫印迹-质谱技术，即用亲和技术提取修饰肽段，并用串联质谱鉴定修饰肽段来研究蛋白质磷酸化或糖基化。生物质谱在多糖结构测定中的应用 质谱技术于20世纪50年代末开始用于糖的分析，它可以提供相对分子质量、多糖的单糖组成、糖苷键的连接方式以及分支状况等多种信息，在糖类的分析中发挥着不可替代的作用。近年来，各种软电离技术相继诞生,使质谱技术在糖生物学的研究中取得了很大的进展。主要包括以下应用：1.相对分子质量测定：化学电离质谱，快原子轰击 质谱2.寡糖结构分析：GC-MS3.寡糖序列分析：酶解 MALDI-MS生物质谱在核酸分析中的应用核酸的相对分子量核酸测序思考题质谱分析方法的概念。质谱仪由哪几部分组成？各部分的作用是什么？离子源的作用是什么？试述几种常见离子源的原理及特点。哪些离子源适合分析生物大分子？常见的质量分析器有哪些？质谱仪的主要技术指标质谱峰的主要类型；判断质谱图上的分子离子峰的方法；律。什么是串联质谱？举例说明在生物质谱技术的应用。