解读基因组序列

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1、5 解 读 基 因 组 序 列 弄 清 楚 ：1.基 因 组 顺 序 中 所 包 含 的 全 部 遗 传 信 息 是 什么 (查 找 基 因 )2.基 因 组 作 为 一 个 整 体 如 何 行 使 其 功 能 其 一 ， 根 据 已 知 的 序 列 人 工 判 读 或 计 算 机分 析 寻 找 与 基 因 有 关 的 序 列 （ 如 ： 序 列 筛查 定 位 基 因 ）其 二 ， 实 验 研 究 ， 看 其 能 否 表 达 基 因 产 物及 其 对 表 型 的 影 响 ， 既 实 验 分 析 细 菌 DNA的 简 单 ORF扫 描高 等 真 核 生 物 DNA的 ORF扫 描功 能 性 RN

2、A定 位 基 因同 源 性 搜 索 和 比 较 基 因 组 学自 动 标 注 基 因 组 序 列 所 有 编 码 蛋 白 质 的 基 因 含 有 可 读 框 (open reading frames ORF)： 是 由 可 编 码 氨 基 酸的 密 码 子 组 成ORF起 始 于 起 始 密 码 子 （ 一 般 是 ATG） 终 止于 终 止 密 码 子 （ TAA,TAG,TGA）每 个 DNA序 列 有 6种 可 读 框 如 果 DNA序 列 CG碱 基 含 量 占 50%则 TAA， TAG， TGA每一 个 将 平 均 每 64bp出 现 一 次如 果 GC含 量 大 于 50%那 么

3、 含 A和 T碱 基 的 终 止 密 码 子出 现 的 频 率 会 相 对 比 较 少 ， 但 是 预 期 每 100200bp还 会 出 现 一 次寻 找 ORF的 方 式 是 将 100个 密 码 子 作 为 一 个 基 因 长度 的 下 限 简 单 的 ORF应 用 于 细 菌 DNA序 列 的 扫 描可 以 成 功 的 定 位 大 多 数 基 因 ， 因 为 细 菌 基因 间 距 非 常 小 重 叠 基 因 较 少 ， 而 且 细 菌 基因 内 无 内 含 子 ， ORF连 续 。 基 因 无 内 含 子 ORF连 续 高 等 真 核 生 物 基 因 之 间 间 隔 太 大 发 现 家

4、 ORF的 概 率增 加高 等 真 核 生 物 基 因 内 有 内 含 子 导 致 ORF不 连 续 ， 外显 子 小 于 100个 密 码 子 因 此 高 等 真 核 生 物 基 因 不 会 以 长 ORF形 式 出 现在 基 因 组 序 列 中 ,ORF无 法 扫 描 内 含 子 的 基 因 图 密 码 子 偏 倚 ： 特 定 生 物 体 的 基 因 中 并 不 是 所 有 密码 子 使 用 频 率 都 相 等 ， 真 正 外 显 子 有 所 偏 倚 。外 显 子 内 含 子 边 界 ： 因 为 有 特 定 的 序 列 特 征而 区 分 开上 游 调 控 序 列 ： 调 控 序 列 有 明

5、 显 特 点 ， 可 用 来 定位 基 因 起 始 区 搜 寻 编 码 RNA二 级 结 构 的 特 征 碱 基 序 列搜 寻 DNA编 码 茎 环 或 发 夹 结 构 的 程 序搜 索 与 功 能 RNA基 因 相 关 的 调 控 序 列搜 寻 紧 凑 的 较 小 基 因 组 中 蛋 白 质 编 码 基 因间 的 空 位 置 同 源 性 搜 索 ： 查 询 DNA数 据 库 来 判 断 所 检 测 序 列 是否 与 已 知 基 因 的 序 列 相 同 或 者 是 相 似比 较 基 因 组 学 ： 当 相 关 基 因 组 进 行 比 较 时 ， 同 源基 因 由 于 它 们 的 序 列 相 似

6、 性 很 高 就 容 易 被 鉴 别 出来 ， 而 在 第 二 个 基 因 组 中 没 有 明 确 同 源 物 的 任 何ORF都 可 以 很 肯 定 的 认 为 不 是 基 因 计 算 机 方 法 从 序 列 分 析 开 始 ， 运 用 能 扫描 ORF、 外 显 子 -内 含 子 边 界 及 上 游 调 控 区并 能 在 数 据 库 中 检 测 同 源 基 因 ORF的 程 序 进行 序 列 分 析 。 这 些 程 序 同 时 也 用 于 寻 找 重复 序 列 及 功 能 RNA基 因 的 特 意 性 特 征 ， 而 后信 息 整 合 分 析 。 大 多 数 基 因 定 位 的 试 验 方

7、 法 依 赖 于 检 测由 基 因 转 录 成 的 RNA分 子 。杂 交 试 验 可 以 判 断 某 一 片 段 是 否 含 有 转 录序 列cDNA测 序 有 助 于 在 DNA片 段 中 进 行 基 因 作 图精 确 定 位 转 录 物 末 端可 以 准 确 定 位 外 显 子 内 含 子 边 界 如 果 用 标 记 的 基 因 组 片 段 与 细 胞 RNA进 行northern杂 交 ， 就 可 以 检 测 到 那 个 片 段 上 的 基 因所 转 录 出 的 RNA。 缺 点 ：一 些 单 个 基 因 有 两 个 或 更 多 长 度 不 等 的 转 录 物mRNA表 达 时 期 和

8、 部 位 的 特 异 性 将 cDNA序 列 与 基 因 组 DNA序 列 相 比 较 ， 就 可以 描 述 相 应 基 因 的 位 置 找 到 外 显 子 内 含 子 的边 界 ， 两 个 决 定 此 方 法 成 功 的 因 素 ：所 研 究 基 因 DNA片 段 表 达 水 平 的 高 低cDNA分 子 的 完 整 性 将 RNA做 起 始 材 料 进 行 特 殊 类 型 的 PCR逆 转 录 PCR（ reverse transcriptase PCR,RT-PCR） 快 速 扩 增 cDNA末 端其 他 的 转 录 物 准 确 作 图 的 方 法 包 括 异 源 双 链 分 析（ he

9、teroduplex analysis） 外 显 子 捕 获 （ exon trapping） ： 将 一 特 殊 类 型载 体 导 入 合 适 的 真 核 细 胞 系 中 。 根 据 已 知 的 小 基因 序 列 确 定 出 插 入 的 外 显 子 其 实 和 终 止 核 苷 酸 的位 置 ， 从 而 准 确 描 述 外 显 子 5.2 确 定 单 个 基 因 的 功 能 一 旦 一 个 新 基 因 在 基 因 组 序 列 中 获 得 定 位 ， 就要 探 索 它 的 功 能 问 题 。 大 肠 杆 菌 基 因 组 序 列 中 4288个 蛋 白 质 编 码 基 因中 ， 以 前 已 经 鉴

10、 定 出 的 基 因 只 有 1853个 （ 占 总 数 的43%） 。 对 于 酿 酒 酵 母 ， 此 数 值 只 有 30%。 像 基 因 定 位 一 样 ， 也 尝 试 着 用 计 算 机 分 析 和 实验 研 究 来 确 定 未 知 基 因 的 功 能 。 5.2.1基 因 功 能 的 计 算 机 分 析同 源 性 搜 索 是 通 过 把 被 研 究 的 DNA序 列 与 数 据 库中 其 他 所 有 的 DNA序 列 进 行 比 较 来 定 位 基 因 。同 源 性 搜 索 的 基 础 是 相 关 的 基 因 具 有 相 似 序 列 ，因 此 可 以 通 过 与 不 同 物 种 中

11、已 测 序 的 同 源 基 因 具有 相 似 性 来 发 现 新 基 因 。 同 源 性 反 映 出 进 化 关 系 同 源 基 因 具 有 共 同 的 进 化 祖 先 ， 是 通 过 基 因 之间 的 序 列 相 似 性 而 发 现 的 。 （ 如 图 5.16) 同 源 基 因 分 两 类 ： 定 向 进 化 同 源 基 因 orthologous gene 是 那 些 不同 生 物 体 间 存 在 的 同 源 物 ， 它 们 的 共 同 祖 先 早 于 物种 之 间 的 分 裂 。 同 源 基 因 通 常 具 有 相 同 的 或 很 类 似的 功 能 。 Eg： 人 类 和 黑 猩 猩

12、的 肌 红 蛋 白 基 因 是 同 源基 因 。 图 5.16 定 向 进 化 同 源 基 因 和 平 行 进 化 同 源 基 因 平 行 进 化 同 源 基 因 paralogous gene 存 在 于 相 同生 物 体 中 ， 常 是 可 识 别 的 多 基 因 家 族 的 成 员 ， 它 们共 同 的 祖 先 可 能 早 于 或 晚 于 目 前 发 现 新 基 因 的 物 种分 裂 。 eg： 人 类 肌 红 蛋 白 和 球 蛋 白 基 因 是 平 行基 因 ： 它 们 起 源 于 5.5亿 年 前 祖 先 基 因 的 复 制 。 通 常 一 对 同 源 基 因 不 具 有 相 同 的

13、 核 苷 酸 序 列 ，但 具 有 相 似 的 序 列 。 同 源 性 搜 索 就 是 利 用 这 些 序 列的 相 似 性 。 同 源 性 相 似 性 (如 图 5.17) 如 果 一 对 相 关 基 因 的 序 列 有 80%的 核 苷 酸 是 相 同 生物 ， 就 描 述 它 们 是 “ 80%同 源 ” 是 不 正 确 的 。 一 对 基 因在 进 化 上 要 么 有 关 要 么 无 关 ， 没 有 介 于 二 者 之 间 的 情 况， 因 此 把 同 源 性 描 述 为 百 分 数 是 没 意 义 的 。图 5.17 两 个 DNA序 列 具 有 80%的 序 列 一 致 性 同 源

14、 分 析 可 以 提 供 整 个 基 因 或 基 因 片 段 的 功 能 信 息 可 以 用 DNA序 列 进 行 同 源 性 搜 索 ， 但 通 常 在 搜 索之 前 先 将 假 定 基 因 的 序 列 转 换 为 氨 基 酸 序 列 。 这 样 做的 一 个 原 因 是 蛋 白 质 中 有 20种 不 同 氨 基 酸 ， 但 DNA中只 要 4种 核 苷 酸 ， 因 此 当 比 较 氨 基 酸 序 列 时 ， 无 关 基因 序 列 通 常 会 表 现 出 更 大 的 差 别 （ 如 图 5.18） 。 因 此如 果 使 用 氨 基 酸 序 列 进 行 同 源 性 搜 索 ， 就 不 太 可

15、 能 得到 假 结 果 。 同 源 性 搜 索 程 序 时 通 过 在 查 找 序 列 和 数 据 库 序 列 之 间 进 行 比较 而 开 始 的 。 对 于 每 个 比 较 来 讲 ， 都 计 算 出 一 个 得 分 ， 操 作 人员 通 过 这 个 得 分 可 以 估 量 查 询 序 列 与 试 验 序 列 同 源 的 可 能 性 。有 两 种 方 法 可 以 产 生 这 个 得 分 。图 5.18 当 在 氨 基 酸 水 平 进 行 比 较 ， 更 明 显 。 两 条 核 苷 酸 序 列 中 ， 绿 色 表 示 相 同 ， 红 色 表 示 不 同 。 有 76%的 一 致 ， 如 星

16、号 所 示 。 把 序 列 翻 译 成 氨 基 酸 ， 一 致 性 就 降 低 到 28%。 黄 色 表 示 相 同， 棕 色 表 示 不 同 。 AA序 列 之 间 进 行 比 较 就 表 明 基 因 不 是 同 源 的 ， 核 苷 酸 水 平 的 相 似 性 是 偶 然 的 。 最 简 单 的 方 法 是 计 算 相 同 氨 基 酸 在 两 条 序 列 中 都 存 在的 位 点 数 。 这 个 数 值 被 转 换 成 平 均 数 后 就 可 以 给 出 两条 序 列 之 间 的 相 似 程 度 。 最 先 进 的 方 法 是 运 用 不 相 同 氨 基 酸 之 间 的 化 学 相 关性 为

17、 比 对 中 的 每 个 位 点 进 行 评 分 ， 相 同 或 很 近 的 氨 基酸 （ eg:leu和 ile） 分 数 就 高 ， 不 相 关 的 氨 基 酸 （ eg:phe和 ser） 分 数 就 低 。 这 种 分 析 就 确 定 了 一 对 序列 之 间 的 相 似 程 度 。 可 进 行 同 源 性 搜 索 分 析 的 软 件 最 常 用 的 是 BLAST， 只 需 登 陆 到 该 网 站 的 一 个 DNA数 据 库 中 ， 将 序 列 输入 到 在 线 搜 索 工 具 就 可 以 进 行 分 析 。 标 准 的 BLAST程序 能 有 效 鉴 别 出 序 列 相 似 性

18、大 于 30%40%的 同 源 基 因。 PSI-BLAST（ 位 点 特 异 的 重 复 BLAST ） ， 通 过 将标 准 BLAST搜 索 的 同 源 序 列 组 合 成 一 个 序 列 谱 能 鉴 别出 相 关 性 差 别 更 大 的 序 列 ， 运 用 该 序 列 谱 的 特 征 能 鉴别 出 在 起 始 搜 索 中 没 有 检 测 到 的 另 外 的 同 源 序 列 。 同 源 基 因 具 有 非 常 不 同 的 生 物 功 能 ， 一 个 例 子 是 眼晶 状 体 的 晶 体 蛋 白 ， 其 中 一 些 与 代 谢 酶 同 源 。 因 此， 待 查 找 序 列 与 晶 体 蛋

19、白 之 间 具 有 同 源 性 并 不 代 表待 查 找 序 列 是 一 种 晶 体 蛋 白 ， 而 且 待 查 找 序 列 与 代谢 酶 之 间 具 有 相 似 性 或 明 显 的 同 源 性 也 不 能 表 明 待查 找 序 列 是 一 种 代 谢 酶 。 基 因 是 不 相 关 的 ， 但 它 们 蛋 白 质 具 有 相 似 的 功 能 ，并 同 时 具 有 每 种 蛋 白 质 上 一 个 结 构 域 的 编 码 序 列 ，而 此 结 构 域 对 其 共 同 的 功 能 起 关 键 作 用 。 虽 然 基 因本 身 没 有 共 同 的 祖 先 ， 结 构 域 却 有 共 同 的 祖 先

20、。tudor结 构 就 是 一 个 典 型 的 例 子 （ 如 图 5.19） 图 5.19 tudor结 构 域 图 的 上 部 显 示 果 蝇 tudor蛋 白 结 构 ， 它 含 有 10个 拷贝 的 tudor结 构 域 。 另 一 个 果 蝇 蛋 白 homeless及 人 类 A-激 酶 锚 定 蛋 白 （ AKAP149） 中 发 现 了 此 结 构 域 ， 它 在 RNA代 谢 中 发 挥 一 定 的 作 用 。 除 了 含 有 tudor结 构 域 外 ， 这些 蛋 白 质 并 不 相 似 。 每 种 蛋 白 质 的 活 性 都 在 一 个 方 向 或其 他 方 向 中 与

21、RNA有 关 运 用 同 源 性 搜 索 为 人 类 疾 病 基 因 确 定 功 能人 类 基 因 组 测 序 的 主 要 原 因 之 一 是 能 获 得 人 类 疾 病 相关 的 基 因 。同 源 性 搜 索 在 疾 病 基 因 的 研 究 中 发 挥 很 重 要 的 作 用 ，因 为 在 另 一 种 生 物 体 中 发 现 人 类 疾 病 基 因 的 同 源 基 因经 常 是 理 解 人 类 基 因 生 物 化 学 功 能 的 关 键 。 5.2.2用 实 验 分 析 阐 明 基 因 的 功 能常 规 的 路 线 ： 表 型 基 因 型新 的 方 法 ： 基 因 型 表 型 通 过 基 因

22、 失 活 进 行 功 能 分 析 与 表 型 有 关 的 基 因 可 以 通 过 确 定 具 有 突 变 表 型的 生 物 体 中 哪 个 基 因 是 失 活 的 而 被 鉴 别 出 来 。 如 果起 点 是 基 因 而 不 是 表 型 ， 那 么 相 应 的 策 略 就 是 进 行基 因 突 变 并 确 定 所 引 起 的 表 型 改 变 ， 这 是 大 多 数 用于 确 定 未 知 基 因 功 能 的 技 术 基 础 。 同 源 重 组 可 以 使 单 个 基 因 失 活使 特 定 基 因 失 活 的 最 简 单 方 法 是 用 一 段 无 关 DNA片 段将 其 破 坏 （ 如 图 5.

23、20） 。 这 可 以 通 过 在 基 因 的 染 色体 拷 贝 和 另 一 段 与 靶 基 因 有 一 些 相 同 序 列 的 DNA之 间进 行 同 源 重 组 来 达 到 。 现 在 的 目 的 只 要 知 道 两 个 DNA分 子 具 有 相 似 序 列 ， 重 组 能 引 起 分 子 片 段 进 行 互 换就 足 够 了 。如 何 进 行 基 因 失 活 呢 ？ 酿 酒 酵 母 （ 如 图 5.21） 模 式 生 物 ： 人 小 鼠 图 5.20 同 源 重 组 引 起 基 因 失 活 靶 基 因 的 染 色 体 拷 贝 与 克 隆 载 体 携 带 的 断裂 基 因 结 合 起 来

24、。 结 果 是 ， 靶 基 因 被 失 活 了 。 图 5.21 酵 母 缺 失 盒 的 应 用 缺 失 盒 包 括 抗 生 素 抗 性 基 因 和 该 基 因 前 面 在酵 母 中 表 达 所 需 的 启 动 子 序 列 以 及 两 侧 的 限 制 性位 点 。 “ 缺 失 盒 ” 是 含 有 抗 生 素 抗 性 的 基 因 ， 不 是 酵 母 基因 组 中 的 正 常 部 分 ， 但 如 果 转 入 酵 母 染 色 体 中 就 会 起作 用 ， 就 产 生 一 种 转 化 的 对 抗 生 素 遗 传 霉 素 有 抗 性 的酵 母 细 胞 。 运 用 缺 失 盒 之 前 ， 新 的 DNA片

25、 段 作 为 尾 端 连接 到 每 个 末 端 。 这 些 片 段 与 要 被 失 活 的 酵 母 基 因 的 部分 序 列 相 同 。 当 改 良 盒 导 入 酵 母 细 胞 后 ， 同 源 重 组 就在 DNA末 端 和 酵 母 基 因 的 染 色 体 拷 贝 之 间 出 现 ， 用 抗 生素 抗 性 基 因 代 替 后 者 。 因 此 ， 通 过 将 培 养 物 接 种 到 含有 遗 传 霉 素 的 琼 脂 培 养 基 中 来 筛 选 携 带 替 换 基 因 的 细胞 。 所 产 生 的 克 隆 缺 少 靶 基 因 的 活 性 ， 可 以 通 过 检 查它 们 的 表 型 获 得 此 基

26、 因 功 能 的 一 些 提 示 。 3.不 用 同 源 重 组 进 行 基 因 失 活转 座 子 标 记 技 术 （ transposon tagging) 通 过 向 基因 中 插 入 转 座 元 件 或 转 座 子 使 其 失 活 。 （ 更 适 合 用于 整 体 研 究 基 因 组 的 功 能 ）RNA干 扰 或 RNAi是 一 种 完 全 不 同 的 基 因 失 活 方 法 ， 它并 不 打 断 基 因 本 身 ， 而 是 破 坏 其 mRNA 。 这 是 通 过 将与 目 的 mRNA序 列 匹 配 的 小 双 链 RNA分 子 导 入 细 胞 中 完成 的 。 双 链 RNA被

27、打 断 成 小 分 子 来 诱 导 mRNA的 降 解 （ 如 图5.22） 图 5.22 RNA干 扰 双 链 RNA分 子 被 Dicer核 酸 酶 切 割 成 2125bp的 “小 干 扰 RNA” （ siRNA） 。 每 个 siRNA的 一 条 链 与 靶mRNA碱 基 配 对 ， 后 被 RDE-1核 酸 酶 降 解 4.基 因 过 表 达 也 可 以 用 来 探 索 功 能 需 要 区 分 两 种 情 况 ： 表 型 变 化 是 由 于 过 表 达 的 特 异 功 能 造 成 的 ； 特 异 性 比 较 小 的 表 现 变 化 反 映 了 异 常 情 况 。 过 表 达 一 个

28、 基 因 ， 必 须 运 用 一 种 特 殊 类 型 的 克 隆 载体 ， 设 计 此 类 载 体 以 保 证 被 克 隆 的 基 因 能 合 成 尽 可 能 多的 蛋 白 质 。 因 此 ， 这 种 载 体 是 多 拷 贝 的 ， 意 思 是 在 宿 主细 胞 内 它 可 以 复 制 到 每 个 细 胞 40200个 拷 贝 ， 所 以 也 就出 现 了 待 测 基 因 的 许 多 拷 贝 。 载 体 必 须 含 有 高 活 性 启 动子 ， 以 便 每 个 拷 贝 的 待 测 基 因 能 被 转 变 成 大 量 mRNA， 再次 确 保 合 成 尽 可 能 多 大 的 蛋 白 质 （ 如

29、图 5.23） 图 5.23 通 过 基 因 过 表 达 进 行 功 能 分 析 目 的 是 确 定 被 研 究 的 基 因 过 表 达 是 否 影 响 转 基 因 小鼠 的 表 型 。 因 此 将 目 的 基 因 的 cDNA插 入 到 带 有 高 性 启 动子 序 列 的 克 隆 载 体 中 ， 此 启 动 子 序 列 指 导 克 隆 基 因 在 小鼠 肝 脏 中 表 达 。 应 用 cDNA而 不 用 基 因 的 基 因 组 拷 贝 是 因为 前 者 不 含 有 内 含 子 ， 因 而 比 较 短 并 且 更 易 于 在 试 管 中操 作 。 图 5.24 两 步 基 因 替 换 5.2

30、.3未 知 基 因 编 码 Pr活 性 的 详 细 研 究 1.定 点 诱 变 可 以 用 来 详 细探 索 基 因 的 功 能 使 用 定 向 诱 变 或 体 外 诱 变的 方 法 来 对 基 因 序 列 的 相 关 部位 进 行 缺 失 或 改 变 。 诱 变 后 如 何 寻 找 突 变 基 因 标 记 基 因 （ 可 能 改 变 环 境 ） 为 了 保 证 被 研 究 基 因 活 性 的变 化 是 由 引 入 基 因 的 特 异 突 变改 造 的 ， 而 不 是 由 于 基 因 组 中插 入 与 目 的 基 因 紧 靠 的 标 记 基因 后 造 成 环 境 的 间 接 效 果 ， 运用

31、的 两 步 基 因 替 换 法 （ 如 图5.24） 2.报 道 基 因 和 免 疫 细 胞 化 学 可 以 用 来 定 位 基 因 的 时 空 表 达报 道 基 因 （ reporter gene） 就 可 能 确 定 生 物 体 内 的 基因 表 达 模 式 。 比 较 可 靠 地 指 示 出 待 测 基 因 表 达 的 时 间和 空 间 ， 就 必 须 使 报 道 使 报 道 基 因 与 待 测 基 因 一 样 受同 样 的 信 号 调 节 。 这 可 以 通 过 用 报 道 基 因 的 ORF替 代 待测 基 因 的 ORF来 实 现 （ 如 图 5.25） 。 大 多 数 控 制 基

32、 因 表达 的 调 节 信 号 位 于 ORF上 游 的 DNA区 域 内 ， 现 在 报 道 基因 就 应 该 表 现 出 与 待 测 基 因 相 同 的 表 达 模 式 了 。 因 此， 就 可 以 通 过 检 测 生 物 体 内 报 道 基 因 的 信 号 来 确 定 表达 模 式 。 图 5.25 报 道 基 因 报 道 基 因 的 可 读 框 取 代 待 研 究 基 因 的 读 框。 结 果 是 报 告 基 因 受 到 通 常 能 表 明 待 测 基 因 表达 模 式 的 调 控 序 列 的 调 控 序 列 的 调 节 。 免 疫 细 胞 化 学 该 方 法 使 用 一 种 感 兴

33、趣 蛋 白 质 特 异 性 抗 体 ， 这 样 就会 结 合 到 这 种 蛋 白 质 而 不 是 其 他 蛋 白 质 上 。 抗 体 进 行 了标 记 ， 这 样 它 在 细 胞 中 的 位 置 以 及 目 的 蛋 白 质 在 细 胞 中的 位 置 就 可 以 被 观 察 到 。 （ 如 图 5.26） 。 图 5.26 免 疫 细 胞 化 学 用 红 色 荧 光 标 记 物 标 记 的 抗 体 处 理 细 胞 。 细 胞 检 测结 果 表 明 荧 光 信 号 与 线 粒 体 内 膜 相 结 合 。 因 此 ， 一 种 假设 认 为 目 的 蛋 白 质 参 与 电 子 输 送 和 氧 化 磷

34、酸 化 ， 因 为 这些 是 线 粒 体 内 膜 的 主 要 生 化 功 能 。 5.3 个 例 研 究 ： 标 注 酿 酒 酵 母 基因 组 序 列 5.3.1标 注 酵 母 基 因 组 序 列 酵 母 菌 基 因 组 测 序 在 1996完 成 。 最 初 的 分 析 将 100个 密 码 子 设 为 可 能 存在 基 因 的 最 小 长 度 ， 鉴 别 出 6274个 ORF,其 中 大 约 30%的 ORF是 已 知 真 正 的 基因 。 剩 下 的 70%运 用 同 源 性 分 析 进 行 了 研 究 ， 得 到 了 一 些 结 果 ： 1.用 同 源 性 搜 索 序 列 数 据 数

35、 据 库 ， 可 以 确 定 出 基 因 组 中 大 约 30%基 因 的 功 能 。其 中 有 一 半 很 明 确 是 功 能 基 因 的 同 源 基 因 ， 另 一 半 没 有 明 显 的 相 似 性 ， 包 括许 多 相 似 性 仅 限 于 个 别 结 构 域 的 基 因 。2.酵 母 所 有 基 因 大 约 有 10%在 数 据 库 中 有 同 源 基 因 ， 但 这 些 同 源 基 因 的 功 能未 知 。 因 此 同 源 性 分 析 不 能 帮 助 确 定 这 些 酵 母 基 因 的 功 能 。 这 些 酵 母 基 因 及其 同 源 基 因 称 作 孤 儿 家 族 。3.剩 下 的

36、 总 数 的 大 约 30%， 在 数 据 库 中 没 有 同 源 基 因 。 其 中 大 约 总 数 的 7%是有 疑 问 的 ORF， 其 长 度 很 短 或 有 异 常 的 密 码 子 偏 倚 ， 可 能 不 是 真 正 的 基 因 。另 外 的 大 约 总 数 的 23%像 基 因 但 是 唯 一 的 ， 被 称 为 单 一 孤 儿 。 对 酵 母 基 因 组 序 列 进 行 初 步 标 注 后 ， 有 两 个 重 要 的 问 题 ：1.单 一 孤 儿 中 有 多 少 为 真 正 基 因 ？2.是 否 有 一 些 真 正 基 因 因 为 长 度 小 于 100个 密 码 子 ， 所 以

37、 不 能通 过 最 初 分 析 鉴 定 出 来 ？ 酵 母 基 因 组 中 长 度 大 于 或 等 于 100个密 码 子 的 ORF只 有 6274个 ， 但 长 度 大 于 或 等 于 15个 密 码 子 的 ORF有 100000多 个 ， 它 们 中 的 大 多 数 表 现 出 的 密 码 子 选 择 模 式 与 真正 的 酵 母 基 因 无 差 别 ， 因 此 发 现 新 的 小 基 因 的 潜 力 是 很 大 的 。 可 以 用 前 面 介 绍 的 三 种 方 法 来 筛 选 酵 母 基 因 ：1.比 较 基 因 组 学 利 用 相 关 酵 母 物 种 的 一 组 基 因 组 序列

38、 ， 来 评 价 许 多 小 ORF的 真 实 性 。2.通 过 对 cDNA进 行 测 序 寻 找 转 录 的 证 据 ， 包 括 表 达 序列 标 签 的 文 库 ， 基 因 表 达 系 列 分 析 ， 微 阵 列 研 究 。3.转 座 子 标 记 像 用 来 通 过 失 活 基 因 进 行 功 能 分 析 一样 ， 也 用 来 鉴 定 真 正 基 因 的 ORF。 在 正 常 细 胞 中 lacZ基 因 是 失 活 的 ， 用 X-gal测 试 时 ， 克 隆显 白 色 。 被 激 活 后 ， 克 隆 显 蓝 色 。 有 疑 问 的 ORF就 可 根 据 克隆 的 颜 色 鉴 定 出 来

39、 。 2 确 定 酵 母 基 因 的 功 能酿 酒 酵 母 有 两 大 特 征 可 帮 助 确 定 其 基 因 组 中 未 知 的 基 因 功 能 。1.具 有 高 的 同 源 重 组 的 自 然 倾 向 ， 这 就 比 较 容 易 运 用 该 方 法来 失 活 单 个 基 因 。2.基 因 组 中 存 在 转 座 子 Ty家 族 ， 这 就 将 转 座 子 标 记 技 术 用 作基 因 失 活 。现 在 面 临 的 挑 战 是 发 展 能 筛 选 大 量 突 变 体 的 方 法 ， 以 找 到 能表 明 失 活 基 因 功 能 的 特 异 表 性 特 征 。 若 同 时 进 行 许 多 平

40、行 实验 ， 需 要 大 规 模 的 筛 选 策 略 。 这 些 筛 选 方 法 中 最 成 功 的 方 法 是 条 形 码 删 除 策 略 。 这 是 基 本 缺 失 盒 系 统 的 改 进 形 式 ， 它 们 的 区 别 是缺 失 盒 同 时 还 含 两 个 20个 核 苷 酸 的 “ 条 形 码 ” 序 列 ，每 种 缺 失 的 序 列 是 不 同 的 ， 因 此 可 作 为 特 异 突 变 体 的标 签 。 每 个 条 形 码 两 侧 的 序 列 是 相 同 的 ， 因 此 可 以 通 过单 个 PCR反 应 进 行 扩 增 。 这 就 表 明 ， 一 群 突 变 的 酵 母 株可 以

41、 混 合 在 一 起 ， 每 种 酵 母 株 含 有 一 种 不 同 的 失 活 基因 ， 就 可 以 在 单 次 实 验 中 筛 选 它 们 的 表 型 。 现 在 ， 大 约 有 55%的 酵 母 基 因 已 经 通 过 一 种 或 多 种实 验 方 法 明 确 了 它 们 的 功 能 。 明 确 功 能 的 基 因 有 1500多 个 ， 比 基 因 组 序 列 刚 被 测 通 过 时 的 情 况 好 得 多 。 另外 约 占 总 数 33%的 2000个 基 因 是 根 据 同 源 性 分 析 而 确定 功 能 的 。 只 剩 下 500个 ORF被 认 为 是 真 正 基 因 ， 但

42、 功能 未 定 ， 另 外 300个 有 疑 问 的 ORF可 能 不 是 真 正 的 基 因 。 3 总 结当 获 得 基 因 组 序 列 时 ， 最 初 的 目 标 是 对 所 有 基 因 进 行 定 位 。以 计 算 机 为 基 础 的 定 位 方 法 ：1.对 于 蛋 白 质 编 码 基 因 来 说 ， 可 尝 试 寻 找 ORF进 行 定 位 。2.可 以 通 过 寻 找 功 能 RNA基 因 的 特 征 对 它 们 的 进 行 定 位 ， 最 基 本的 是 RNA折 叠 成 二 级 结 构 的 能 力 是 以 碱 基 配 对 的 颈 环 结 构 信 息 为依 据 的 。3.也 可

43、以 通 过 同 源 性 分 析 对 基 因 进 行 定 位 ， 同 源 性 分 析 将 第 二种 基 因 组 中 存 在 同 源 基 因 作 为 推 测 待 测 基 因 组 中 的 假 定 基 因 是 真 正 基 因 的 依 据 。 用 户 注 册 - 3.注 册 成 功 基 因 定 位 的 实 验 方 法 是 以 检 测 从 基 因 组中 转 录 出 的 RNA分 子 为 基 础 的 。 包 括 ： 通 过 逆 转 录 PCR或 异 源 双 链 分 析 进行 cDNA测 序 和 转 录 物 作 图 。 对 于 基 因 功 能 的 确 定 ：1.通 过 同 源 性 分 析 ， 因 为 同 源

44、基 因 在 进 化 上 是 相 关 的 并 经 常具 有 相 似 功 能 。2.实 验 方 法 大 都 包 括 检 查 基 因 失 活 对 生 物 体 表 型 的 影 响 。 可以 用 不 同 的 方 法 实 现 基 因 失 活 ： a 用 有 缺 陷 的 基 因 进 行 同 源重 组 b 将 转 座 子 插 入 到 基 因 中 c RNA干 扰3.基 因 过 表 达 也 可 用 来 评 价 基 因 的 功 能 。4.通 过 定 点 诱 变 可 对 基 因 功 能 进 行 更 详 细 的 研 究 ， 而 且 可 以通 过 报 道 基 因 的 表 达 或 免 疫 细 胞 化 学 确 定 蛋 白 质 的 细 胞 定 位 。