荧光分析测定维生素c

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1、 荧 光 分 析 法 测 定 维 生 素 C 维 生 素 C及 维 生 素 C 的 测 定 原 理荧 光 分 析 法 测 定 维 生 素 C实 验荧 光 分 析 法 测 定 维 生 素 C 应 用 讲 解 人 ： 贺 政 轩 一 、 维 生 素 C及 维 生 素 的 测 定 原 理1 .1 维 生 素 C 维 生 素 C 又 名 抗 坏 血 酸 , 是 维 持 机 体 正 常 生 理 功 能 的 重 要 维生 素 之 一 ,而 人 体 不 能 自 身 合 成 ， 只 能 从 食 物 和 药 物 中 摄 取 ，因 此 ， 食 品 、 药 物 中 维 生 素 C 的 分 析 具 有 重 要 意 义

2、 。1 .2 维 生 素 C测 定 方 法 维 生 素 C 的 测 定 常 用 的 方 法 有 光 度 法 、 电 化 学 法 、 滴 定法 、 酶 法 、 色 谱 法 等 。 本 实 验 提 出 了 一 种 新 的 测 定 维 生 素 C 的 荧 光 分 析 方 法 ： 维 生 素 C 被 Cu 2 +氧 化 为 脱 氢 抗 坏 血 酸 ， 再与 苯 甲 酸 及 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 产 生 荧 光 协 同 增 敏 作 用 ， 通过 对 体 系 荧 光 强 度 的 测 定 进 行 维 生 素 C 的 定 量 分 析 。 二 、 荧 光 分 析 法 测 定 维 生 素 C实

3、验 1 实 验1 . 1 主 要 仪 器 与 试 剂 分 子 发 光 仪 :LS - 5 5 型 酸 度 计 :pH - 2 1 1 型 榨 汁 机 :CW - JE0 4 型 电 热 恒 温 水 浴 锅 :HH. SY1 1 - N i1 型 CuSO4 溶 液 :2 . 0 1 0 - 3 g m/ L 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 (CTMAB )溶 液 :6 . 0 1 0 - 4 g /mL 苯 甲 酸 溶 液 ： 1 . 0 1 0 - 4 g m/ L 维 生 素 C 标 准 储 备 液 :5 . 0 1 0 - 4 g /mL, 2 8 （ 避 光 保 存 ） ； 维

4、 生 素 C 标 准 溶 液 :1 . 0 1 0 - 5 g /mL, 2 8 （ 避 光 保 存 ） ； NaOH -邻 苯 二 甲 酸 氢 钾 缓 冲 溶 液 :pH =6 . 0 ； 1 . 2 实 验 步 骤 （ 1 ） 配 置 待 测 样 品 及 空 白 对 照 在 2 5 mL 比 色 管 中 依 次 加 入 0 . 6 m L CuSO4 溶 液 ， 2 . 0 m L十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 溶 液 ， 2 . 0 m L 苯 甲 酸 溶 液 ，一 定 体 积 的 维 生 素 C 标 准 溶 液 ， 5 . 0 mL NaOH -邻 苯 二 甲酸 氢 钾 缓 冲

5、 溶 液 , 用 蒸 馏 水 定 容 ， 摇 匀 ； 以 不 含 维 生 素 C 溶 液 为 空 白 对 照 。（ 2 ） 水 浴 加 热 在 3 5 恒 温 水 浴 中 加 热 3 0 m in， 将 溶 液 流 水 冷 却至 室 温 。（ 3 ） 荧 光 分 析 将 待 测 样 品 放 置 于 样 品 架 上 ， 设 定 激 发 波 长 为 3 0 8 nm ， 发 射 波 长 为 4 0 8 nm ， 测 量 荧 光 强 度 F ， 以 不 含 维生 素 C 的 试 剂 空 白 为 F 0 ， 计 算 F测 =F - F0 。 2 结 果 与 讨 论 2 . 1 激 发 光 谱 和 发

6、射 光 谱 取 3 . 0 mL 维 生 素 C 标 准 溶 液 , 按 实 验 方 法 进 行 操 作 ,分 别 在 2 9 0 3 3 0 nm、3 6 0 4 6 0 nm 内 扫 描 得 到 激 发 光 谱 和 发 射 光 谱 如 图 1 、 图 2 所 示 。 从 图 1 、 图 2 中 可 看 出 ,当 激 发 波 长 为 3 0 8 nm , 发 射 波 长 为 4 0 8 nm 时 体 系 的 荧 光 强 度 最 大 ,试 剂 空 白 的 荧 光 值 比 较 低 且 稳 定 , 故 本 实 验 选 择 激 发 波 长 为 3 0 8 nm ,发 射 波 长为 4 0 8 nm

7、。 1 C u2 + +BA +缓 冲 溶 液 +CTMAB; 2 Cu2 +BA +维 生 素 C +缓 冲 溶 液 +CTMAB 1 C u2 + +BA +缓 冲 溶 液 +CTMAB; 2 Cu2 +BA +维 生 素 C +缓 冲 溶 液 +CTMAB激 发 光 谱 发 射 光 谱 2 . 2 试 剂 加 入 顺 序 按 照 实 验 方 法 操 作 , 在 各 试 剂 加 入 量 相 同 的 情 况 下 , 试 验了 试 剂 的 不 同 加 入 顺 序 对 荧 光 强 度 的 影 响 。 试 验 结 果 表 明 , 当 所 加 试 剂 顺 序 依 次 为 CuSO4 溶 液 、 苯

8、甲 酸 溶 液 、 维 生 素 C 标 准 溶 液 、 NaOH -邻 苯 二 甲 酸 氢 钾 缓 冲 溶 液 时 ,体 系 的 荧 光强 度 最 大 ， 因 此 选 用 此 加 入 顺 序 为 最 佳 试 剂 加 入 顺 序 。 2 . 3 缓 冲 溶 液 溶 液 的 pH值 对 体 系 荧 光 强 度 有 较 大 的 影 响 ， 试 验 了 不 同 的 pH值 对 荧 光 强 度的 影 响 。 由 pH值 荧 光 强 度 的 曲 线 可 知 , 当 pH 值 为 5 . 9 6 . 2 时 ,荧 光 强度 达 到 最 大 值 且 比 较 稳 定 ,因 此 确 定 最 佳 pH 值 为 6

9、. 0 。 缓 冲 溶 液 的 种 类 对 体 系 的 荧 光 强 度 也 有 一 定 的 影 响 。 试 验 了 以 下 几 种 pH 值 为 6 . 0 的 缓 冲 溶 液 :NaOH - KH 2 PO4 、 KH2 PO4 - 硼 砂 、 KH2 PO4 - Na2 H PO4 、 NaOH - 邻 苯 二 甲 酸 氢钾 、 Na2 H PO4 - 柠 檬 酸 、 NaOH -柠 檬 酸 钠 、 HA c - NaA c等 。 试 验 结 果 表 明 ,当所 加 的 缓 冲 溶 液 为 NaOH -邻 苯 二 甲 酸 氢 钾 时 ,荧 光 强 度 最 大 且 稳 定 。 因 此 本 实

10、 验选 择 NaOH - 邻 苯 二 甲 酸 氢 钾 为 缓 冲 溶 液 ,其 最 佳 用 量 为 5 . 0 m L。2 . 4 加 热 温 度 和 加 热 时 间 试 验 了 不 同 温 度 对 体 系 荧 光 强 度 的 影 响 。 结 果 表 明 , 当 加 热 温 度 为 3 5 时 ，既 有 利 于 提 高 体 系 反 应 速 度 ， 又 不 使 反 应 物 与 产 物 结 构 受 到 破 坏 。 改 变 加 热 时间 进 行 试 验 , 结 果 发 现 ， 在 3 5 水 浴 中 加 热 3 0 m in， 体 系 荧 光 强 度 达 到 最 大 值 且相 对 稳 定 。 2 .

11、 5 硫 酸 铜 和 苯 甲 酸 的 用 量 其 它 条 件 不 变 ， 试 验 了 硫 酸 铜 和 苯 甲 酸 的 用 量 对 体 系荧 光 强 度 的 影 响 。 结 果 表 明 ， 当 硫 酸 铜 的 用 量 为 0 . 6 m L、 苯 甲 酸 的 用 量 为 2 . 0 mL 时 ， 体 系 荧 光 强 度 最 大 。2 . 6 表 面 活 性 剂 分 别 试 验 了 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 (CTMAB)、 十 二烷 基 磺 酸 钠 及 -环 糊 精 对 体 系 荧 光 强 度 的 影 响 。 结 果 表明 ,表 面 活 性 剂 对 体 系 的 荧 光 强 度 有

12、一 定 的 增 敏 效 果 ， 其中 CTMAB 对 体 系 的 增 敏 效 果 最 好 。 进 一 步 试 验 了 CTMAB 的 用 量 对 体 系 的 荧 光 强 度 的 影 响 , 当 CTMAB 的 用量 为 2 . 0 m L 时 , 体 系 荧 光 强 度 最 大 。 三 、 荧 光 分 析 法 测 定 维 生 素 C 应 用 样 品 测 定 取 一 片 维 生 素 C药 片 ， 研 细 ， 混 匀 ， 准 确 称 取 0 . 1 5 2 0 g 溶 于 二 次 蒸 馏 水 中 ， 转 移 至 5 0 0 mL 容 量 瓶 中 定 容 ， 配 成水 溶 液 。 再 准 确 移 取

13、 1 0 m L此 溶 液 ， 将 其 稀 释 成 1 0 0 m L的溶 液 ， 作 为 样 品 稀 释 液 。 对 样 品 稀 释 液 进 行 测 定 并 做 加 标 回 收 试 验 。 同 时 利 用 本 法 对 西 红 柿 和 果 珍 进 行 测 定 。 准 确 称 取 一定 量 的 果 珍 ， 将 其 配 成 1 0 0 mL的 溶 液 。 将 清 洗 干 净 的 西 红柿 榨 汁 ， 称 取 一 定 量 的 西 红 柿 汁 ， 将 其 配 成 1 0 0 m L的 溶液 。 其 它 步 骤 和 维 生 素 C 药 片 的 测 定 方 法 相 同 。 样 品 测 定 结 果 列 于

14、表 3 表 3 样 品 测 定 结 果 (n =3 )。 由 表 3 可知 ， 用 荧 光 分 析 法 测 定 维 生 素 C药 片 、 西 红 柿 和 果 珍 中 维 生 素 C的 含 量 ， 回 收 率 为 9 6 . 7 % 1 0 0 . 5 %准 确 度 较 高 。表 3 样 品 测 定 结 果 (n =3 ) 荧 光 分 析 法 测 定 维 生 素 C 具 有 操 作 简 单 ,精 密 度 高 ,检 出限 低 等 优 点 , 该 法 可 以 应 用 于 水 果 、 蔬 菜 和 药 物 中 维 生 素 C 的 检 测 , 适 于 推 广 。 谢 谢 观 赏 ！ 利 用 某 些 物 质

15、 受 光 照 射 时 所 发 生 的 荧 光 特 性 和 强 度 ，进 行 物 质 的 定 性 分 析 或 定 量 分 析 的 方 法 ， 称 为 荧 光 光 谱 分析 。 使 激 发 光 的 波 长 和 强 度 保 持 不 变 ， 而 让 荧 光 物 质 所 发生 的 荧 光 通 过 发 射 单 色 器 照 射 于 检 测 器 上 ， 调 节 发 射 单 色器 至 各 种 不 同 波 长 处 ,由 检 测 器 测 出 相 应 的 荧 光 强 度 ， 然 后以 荧 光 波 长 为 横 坐 标 ， 荧 光 强 度 为 纵 坐 标 作 图 ， 即 为 荧 光光 谱 ， 又 称 荧 光 发 射 光 谱 。 荧 光 发 射 光 谱 反 映 物 质 下 能 级的 信 息 。 让 不 同 波 长 的 激 发 光 激 发 荧 光 物 质 使 之 发 生 荧 光 ，而 让 荧 光 以 固 定 的 发 射 波 长 照 射 到 检 测 器 上 ， 然 后 以 激 发光 波 长 为 横 坐 标 ， 以 荧 光 强 度 为 纵 坐 标 ， 所 绘 制 的 图 即 为荧 光 激 发 光 谱 ， 又 称 激 发 光 谱 。1 .2 荧 光 光 谱 分 析 法