5分子生物学技术

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1、常用分子生物学技术的原理和应用的变性的变性在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使双螺旋结构松散，变成单链，即为变变性。性。DNA是否发生变性的常用指标是DNA对260 nm波长吸光值（A260）变化。实验室最常用的方法是加热。的复性的复性变性在适当条件下，两条互补链可重新配对，恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的经缓慢冷却后即可复性，又称退火。核酸分子杂交核酸分子杂交DNA复性时，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在一定程度配对关系，在适宜的条件下（T、离子强度），就可以在不同的分子间形成杂化双链。杂化双链可以在不

2、同的DNA分子之间、DNA与RNA之间、RNA与RNA之间。核酸研究中的应用十分广泛。探针技术探针技术 探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的基因。标记物：同位素、生物素或荧光染料核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、cDNA、RNA探针种类：DNA、RNA印印迹迹技技术术(Blotting):将将在在凝凝胶胶中中分分离离的的生生物物大大分分子子转转移移(印印迹迹)在在固固相相化化介介质质上并加以检测分析的技术。上并加以检测分析的技术。(1)DNA 印迹:Southern blotting(2)RNA 印迹:Northern b

3、lotting(3)蛋白质印迹:Western blotting 印迹技术基本原理印迹技术基本原理 凝胶电泳凝胶电泳 转移转移 杂交杂交 放射自显影放射自显影 或化学显色或化学显色Southern blotting（DNA印迹技术）印迹技术）组组织织或或细细胞胞中中基基因因组组DNA经经限限制制性性内内切切酶酶消消化化后后进进行行琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳，将将含含有有DNA区区带带的的凝凝胶胶放放入入变变性性溶溶液液变变性性后后，使使胶胶中中的的DNA分分子子转转移移到到NC膜膜上上。转转移移完完成成后后，加加热热使使DNA固固定定于于NC膜膜上上，用于杂交反应可进行用于杂交反应可进行DN

4、A印渍。印渍。主主要要用用于于：基基因因组组DNA定定性性和和定定量量分分析析；亦亦可可用于分析重组质粒。用于分析重组质粒。RNA 印迹技术印迹技术:Northern blotting与与DNA blottingDNA blotting（Southern blottingSouthern blotting）原理原理相同相同检测检测RNARNA无需限制性内切酶切割无需限制性内切酶切割用途：用途：已知的特异已知的特异mRNA表达水平；表达水平；比较不同组织或细胞的同一基因表达情况比较不同组织或细胞的同一基因表达情况蛋白质印迹（蛋白质印迹（Western Blotting）1.蛋白质样品蛋白质样品2

5、.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳3.电转移蛋白质至电转移蛋白质至NC膜膜4.特异抗体做探针（一特异抗体做探针（一 抗）抗），碱性磷酸酶、辣，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶标记或同根过氧化物酶标记或同 位素标记第二抗体。位素标记第二抗体。5.检测样品中特异性蛋白检测样品中特异性蛋白 质的存在，细胞中特异蛋质的存在，细胞中特异蛋 白质的半定量分析白质的半定量分析 转膜Protein HRPDABH2O21Ab2Ab洗膜、显色PCR技术技术（Polymerase Chain Reaction）聚合酶链反应聚合酶链反应：将微量的特异的：将微量的特异的DNA片段在片段在体外快速扩增的技术。体外快速扩增

6、的技术。原理原理:以目的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。PCR PCR 反应体系的基本成分反应体系的基本成分 模板DNA，特异引物，DNA聚合酶（具耐热性）、dNTP以及含有Mg2的缓冲液。DNA Semiconservative ReplicationPCR基本反应步骤基本反应步骤n变性：95模板DNA变性成为单链n退火：54引物与模板DNA结合n延伸：72DNA聚合酶催化DNA合成 三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子

7、作为下一轮合成的模板，经多次循环（2530次）后即可达到扩增DNA片段的目的。PCR的主要用途的主要用途 l目的基因的克隆目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法l基因的体外突变基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因的嵌合、缺失、点突变等改造。lDNA和和RNA的微量分析的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要。lDNA序列分析序列分析l基因突变分析基因突变分析PCR衍生技术l反转录PCR技术mRNA反转录生成cDNA,cDNA 为模板PCR扩增l原位PCR技术在组织切片或细胞涂片单个细胞内PCR反应，再进行原位杂交l实时PC

8、R技术引入一对特殊的荧光标记引物探针，5端有一个荧光报告分子，3端有一个荧光淬灭分子；PCR进行时Taq酶遇到荧光探针可以酶切，根据荧光信号进行定量定量核酸序列分析核酸序列分析l1965年 Robert Holly用了7年完成了酵母丙氨酸-tRNA的76个核苷酸的序列测定lDNA序列分析仪24小时内可完成约10000个碱基序列的测定工作DNA链末端合成终止法（链末端合成终止法（Sanger法）法）l四种2,3-双脱氧核苷酸（ddNTP）代替部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底物进行DNA合成反应。依据是依据是ddNTP核糖的第三位位碳原子上不含羟基，不能与下一核核糖的第三位位碳原子上不含羟基，不能与下一核苷酸反应形成磷酸二酯键，致使苷酸反应形成磷酸二酯键，致使DNA合成反应终止。合成反应终止。l模板分四组模板分四组，反应一定时间后，每一管内加入四每一管内加入四种种ddNTP中的一种，中的一种，如果ddNTP:dNTP的比例适当，即可获得在不同部位终止反应的大小不同的DNA链，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影就可以读出一段DNA的序列。