外源基因在大肠杆菌中的表达

《外源基因在大肠杆菌中的表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《外源基因在大肠杆菌中的表达（86页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、外 源 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达 外 源 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达大 肠 杆 菌 作 为 表 达 外 源 基 因 受 体 菌 的 特 征 大 肠 杆 菌 表 达 外 源 基 因 的 优 势 全 基 因 组 测 序 ， 共 有 4405个 开 放 型 阅 读 框 架 基 因 克 隆 表 达 系 统 成 熟 完 善 繁 殖 迅 速 、 培 养 简 单 、 操 作 方 便 、 遗 传 稳 定 被 美 国 FDA批 准 为 安 全 的 基 因 工 程 受 体 生 物 外 源 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达大 肠 杆 菌 作 为 表 达 外 源 基 因 受

2、 体 菌 的 特 征 大 肠 杆 菌 表 达 外 源 基 因 的 劣 势 缺 乏 对 真 核 生 物 蛋 白 质 的 复 性 功 能 缺 乏 对 真 核 生 物 蛋 白 质 的 修 饰 加 工 系 统 内 源 性 蛋 白 酶 降 解 空 间 构 象 不 正 确 的 异 源 蛋 白 细 胞 周 质 内 含 有 种 类 繁 多 的 内 毒 素 外 源 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达外 源 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 高 效 表 达 的 原 理 启 动 子 终 止 子 核 糖 体 结 合 位 点 密 码 子 质 粒 拷 贝 数 转 录翻 译 P tac = 3 P trp = 11

3、P lac 启 动 子 转 录 调 控 机 理 具 有 多 顺 反 子 结 构 ， 基 因 排 列 次 序 为 ： 启 动 子 （ lacP） - 操 纵 基 因 （ lacO） - 结 构 基 因 （ lacZ-lacY-lacA） 正 调 节 因 子 CAP 负 调 节 因 子 lac I 启 动 子Lac 表 达 系 统 以 大 肠 杆 菌 lac 操 纵 子 调 控 机 理 为 基 础 设 计 、 构 建 的 表 达 系 统 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高 效 转 录cAMPCAP lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚 合 酶

4、 基 底 水 平 转 录Lac 表 达 系 统 正 调 节 因 子 CAP cAMP激 活 CAP， CAPcAMP复 合 物 与 lac 操 纵 子 上 专 一 位 点 结 合 后 ， 能 促 进 RNA 聚 合 酶 与 35、 10 序 列 的 结 合 ， 进 而 促 进 Plac 介 导 的 转 录 。 RNA聚 合 酶RNA聚 合 酶基 因 工 程 中 使 用 的 lac 启 动 子 均 为 抗 葡 萄 糖 代 谢 阻 遏 的 突 变 型 ， 即 Plac UV5 cAMP葡 萄 糖 代 谢cAMP浓 度 降 低 cAMPCAPCAP Lac 表 达 系 统 lac UV5 突 变 体

5、 Plac UV5 突 变 体 能 够 在 没 有 CAP 存 在 的 情 形 下 非 常 有 效 的 起 始 转 录 ， 受 它 控 制 的 基 因 在 转 录 水 平 上 只 受 lacI 的 调 控 ， 因 此 用 它 构 建 的 表 达 载 体 在 使 用 时 比 野 生 型 Plac 更 易 操 作 。 Lac 表 达 系 统 负 调 节 因 子 lac I 在 无 诱 导 物 情 形 下 ， lacI 基 因 产 物 形 成 四 聚 体 阻 遏 蛋 白 ， 与 启 动 子 下 游 的 操 纵 基 因 紧 密 结 合 ， 阻 止 转 录 的 起 始 。 lacI Plac lacO

6、lacZ lacY lacARNA聚 合 酶 基 底 水 平 转 录 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高 效 转 录RNA聚 合 酶IPTG mRNA Tac 表 达 系 统 tac 启 动 子 是 由 trp 的 35 序 列 和 lacUV5 的 10 序 列 拼 接 而 成 的 杂 合 启 动 子 。 调 控 模 式 与 lacUV5 相 似 ， 但 mRNA 转 录 水 平 更 高 于 trp 和 lacUV5 启 动 子 （ P tac = 3 P trp = 11 P lac） ， 因 此 在 要 求 有 较 高 基 因 表 达 水 平 的 情 况 下 ，

7、 选 用 tac 启 动 子 比 用 lacUV5 启 动 子 更 优 越 。 lac、 tac 启 动 子 对 宿 主 菌 的 要 求 在 普 通 大 肠 杆 菌 中 ， LacI 阻 遏 蛋 白 仅 能 满 足 细 胞 染 色 体 上 lac 操 纵 子 转 录 调 控 的 需 要 。 当 多 拷 贝 的 lacO 随 着 带 有 lacUV5、 tac 启 动 子 的 表 达 质 粒 转 化 进 入 大 肠 杆 菌 后 ， LacI 阻 遏 蛋 白 与 lacO 的 比 例 显 著 下 降 ， 无 法 保 证 每 一 个 lacO 都 能 获 得 足 够 的 LacI 阻 遏 蛋 白 参

8、 与 转 录 调 控 。 表 现 为 在 无 诱 导 物 存 在 的 情 形 下 ， lacUV5、 tac 启 动 子 有 较 高 的 本 底 转 录 。 lac、 tac 启 动 子 对 宿 主 菌 的 要 求 为 了 使 以 Lac、 Tac 表 达 系 统 具 有 严 紧 调 控 外 源 基 因 转 录 的 能 力 ， 一 种 能 产 生 过 量 的 LacI 阻 遏 蛋 白 的 lacI 基 因 的 突 变 体 lacIq 被 应 用 于 表 达 系 统 。 大 肠 杆 菌 JM109 等 菌 株 的 基 因 型 均 为 lacIq ， 常 被 选 用 为 Lac、 Tac 表 达

9、系 统 的 宿 主 菌 。 但 是 这 些 菌 株 也 只 能 对 低 拷 贝 的 表 达 载 体 实 现 严 紧 调 控 ， 在 使 用 高 拷 贝 复 制 子 构 建 表 达 载 体 时 ， 仍 能 观 察 到 较 高 水 平 的 本 底 转 录 。 需 在 表 达 载 体 中 插 入 lacIq 基 因 以 保 证 有 较 多 的 LacI 阻 遏 蛋 白 产 生 。 lac、 tac 表 达 系 统 存 在 的 问 题 IPTG 用 于 诱 导 lac、 tac 启 动 子 的 转 录 ， 但 由 于 IPTG 本 身 具 有 一 定 的 毒 性 。 从 安 全 角 度 ， 对 表 达

10、 和 制 备 用 于 医 疗 目 的 的 重 组 蛋 白 并 不 适 合 。 一 些 国 家 规 定 在 生 产 人 用 重 组 蛋 白 质 的 生 产 工 艺 中 不 能 使 用 IPTG 解 决 方 法 lac 和 tac 启 动 子 的 转 录 受 温 度 严 紧 调 控 乳 糖 替 代 IPTG 诱 导 lac 和 tac 启 动 子 的 转 录 lac、 tac 表 达 系 统 存 在 的 问 题 lac 和 tac 启 动 子 的 转 录 受 温 度 严 紧 调 控 把 阻 遏 蛋 白 LacI 的 温 度 敏 感 突 变 体 lacI(ts)、 lacIq(ts)插 入 表 达

11、载 体 或 整 合 到 染 色 体 后 ， 均 能 使 lac 和 tac 启 动 子 的 转 录 受 到 温 度 严 紧 调 控 在 较 低 温 度 （ 30 ） 时 抑 制 ， 在 较 高 温 度 （ 42 ） 时 开 放 。 用 乳 糖 替 代 IPTG 诱 导 lac 和 tac 启 动 子 的 转 录 乳 糖 在 b-半 乳 糖 苷 酶 作 用 下 生 成 异 乳 糖 ， 异 乳 糖 具 有 诱 导 剂 的 作 用 这 一 过 程 涉 及 乳 糖 的 转 运 和 转 化 ， 其 效 率 受 到 多 种 因 素 的 影 响 和 制 约 因 此 乳 糖 诱 导 的 有 效 剂 量 大 大

12、 高 于 IPTG。 乳 糖 本 身 作 为 一 种 碳 源 可 以 被 大 肠 杆 菌 代 谢 利 用 ， 较 多 的 乳 糖 存 在 也 会 导 致 菌 体 生 理 及 生 长 特 性 变 化 。 乳 糖 替 代 lPTG 作 为 诱 导 剂 的 研 究 要 与 发 酵 工 艺 结 合 起 来 ， 才 能 显 示 其 良 好 的 前 景 。 转 录 调 控 机 理 色 氨 酸 启 动 子 Ptrp 受 色 氨 酸 -阻 遏 蛋 白 复 合 物 的 阻 遏 ， 转 录 呈 基 底 状 态 。 在 培 养 系 统 中 去 除 色 氨 酸 或 者 加 入 3-吲 哚 丙 烯 酸 （ IAA） ，

13、 便 可 有 效 地 解 除 阻 遏 抑 制 作 用 。 在 正 常 的 细 菌 培 养 体 系 中 ， 除 去 色 氨 酸 是 困 难 的 ， 因 此 基 因 工 程 中 往 往 添 加 IAA 诱 导 Ptrp 介 导 的 目 的 基 因 表 达启 动 子Trp 表 达 系 统 以 大 肠 杆 菌 trp 操 纵 子 调 控 机 理 为 基 础 设 计 、 构 建 的 表 达 系 统 Trp 表 达 系 统 Ptrp OtrpRNA聚 合 酶 基 底 水 平 转 录高 效 转 录mRNA Ptrp Otrp去 除色 氨 酸 高 效 转 录mRNA Ptrp Otrp加 入IAA RNA聚

14、合 酶RNA聚 合 酶 PL 和 PR 表 达 系 统 以 l 噬 菌 体 早 期 转 录 启 动 子 PL 、 PR 为 核 心 构 建 的 表 达 系 统 在 野 生 型 l 噬 菌 体 中 ， PL 、 PR 启 动 子 转 录 与 否 决 定 了 l 噬 菌 体 进 入 裂 解 循 环 还 是 溶 源 循 环 。 启 动 子 PL 和 PR 表 达 系 统 转 录 调 控 的 机 理 由 l 噬 菌 体 PE 启 动 子 控 制 的 cI 基 因 的 产 物 是 PL 、 PR 启 动 子 转 录 的 阻 遏 物 。 cI 基 因 的 产 物 在 大 肠 杆 菌 宿 主 中 的 浓 度

15、 取 决 于 一 系 列 宿 主 与 噬 菌 体 因 子 之 间 的 错 综 复 杂 的 平 衡 关 系 。 由 于 通 过 细 胞 因 子 来 控 制 cI 基 因 产 物 的 产 生 和 消 失 是 相 当 困 难 的 。 因 此 P L 、 PR 表 达 系 统 都 选 用 温 度 敏 感 突 变 体 cI 857(ts) 的 基 因 产 物 来 调 控 PL 、 PR 启 动 子 的 转 录 。 在 较 低 温 度 （ 30 ） 时 以 活 性 形 式 存 在 在 较 高 温 度 （ 42 ） 时 失 活 脱 落 PL 和 PR 表 达 系 统 宿 主 菌 中 没 有 cI 基 因 产

16、 物 ， PL、 PR 启 动 子 的 高 强 度 直 接 转 录 ， 带 有 PL 或 PR 启 动 子 的 表 达 载 体 在 普 通 大 肠 杆 菌 中 相 当 不 稳 定 。 对 宿 主 菌 的 要 求 用 溶 源 化 l 噬 菌 体 的 大 肠 杆 菌 作 PL、 PR 启 动 子 表 达 载 体 的 宿 主 菌 N4830-1， POP2136 等 菌 株 已 经 溶 源 化 cI 857(ts) l 噬 菌 体 ， 可 用 作 表 达 外 源 基 因 时 的 宿 主 菌 。 把 cI 857(ts) 基 因 组 装 在 表 达 载 体 上 宿 主 菌 选 择 范 围 更 大 PL

17、 和 PR 表 达 系 统 存 在 的 问 题 由 于 PL 和 PR 表 达 系 统 诱 导 时 不 加 化 学 诱 导 剂 ， 成 本 又 低 廉 ， 最 初 几 个 在 大 肠 杆 菌 中 制 备 的 药 用 重 组 蛋 白 质 都 采 用 PL 或 PR 表 达 系 统 。 缺 陷 在 热 脉 冲 诱 导 过 程 中 ， 大 肠 杆 菌 热 休 克 蛋 白 的 表 达 也 会 被 激 活 ， 其 中 一 些 是 蛋 白 水 解 酶 ， 有 可 能 降 解 所 表 达 的 重 组 蛋 白 。 在 大 体 积 发 酵 培 养 菌 体 时 ， 通 过 热 平 衡 交 换 方 式 把 培 养

18、温 度 从30 提 高 到 42 需 要 较 长 的 时 间 ， 这 种 缓 慢 的 升 温 方 式 影 响 诱 导 效 果 ， 对 重 组 蛋 白 表 达 量 有 一 定 的 影 响 。 T7 表 达 系 统 大 肠 杆 菌 T7 噬 菌 体 具 有 一 套 专 一 性 非 常 强 的 转 录 体 系 ， 利 用 这 一 体 系 中 的 元 件 为 基 础 构 建 的 表 达 系 统 称 为 T7 表 达 系 统 。 T7 表 达 系 统 T7 噬 菌 体 基 因 1 编 码 的 T7 RNA 聚 合 酶 选 择 性 的 激 活 T7 噬 菌 体 启 动 子 的 转 录 。 T7 RNA 聚

19、 合 酶 活 性 高 ， 其 合 成 RNA 的 速 度 比 大 肠 杆 菌 RNA 聚 合 酶 快 5倍 左 右 。 并 可 以 转 录 某 些 不 能 被 大 肠 杆 菌 RNA聚 合 酶 有 效 转 录 的 序 列 。 在 细 胞 中 存 在 T7 RNA聚 合 酶 和 T7噬 茵 体 启 动 子 的 情 形 下 ， 大 肠 杆 菌 宿 主 本 身 基 因 的 转 录 竞 争 不 过 T7 噬 菌 体 转 录 体 系 ， 最 终 受 T7噬 菌 体 启 动 子 控 制 的 基 因 的 转 录 达 到 很 高 的 水 平 。 T7 表 达 系 统 转 录 调 控 的 机 理 T7 噬 菌

20、体 启 动 子 的 转 录 完 全 依 赖 于 T7 RNA 聚 合 酶 ， 因 此 T7 RNA 聚 合 酶 的 转 录 调 控 模 式 就 决 定 了 表 达 系 统 的 调 控 方 式 。 化 学 诱 导 型 温 度 诱 导 型 双 质 粒 系 统 T7 RNA 聚 合 酶T7 启 动 子 目 的 基 因 T7 RNA 聚 合 酶 基 因？ 启 动 子 T7 表 达 系 统 转 录 调 控 的 机 理 化 学 诱 导 型 噬 菌 体 DE3 是 l 噬 菌 体 的 衍 生 株 ， 一 段 含 有 lacI、 lacUV5 启 动 子 和 T7 RNA 聚 合 酶 基 因 的 DNA 片

21、段 被 插 入 其 int 基 因 中 用 噬 菌 体 DE3 的 溶 源 菌 作 为 表 达 载 体 的 宿 主 菌 ， 调 控 方 式 为 化 学 诱 导 型 ， 类 似 于 Lac 表 达 系 统 。 T7 RNA 聚 合 酶 基 因 lac 启 动 子E.Coli （ DE3）T7 启 动 子 目 的 基 因T7 RNA 聚 合 酶IPTG诱 导 T7 表 达 系 统 转 录 调 控 的 机 理 温 度 诱 导 型 PL 启 动 子 控 制 T7 RNA 聚 合 酶 基 因 ， 通 过 热 诱 导 方 式 激 发 T7 噬 菌 体 启 动 子 的 转 录 。 这 种 方 式 可 以 使

22、 本 底 转 录 降 到 很 低 的 水 平 ， 尤 其 适 用 于 表 达 对 大 肠 杆 菌 宿 主 有 毒 性 的 重 组 蛋 白 质 。 T7 RNA 聚 合 酶 基 因 PL 启 动 子E.Coli （ CE6）T7 启 动 子 目 的 基 因T7 RNA 聚 合 酶热 诱 导cI857 T7 表 达 系 统 转 录 调 控 的 机 理 双 质 粒 系 统 一 个 质 粒 带 有 T7 RNA 聚 合 酶 基 因 ， 另 一 个 质 粒 带 有 T7 启 动 子 和 目 的 基 因 两 个 质 粒 的 复 制 子 和 抗 性 标 记 不 能 相 同 调 控 方 式 为 控 制 T7

23、RNA 聚 合 酶 的 启 动 子 调 控 类 型 T7 RNA 聚 合 酶热 诱 导 T7 启 动 子 目 的 基 因 T7 RNA 聚 合 酶 基 因 PL 启 动 子 cI857 p15A ori KanRColE1 ori AmpR T7 表 达 系 统 存 在 的 问 题 T7 表 达 系 统 表 达 目 的 基 因 的 水 平 是 目 前 所 有 表 达 系 统 中 最 高 的 ， 但 也 不 可 避 免 出 现 在 相 对 较 高 的 本 底 转 录 ， 如 果 目 的 基 因 产 物 对 大 肠 杆 菌 宿 主 有 毒 性 ， 会 影 响 细 胞 的 生 长 。 解 决 办 法

24、 之 一 在 表 达 系 统 中 低 水 平 表 达 T7 溶 菌 酶 基 因 。 因 为 T7 溶 菌 酶 除 了 作 用 于 大 肠 杆 菌 细 胞 壁 上 肽 聚 糖 外 ， 还 能 与 T7 RNA 聚 合 酶 结 合 抑 制 其 转 录 的 活 性 。 目 前 T7 溶 菌 酶 基 因 都 通 过 共 转 化 质 拉 导 入 表 达 系 统 ， 它 能 明 显 降 低 本 底 转 录 ， 但 对 诱 导 后 目 的 基 因 的 表 达 水 平 无 明 显 影 响 。 营 养 调 控 型 采 用 大 肠 杆 菌 碱 性 磷 酸 酯 酶 基 因 phoA 启 动 子 或 甘 油 3-磷

25、酸 转 移 系 统 ugp 启 动 子 构 建 表 达 载 体 。 这 两 个 启 动 子 受 在 培 养 基 中 的 无 机 磷 （ Pi） 浓 度 调 控 （ Pi 5mmol/L 时 抑 制 ， Pi 1mmol/L 时 激 活 )， 具 有 较 高 的 转 录 水 平 。 糖 原 调 控 型 采 用 的 有 大 肠 杆 菌 半 乳 糖 转 移 系 统 （ mglBAEC) mgl 启 动 子 或 沙 门 氏 菌 阿 拉 伯 糖 基 因 araB 启 动 子 构 建 表 达 载 体 。 这 两 个 启 动 子 受 葡 萄 糖 抑 制 ， 岩 藻 糖 和 阿 拉 伯 糖 是 它 们 的 诱

26、 导 物 。 其 调 控 机 理 类 似 于 Lac 表 达 系 统 . pH调 控 型 采 用 大 肠 杆 菌 赖 氨 酸 脱 羧 酶 基 因 cadA 启 动 子 构 建 表 达 载 体 。 cadA 启 动 子 受 培 养 基 中 H+ 浓 度 ， 即 pH 值 调 控 。 （ 在 pH 8 时 抑 制 ， pH 6时 激 活 ， pH = 6时 转 录 活 力 最 高 ） 。 该 表 达 系 统 要 求 菌 体 发 酵 温 度 控 制 在 27 30 之 间 才 能 使 目 的 基 因 得 到 稳 定 的 表 达 . 溶 氧 调 控 型 采 用 大 肠 杆 菌 丙 酮 酸 甲 酸 裂

27、解 酶 基 因 pfl 启 动 子 ， 硝 基 还 原 酶 基 因 nirB 启 动 子 或 透 明 颤 菌 血 红 蛋 白 基 因 vgb 启 动 子 构 建 表 达 载 体 。 这 些 启 动 子 中 都 含 有 对 氧 响 应 的 调 节 因 子 fnr 的 作 用 位 点 。 在 富 氧 条 件 下 转 录 被 抑 制 ， 在 贫 氧 或 微 氧 条 件 下 转 录 被 激 活 。 溶 氧 调 控 型 大 肠 杆 菌 GJ100 有 透 明 颤 菌 血 红 蛋 白 基 因 （ vgb） 启 动 子 控 制 下 的 T7 RNA 聚 合 酶 基 因 表 达 质 粒 ， vgb 基 因 的

28、 转 录 是 受 环 境 溶 氧 浓 度 调 控 的 ， 在 贫 氧 条 件 下 vgb 基 因 的 启 动 子 被 激 活 。 因 此 ， 用 大 肠 杆 菌 GJ100 作 为 宿 主 时 ， 表 达 系 统 调 控 方 式 为 贫 氧 诱 导 型 ， 菌 体 发 酵 时 的 溶 氧 浓 度 可 以 通 过 控 制 搅 拌 转 速 和 通 气 量 加 以 调 节 ， 与 其 他 调 控 模 式 相 比 更 适 合 于 产 业 化 生 产 过 程 。 生 物 素 调 控 型 用 大 肠 杆 菌 生 物 素 操 纵 子 及 其 调 控 区 构 建 表 达 载 体 ， 菌 体 生 长 过 程 中

29、 生 物 素 会 不 断 消 耗 ， 当 浓 度 到 达 2ng/ml 以 下 时 启 动 子 被 激 活 。 能 够 在 没 有 外 界 的 物 理 ， 化 学 信 号 的 介 入 条 件 下 自 动 诱 导 表 达 目 的 基 因 是 这 类 表 达 载 体 的 特 点 ， 其 缺 陷 是 不 容 易 精 确 控 制 自 动 诱 导 的 时 刻 。 强 化 转 录 终 止 的 必 要 性 外 源 基 因 在 强 启 动 子 的 控 制 下 表 达 ， 容 易 发 生 转 录 过 头 现 象 ， 即 RNA 聚 合 酶 滑过 终 止 子 结 构 继 续 转 录 质 粒 上 邻 近 的 DNA

30、 序 列 ， 形 成 长 短 不 一 的 mRNA 混 合 物 过长 转 录 物 的 产 生 在 很 大 程 度 上 会 影 响 外 源 基 因 的 表 达 ， 其 原 因 如 下 ： 转 录 产 物 越 长 ， RNA聚 合 酶 转 录 一 分 子 mRNA 所 需 的 时 间 就 相 应 增 加 ， 外 源 基 因 本 身 的 转 录 效 率 下 降 ； 如 果 外 源 基 因 下 游 紧 接 有 载 体 上 的 其 它 重 要 基 因 或 DNA功 能 区 域 ， 如 选 择 性 标 记 基 因 和 复 制 子 结 构 等 ， 则 RNA聚 合 酶 在 此 处 的 转 录 可 能 干 扰

31、 质 粒 的 复 制 及 其 它 生 物 功 能 ， 甚 至 导 致 重 组 质 粒 的 不 稳 定 性 ； 过 长 的 mRNA 往 往 会 产 生 大 量 无 用 的 蛋 白 质 ， 增 加 工 程 菌 无 谓 的 能 量 消 耗 ； 更 为 严 重 的 是 ， 过 长 的 转 录 物 往 往 不 能 形 成 理 想 的 二 级 结 构 ， 从 而 大 大 降 低 外 源 基 因 编 码 产 物 的 翻 译 效 率 终 止 子 强 终 止 子 的 选 择 与 使 用 目 前 外 源 基 因 表 达 质 粒 中 常 用 的 终 止 子 是 来 自 大 肠 杆 菌 rRNA 操 纵 子 上 的

32、 rrnT1T2 以 及 T7 噬 菌 体 DNA 上 的 Tf。 对 于 一 些 终 止 作 用 较 弱 的 终 止 子 ， 通 常 可 以 采 用 二 聚 体 终 止 子 串 联 的 特 殊 结 构 ， 以 增 强 其 转 录 终 止 作 用终 止 子 核 糖 体 结 合 位 点 外 源 基 因 在 大 肠 杆 菌 细 胞 中 的 高 效 表 达 不 仅 取 决 于 转 录 启 动 的 频 率 ， 而 且 在 很 大 程 度 上 还 与 mRNA 的 翻 译 起 始 效 率 密 切 相 关 。 大 肠 杆 菌 细 胞 中 结 构 不 同 的 mRNA分 子 具 有 不 同 的 翻 译 效

33、率 ， 它们 之 间 的 差 别 有 时 可 高 达 数 百 倍 。 mRNA 翻 译 的 起 始 效 率 主 要 由 其 5 端 的 结 构 序 列 所 决 定 ， 称 为 核糖 体 结 合 位 点 （ RBS） 核 糖 体 结 合 位 点 核 糖 体 结 合 位 点 大 肠 杆 菌 核 糖 体 结 合 位 点 包 括 下 列 四 个 特 征 结 构 要 素 ： 位 于 翻 译 起 始 密 码 子 上 游 的 68 个 核 苷 酸 序 列 5 UAAGGAGG 3 即 Shine-Dalgarno（ SD） 序 列 ， 它 通 过 识 别 大 肠 杆 菌 核 糖 体 小 亚 基 中 的 16

34、S rRNA 3 端 区 域 3 AUUCCUCC 5 并 与 之 专 一 性 结 合 将 mRNA 定 位 于 核 糖 体 上 ， 从 而 启 动 翻 译 ； 翻 译 起 始 密 码 子 ， 大 肠 杆 菌 绝 大 部 分 基 因 以 AUG作 为 阅 读 框 架 的 起 始 位 点 ， 有 些 基 因 也 使 用 GUG 或 UUG 作 为 翻 译 起 始 密 码 子 SD 序 列 与 翻 译 起 始 密 码 子 之 间 的 距 离 及 碱 基 组 成 基 因 编 码 区 5 端 若 干 密 码 子 的 碱 基 序 列 核 糖 体 结 合 位 点 核 糖 体 结 合 位 点 对 外 源 基

35、 因 表 达 的 影 响 SD 序 列 的 影 响 一 般 来 说 ， mRNA 与 核 糖 体 的 结 合 程 度 越 强 ， 翻 译 的 起 始 效 率 就 越 高 ， 而 这 种 结 合 程 度 主 要 取 决 于 SD （ UAAGGAGG） 序 列 与 16S rRNA 的 碱 基 互 补 性 ， 其 中 以 GGAG 四 个 碱 基 序 列 尤 为 重 要 。 对 多 数 基 因 而 言 ， 上 述 四 个 碱 基 中 任 何 一 个 换 成 C 或 T， 均 会 导 致 翻 译 效 率 大 幅 度 降 低核 糖 体 结 合 位 点 核 糖 体 结 合 位 点 对 外 源 基 因

36、表 达 的 影 响 SD 序 列 与 起 始 密 码 子 之 间 的 序 列 的 影 响 SD 序 列 下 游 的 碱 基 若 为 AAAA 或 UUUU， 翻 译 效 率 最 高 ； 而 CCCC 或 GGGG 的 翻 译 效 率 则 分 别 是 最 高 值 的 50% 和 25%。 紧 邻 AUG 的 前 三 个 碱 基 成 份 对 翻 译 起 始 也 有 影 响 。 对 于 大 肠 杆 菌 b-半 乳 糖 苷 酶 的 mRNA 而 言 ， 在 这 个 位 置 上 最 佳 的 碱 基 组 合 是 UAU 或 CUU， 如 果 用 UUC、 UCA 或 AGG 取 代 之 ， 则 酶 的 表

37、 达 水 平 低 20 倍核 糖 体 结 合 位 点 核 糖 体 结 合 位 点 对 外 源 基 因 表 达 的 影 响 SD 序 列 与 起 始 密 码 子 之 间 的 距 离 的 影 响 SD 序 列 与 起 始 密 码 子 AUG 之 间 的 精 确 距 离 保 证 了 mRNA 在 核 糖 体 上 定 位 后 ， 翻 译 起 始 密 码 子 AUG 正 好 处 于 核 糖 体 复 合 物 结 构 中 的 P 位 ， 这 是 翻 译 启 动 的 前 提 条 件 。 在 很 多 情 况 下 ， SD 序 列 位 于 AUG 之 前 大 约 七 个 碱 基 处 ， 在 此 间 隔 中 少 一

38、 个 碱 基 或 多 一 个 碱 基 ， 均 会 导 致 翻 译 起 始 效 率 不 同 程 度 的 降 低 核 糖 体 结 合 位 点 核 糖 体 结 合 位 点 对 外 源 基 因 表 达 的 影 响 起 始 密 码 子 及 其 后 续 若 干 密 码 子 的 影 响 大 肠 杆 菌 中 的 起 始 tRNA 分 子 可 以 同 时 识 别 AUG、 GUG 和 UUG 三 种 起 始 密 码 子 ， 但 其 识 别 频 率 并 不 相 同 ， 通 常 GUG 为 AUG 的 50%， 而 UUG 只 及 AUG 的 25%。 除 此 之 外 ， 从 AUG 开 始 的 前 几 个 密 码

39、 子 碱 基 序 列 也 至 关 重 要 ， 至 少 这 一 序 列 不 能 与 mRNA 的 5 端 非 编 码 区 形 成 茎 环 结 构 ， 否 则 便 会 严 重 干 扰 mRNA 在 核 糖 体 上 的 准 确 定 位 目 前 广 泛 用 于 外 源 基 因 表 达 的 大 肠 杆 菌 表 达 型 质 粒 上 ， 均 含 有 与 启 动 子 来 源 相 同 的 核 糖 体 结 合 位 点 序 列 ， 序 列 和 间 隔 是 最 佳 的 。 核 糖 体 结 合 位 点 不 同 的 生 物 ， 甚 至 同 种 生 物 不 同 的 蛋 白 质 编 码 基 因 ， 对 简 并 密 码 子使

40、用 频 率 并 不 相 同 ， 具 有 一 定 的 偏 爱 性 ， 其 决 定 因 素 是 ：生 物 基 因 组 中 的 碱 基 含 量 在 富 含 AT 的 生 物 （ 如 单 链 DNA噬 菌 体 X174） 基 因 组 中 ， 密 码 子 第 三 位 上 的 U 和 A 出 现 的 频 率 较 高 ； 在 GC 丰 富 的 生 物 （ 如 链 霉 菌 ） 基 因 组 中 ， 第 三 位 上 含 有 G 或 C 的 简 并 密 码 子 占 90% 以 上 的 绝 对 优 势密 码 子 与 反 密 码 子 相 互 作 用 的 自 由 能 性 中 等 强 度 规 律 如 GGG、 CCC、 G

41、CG、 GGC、 AAA、 UUU、 AUA、 UAU 等 使 用 少 如 GUG、 CAC、 UCG、 AGC、 ACA、 UGU、 AUC、 UUG 等 使 用 多 细 胞 内 tRNA 的 含 量 密 码 子生 物 体 对 密 码 子 的 偏 爱 性 密 码 子密 码 子 偏 爱 性 对 外 源 基 因 表 达 的 影 响 由 于 原 核 生 物 和 真 核 生 物 基 因 组 中 密 码 子 的 使 用 频 率 具 有 较 大 程 大的 差 异 性 ， 因 此 外 源 基 因 尤 其 是 高 等 哺 乳 动 物 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 高 效 翻译 的 一 个 重 要 因 素

42、是 密 码 子 的 正 确 选 择 。 一 般 而 言 ， 有 两 种 策 略 可 以 使 外 源 基 因 上 的 密 码 子 在 大 肠 杆 菌 细 胞中 获 得 最 佳 表 达 ： 外 源 基 因 全 合 成 同 步 表 达 相 关 tRNA 编 码 基 因 质 粒 拷 贝 数质 粒 拷 贝 数 对 细 菌 生 长 代 谢 的 影 响 目 前 实 验 室 里 广 泛 使 用 的 表 达 型 质 粒 在 每 个 大 肠 杆 菌 细 胞 中 可 达 数 百甚 至 上 千 个 拷 贝 ， 质 粒 的 扩 增 过 程 通 常 发 生 在 受 体 细 胞 的 对 数 生 长 期 内 ，而 此 时 正

43、 是 细 菌 生 理 代 谢 最 旺 盛 的 阶 段 。 质 粒 分 子 的 过 度 增 殖 以 及 其 后 目的 基 因 的 高 效 表 达 势 必 会 影 响 受 体 细 胞 的 生 长 代 谢 ， 进 而 导 致 重 组 质 粒 的不 稳 定 性 以 及 目 的 基 因 宏 观 表 达 水 平 的 下 降 解 决 上 述 难 题 的 一 种 有 效 策 略 是 将 重 组 质 粒 的 扩 增 纳 入 可 控 制 的 轨 道 外 源 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达蛋 白 质 的 合 成 是 在 细 胞 之 中 进 行 的 目 标 蛋 白 在 细 胞 质 中 表 达 的 主 要

44、优 点 是 ： 表 达 质 粒 的 构 建 比 较 简 单 ； 能 够 达 到 很 高 的 目 标 蛋 白 表 达 量 ， 一 般 可 以 达 到 占 细 胞 总 蛋 白 的 20% 40%。 目 标 蛋 白 在 大 肠 杆 菌 系 统 表 达 的 形 式 有 二 种 ： 在 细 胞 内 表 现 为 不 溶 性 的 包 涵 体 颗 粒 包 涵 体 存 在 于 大 肠 杆 菌 细 胞 质 中 在 细 胞 内 表 现 为 可 溶 性 的 蛋 白 质 可 溶 性 的 目 标 蛋 白 质 除 可 存 在 于 细 胞 质 中 外 ， 还 可 借 助 于 本 身 的 功 能 序 列 和 大 肠 杆 菌 蛋

45、 白 质 加 工 、 运 输 体 系 ， 最 终 分 泌 到 周 质 空 间 ， 或 外 泌 到 培 养 液 中 。 大 肠 杆 菌 基 因 工 程 菌 的 构 建 策 略 包 涵 体 型 异 源 蛋 白 的 表 达 分 泌 型 异 源 蛋 白 的 表 达 融 合 型 异 源 蛋 白 的 表 达 寡 聚 型 异 源 蛋 白 的 表 达 整 合 型 异 源 蛋 白 的 表 达 蛋 白 酶 抗 性 或 缺 陷 型 表 达 系 统 的 构 建外 源 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达 包 涵 体 及 其 性 质 在 某 些 生 长 条 件 下 ， 大 肠 杆 菌 能 积 累 某 种 特 殊

46、的 生 物 大 分 子 ， 它 们 致密 地 集 聚 在 细 胞 内 ， 或 被 膜 包 裹 或 形 成 无 膜 裸 露 结 构 ， 这 种 水 不 溶 性 的 结构 称 为 包 涵 体 （ Inclusion Bodies， IB） 。 富 含 蛋 白 质 的 包 涵 体 多 见 于 生 长 在 含 有 氨 基 酸 类 似 物 培 养 基 的 大 肠 杆菌 细 胞 中 ， 由 这 些 氨 基 酸 类 似 物 所 合 成 的 蛋 白 质 往 往 会 丧 失 其 理 化 特 性 和生 物 功 能 ， 从 而 集 聚 形 成 包 涵 体 。 由 高 效 表 达 质 粒 构 建 的 大 肠 杆 菌

47、工 程 菌 大 量 合 成 非 天 然 性 的 同 源 或 异源 蛋 白 质 ， 后 者 在 一 般 情 况 下 也 以 包 涵 体 的 形 式 存 在 于 细 菌 细 胞 内 。 除 此 之 外 ， 包 涵 体 中 还 含 有 少 量 的 DNA、 RNA和 脂 多 糖 等 非 蛋 白 分 子 包 涵 体 型 异 源 蛋 白 的 表 达 以 包 涵 体 形 式 表 达 目 的 蛋 白 的 优 缺 点 包 涵 体 表 达 形 式 的 优 点 在 一 定 程 度 上 保 持 表 达 产 物 的 结 构 稳 定 能 够 避 免 细 胞 内 蛋 白 水 解 酶 的 作 用 ， 有 利 于 目 标 蛋

48、 白 的 富 集 简 化 外 源 基 因 表 达 产 物 的 分 离 操 作 包 涵 体 的 水 难 溶 性 及 其 密 度 远 大 于 其 它 细 胞 碎 片 和 细 胞 成 分 ， 菌 体 经 超 声 波 裂 解 后 ， 直 接 通 过 高 速 离 心 即 可 将 重 组 异 源 蛋 白 从 细 菌 裂 解 物 中 分 离 出 来 能 够 表 达 对 大 肠 杆 菌 宿 主 有 毒 或 有 致 死 效 应 的 目 标 蛋 白。 包 涵 体 型 异 源 蛋 白 的 表 达 以 包 涵 体 形 式 表 达 目 的 蛋 白 的 优 缺 点 包 涵 体 表 达 形 式 的 缺 点 以 包 涵 体

49、形 式 表 达 的 重 组 蛋 白 丧 失 了 原 有 的 生 物 活 性 ， 必 须 通 过 有 效 的 变 性 复 性 操 作 ， 才 能 回 收 得 到 具 有 正 确 空 间 构 象 （ 因 而 具 有 生 物 活 性 ） 的 目 标 蛋 白 ， 因 此 包 涵 体 变 复 性 操 作 的 效 率 对 目 标 产 物 的 收 率 至 关 重 要 。 经 过 复 性 处 理 的 目 标 蛋 白 不 一 定 能 完 全 恢 复 原 来 的 生 物 学 活 性 ， 有 时 甚 至 完 全 得 不 到 有 活 性 的 蛋 白 蛋 ， 尤 其 当 目 标 蛋 白 分 子 中 的 Cys残 基 数

50、 目 较 高 时 ， 体 外 复 性 蛋 白 质 的 成 功 率 相 当 低 ， 一 般 不 超 过 30% 复 性 处 理 工 艺 可 使 目 标 蛋 白 的 制 备 成 本 上 升 。 包 涵 体 型 异 源 蛋 白 的 表 达 包 涵 体 的 变 性 与 复 性 操 作 包 涵 体 的 溶 解 与 变 性 包 涵 体 的 溶 解 与 变 性 的 主 要 任 务 是 拆 开 错 配 的 二 硫 键 和 次 级 键 。 在 人 工 条 件 下 ， 使 包 涵 体 溶 解 并 重 新 进 入 复 性 途 径 中 。 能 有 效 促 进 包 涵 体 溶 解 变 性 的 试 剂 和 条 件 包 括

51、 ： 清 洗 剂 SDS、 正 十 二 醇 肌 氨 酸 ， 廉 价 ， 但 影 响 复 性 和 纯 化 促 溶 剂 盐 酸 胍 、 尿 素 ， 前 者 昂 贵 ， 尿 素 便 宜 ， 但 常 被 自 发 形 成 的 氰 酸 盐 污 染 ， 后 者 能 与 多 肽 链 中 的 氨 基 反 应 混 合 溶 剂 如 尿 素 与 醋 酸 、 二 甲 基 砜 等 联 合 使 用 ， 溶 解 力 增 强 极 端 pH 廉 价 ， 但 许 多 蛋 白 质 在 极 端 pH条 件 下 发 生 修 饰 反 应 包 涵 体 型 异 源 蛋 白 的 表 达 包 涵 体 的 变 性 与 复 性 操 作 包 涵 体 的

52、 复 性 与 重 折 叠 （ refolding） 包 涵 体 的 复 性 与 重 折 叠 的 主 要 任 务 ： 将 多 肽 链 中 被 拆 开 的 游 离 巯 基 重 新 折 叠 通 过 次 级 键 的 形 成 使 蛋 白 质 复 性包 涵 体 型 异 源 蛋 白 的 表 达 在 细 胞 内 表 现 为 可 溶 性 的 蛋 白 质 目 标 蛋 白 以 可 溶 性 蛋 白 质 形 式 表 达 虽 然 可 以 避 免 包 涵 体 复 性带 来 的 问 题 ， 但 是 也 有 一 定 的 缺 陷 ， 主 要 表 现 为 大 肠 杆 菌 本 身存 在 于 细 胞 质 中 的 蛋 白 质 往 往 只

53、 含 有 少 量 的 ， 甚 至 没 有 半 胱 氨酸 残 基 。 富 含 半 胱 氨 酸 残 基 ， 需 要 形 成 二 硫 键 的 蛋 白 质 大 部 份被 转 运 到 细 胞 的 其 他 部 位 。 分 泌 型 异 源 蛋 白 的 表 达 这 是 因 为 大 肠 杆 菌 细 胞 质 微 环 境 的 氧 化 还 原 态 势 不 利 于 蛋 白 质 二 硫 键的 形 成 ， 而 且 缺 少 一 种 形 成 二 硫 键 所 必 须 的 体 系 。 一 些 需 要 通 过 二 硫 键 的 形成 来 维 持 其 构 象 的 目 标 蛋 白 在 大 肠 杆 菌 的 细 胞 质 中 往 往 不 能 正

54、 确 折 叠 。 解 决 这 一 问 题 的 途 径 之 一 是 用 大 肠 杆 菌 氧 硫 还 蛋 白 还 原 酶 基 因 trxB 缺 陷 株 作 为 宿 主 菌 表 达 目 标 蛋 白 。 研 究 表 明 trxB 缺 陷 株 细 胞 质 的 氧 化还 原 态 势 发 生 了 变 化 ， 蛋 白 质 在 trxB 缺 陷 株 的 细 胞 质 中 能 够 形 成 二 硫 键 。这 一 菌 株 对 于 表 达 结 构 复 杂 的 蛋 白 质 而 言 是 一 个 相 当 重 要 的 工 具 。分 泌 型 异 源 蛋 白 的 表 达 在 细 胞 质 中 直 接 表 达 不 带 有 前 导 序 列

55、 的 成 熟 蛋 白 质 在 细 胞 质 中 直 接 表 达 不 带 有 前 导 序 列 的 成 熟 蛋 白 质 需 要 起 始 密 码 ， 通常 为 编 码 甲 硫 氨 酸 的 ATG。 在 多 数 情 况 下 ， N 端 附 加 的 甲 硫 氨 酸 对 蛋 白 质 的 性 质 没 有 特 别 的影 响 ， 但 是 也 有 附 加 的 甲 硫 氨 酸 严 重 影 响 蛋 白 质 生 物 学 活 力 的 报 道 。 另 外 ， 附 加 的 甲 硫 氨 酸 也 可 能 改 变 蛋 白 质 的 免 疫 性 质 和 药 理 性 质 。从 制 备 用 于 医 疗 目 的 的 蛋 白 质 的 角 度 来

56、 看 ， 这 是 一 个 需 要 引 起 重 视 的 问 题 。 去 除 附 加 的 甲 硫 氨 酸 有 二 种 方 法 ： 在 表 达 系 统 中 共 表 达 甲 硫 氨 酸 氨 肽 酶 基 因 。 在 分 离 纯 化 后 在 体 外 用 外 肽 酶 处 理 。 但 它 们 都 对 与 甲 硫 氨 酸 相 邻 的 氨 莱 酸 残 基 类 型 有 一 定要 求 ， 因 此 在 使 用 上 有 一 定 的 限 制 。 目 标 蛋 白 与 有 亲 合 配 基 的 序 列 融 合 表 达 与 纯 化 包 涵 体 相 比 ， 细 胞 质 中 以 可 溶 性 形 式 表 达 蛋 白 质 的 分 离 纯

57、化 过程 比 较 复 杂 ， 一 般 要 通 过 亲 合 层 析 才 能 达 到 比 较 高 的 纯 度 。 目 标 蛋 白 与 有 亲 合 配 基 的 序 列 融 合 表 达 既 可 以 提 高 分 离 纯 化 的 效率 ， 又 能 在 融 合 蛋 白 切 离 的 过 程 中 得 到 没 有 附 加 甲 硫 氨 酸 目 标 蛋 白 。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 蛋 白 G、 A和 衍 生 物 Z， 日 本 血 吸 虫 谷 胱 甘 肽 -S-转移 酶 ， 大 肠 杆 菌 麦 芽 糖 结 合 蛋 白 ， His-tag 等 是 目 前 常 用 的 与 目 标 基 因 融 合 表 达 的 序 列

58、 。 目 标 蛋 白 在 周 质 空 间 中 表 达目 标 蛋 白 在 周 质 空 间 中 表 达 的 优 点 大 肠 杆 菌 周 质 空 间 中 自 身 蛋 白 质 的 数 量 约 为 100 种 ， 只 占 菌 体 总蛋 白 数 量 的 4%。 蛋 白 水 解 酶 的 含 最 与 在 细 胞 质 中 相 比 也 少 得 多 ， 因 此 目 标蛋 白 在 周 质 空 间 中 表 达 有 利 于 分 离 纯 化 和 减 少 蛋 白 水 解 酶 的 降 解 。 目 标 蛋 白 从 细 胞 质 转 运 到 周 质 空 间 过 程 中 信 号 肽 被 加 工 切 除 ， 有效 地 避 免 了 N 端

59、 附 加 的 甲 硫 氨 酸 的 产 生 。 周 质 空 间 中 呈 氧 化 型 的 氧 化 还 原 态 势 使 目 标 蛋 白 能 够 较 好 折 叠 ， 维 持 正 确 的 构 象 。 目 标 蛋 白 外 泌 表 达 把 所 表 达 的 目 标 蛋 白 外 泌 到 细 胞 外 的 培 养 基 中 可 以 进 一 步 减 少 蛋 白 水 解酶 的 降 解 ， 也 有 利 于 分 离 纯 化 。 目 前 成 功 的 例 子 主 要 是 采 用 以 下 方 案 : （ 1） 与 大 肠 杆 菌 本 身 的 外 泌 蛋 白 基 因 融 合 表 达 （ 2） 与 一 些 能 提 高 细 胞 外 膜

60、通 透 性 的 因 子 融 合 或 共 表 达 （ 3） 改 变 培 养 基 的 成 分 归 纳 现 有 的 研 究 结 果 显 示 这 些 方 法 仅 对 外 泌 分 子 量 较 小 的 蛋 白 有 效 ， 而 且 外 泌 效 率 一 般 都 比 较 低 。 表 达 质 粒 的 优 化 和 设 计共 表 达 大 肠 杆 菌 稀 有 密 码 子 tRNA 基 因提 高 目 标 基 因 mRNA 和 目 标 基 因 产 物 的 稳 定 性高 密 度 发 酵 和 工 程 化 宿 主 细 胞 表 达 质 粒 的 优 化 和 设 计 在 各 种 表 达 载 体 中 ， 启 动 子 和 SD序 列 的

61、下 游 都 设 计 了 一 段 含 有 各 种限 制 性 酶 切 位 点 的 序 列 ， 用 于 目 标 基 因 的 插 入 。 这 一 插 入 位 点 附 近 的序 列 将 成 为 核 糖 体 结 合 位 点 的 一 部 分 ， 因 此 它 对 于 构 建 高 效 表 达 质 粒是 至 关 重 要 的 。 由 于 每 一 个 基 因 都 具 有 各 自 独 特 的 5 端 结 构 ， 最 终 构 建 成 的 各 种 表达 质 粒 所 具 有 的 核 糖 体 结 合 位 点 是 一 个 变 量 。 表 达 质 粒 的 优 化 和 设 计 构 建 表 达 质 粒 时 首 先 要 考 虑 使 目

62、标 基 因 的 翻 译 起 始 密 码 ATG 与 SD 序列 之 间 的 距 离 和 碱 基 组 成 处 于 一 个 适 当 的 范 围 内 。 核 糖 体 结 合 位 点 序 列 的 变 化 对 mRNA 的 翻 译 效 率 有 显 著 影 响 ， 具 体 表现 为 ： SD 序 列 UAAGGAGG 的 翻 译 效 率 要 比 AAGGA 高 3 6倍 翻 译 起 始 密 码 ATG 与 UAAGGAGG的 最 适 距 离 是 6 8 个 碱 基 长 度 ， 与 AAGAA 的 最 适 距 离 是 5 7 个 碱 基 长 度 ATG 与 UAAGGAGG 至 少 相 隔 3 4个 碱 基

63、 ， 与 AAGAA 至 少 相 隔 5 个 碱 基 ； mRNA 的 翻 译 才 能 进 行 ATG 与 SD 序 列 之 间 的 碱 基 组 成 为 A， T 碱 基 丰 富 时 ， mRNA 翻 译 效 率 较 高 。 核 糖 体 结 合 位 点 本 身 和 附 近 的 序 列 决 定 了 目 标 基 因 mRNA 5 端 的 二 级结 构 ， 研 究 表 明 讨 mRNA 5端 形 成 的 “ 茎 环 ” 结 构 阻 碍 了 mRNA 与 核 糖体 30S 亚 基 的 结 合 ， 从 而 抑 制 了 翻 译 的 起 始 。 尽 量 提 高 核 糖 体 结 合 位 点 本 身 和 附 近

64、 的 序 列 中 A/T 碱 基 的 含 量 ， 降 低 mRNA 5 端 形 成 的 “ 茎 环 ” 结 构 的 可 能 性 ， 也 是 构 建 表 达 质 粒 时 需 要 注 意的 事 项 。 在 必 要 的 情 况 下 ， 还 可 通 过 定 点 突 变 ， PCR 等 技 术 改 变 个 别 关 键 的 碱基 来 破 坏 mRNA 5 端 的 “ 茎 环 ” 结 构 。 把 目 标 基 因 设 计 成 多 顺 反 子 结 构 ， 在 大 肠 杆 菌 本 身 的 高 效 翻 译 起 始 元 件 后 加 上 第 二 个 SD 序 列 和 目 标 基 因 ， 一 起 插 入 表 达 载 体

65、。 这 一 方 法 通 常 适用 于 目 标 基 因 5 端 序 列 容 易 形 成 二 级 结 构 ， 而 又 不 宜 改 变 其 序 列 的 情 形 下 表 达 质 粒 的 优 化 和 设 计 在 构 建 表 达 质 粒 时 ， 充 分 利 用 各 个 基 因 的 结 构 特 征 和 特 点 ， 注 意 引 入翻 译 增 强 子 序 列 能 提 高 mRNA 翻 译 效 率 的 特 殊 核 苷 酸 序 列 ， 称 为 翻 译 增 强 子 。 共 表 达 大 肠 杆 菌 稀 有 密 码 子 tRNA 基 因 表 达 水 平 高 的 基 因 呈 现 的 密 码 子 偏 爱 性 高 于 表 达

66、水 平 低 的 基 因 。 现 已 阐 明 的 在 大 肠 杆 菌 中 的 稀 有 密 码 子 有 ： 编 码 Arg 的 密 码 子 AGA、 AGG、 CGA、 CGG 编 码 Pro 的 密 码 子 CCC、 CCU、 CCA 编 码 Cys 的 密 码 子 UGU、 UGC; 编 码 Gly 的 密 码 子 GGA、 GGG 编 码 Leu 的 密 码 子 CUA、 CUC 编 码 Ile 的 密 码 子 AUA 编 码 Ser 的 密 码 子 UCA、 AUG、 UCG、 UCC 编 码 Thr 的 密 码 子 ACA 共 表 达 大 肠 杆 菌 稀 有 密 码 子 tRNA 基 因 由 于 同 义 密 码 子 的 使 用 频 率 与 细 胞 内 对 应 的 tRNA 的 丰 度 有 正 比 关 系稀 有 密 码 子 对 应 的 tRNA 的 丰 度 很 低 ， 有 可 能 在 翻 译 过 程 中 发 生 中 止 和 移码 突 变 。 解 决 这 一 问 题 的 办 法 ： 通 过 基 因 突 变 把 稀 有 密 码 子 改 变 为 其 他 使 用 频 率 高 的 同 义 密