生命科学进展

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1、生 命 科 学 进 展 中心法则生 命 现 象 的 研 究 逐 渐 由 获 取 基 因 序 列 信 息 转 向 研 究 基 因 功 能 ，基 因 功 能 的 具 体 体 现 者 就 是 蛋 白 质 。前 言 ： 蛋 白 质 相 互 作 用 蛋 白 质 可 以 通 过 某 种 方 式 与 蛋 白 质 ， 核 酸 或 其 他 分 子之 间 发 生 相 互 作 用 而 形 成 一 定 形 态 的 蛋 白 复 合 物 。多 亚 基 蛋 白 复 合 体酶 -底 物抗 原 -抗 体 研 究 蛋 白 质 相 互 作 用 的 重 要 意 义 绝 大 多 数 疾 病 都 是 由 特 定 蛋 白 质 相 互 作

2、用 所 致 。 对 200种 蛋 白 质及 2000种 组 合 结 构 进 行 解 析 后 ， 发 现 其 中 三 分 之 一 的 蛋 白 质 相 互组 合 会 导 致 疾 病 ； 容 易 导 致 疾 病 的 蛋 白 质 和 其 它 蛋 白 质 结 合 以 后也 将 变 得 十 分 活 跃 ， 致 使 发 病 和 病 情 恶 化 。 蛋 白 质 相 互 作 用 和 识 别 在 诸 如 DNA的 复 制 与 转 录 、 蛋 白 质 的 合成 与 分 泌 ， 生 物 催 化 、 物 质 转 运 、 新 陈 代 谢 、 信 号 传 导 、 免 疫 、细 胞 调 控 等 多 种 重 要 的 生 命 过

3、 程 起 着 重 要 的 作 用 。 蛋 白 质 之 间 相 互 作 用 以 及 通 过 相 互 作 用 而 形 成 的 蛋 白 复 合 物 是细 胞 各 种 基 本 功 能 的 主 要 完 成 者 。 每 一 种 蛋 白 质 不 是 孤 立 存 在 于 细 胞 中 ， 而 是 与 其 它 蛋 白 质 或 核 酸 或 其他 小 分 子 一 起 进 行 相 互 作 用 来 行 使 其 功 能 ， 从 而 使 得 细 胞 中 所 有 蛋 白 质形 成 一 个 相 互 作 用 的 网 络 ， 同 时 功 能 相 同 和 相 似 的 蛋 白 质 在 一 起 组 成 相关 的 功 能 模 块 ， 以 完

4、 成 相 关 的 生 理 功 能 。 蛋 白 质 相 互 作 用 网 络 蛋 白 质 相 互 作 用 的 检 测 和 分 析 方 法一 ， 酵 母 双 杂 交 系 统 ， Yeast Two-Hybrid System；二 ， 噬 菌 体 表 面 展 示 技 术 ， Phage Display；1. 谷 胱 苷 肽 -S-转 移 酶 沉 淀 ， GST-pull down；三 ， 基 于 亲 和 层 析 的 蛋 白 质 相 互 作 用 研 究 平 台2. 免 疫 共 沉 淀 ， Co-immunoprecipitation；3. 亲 和 印 迹 ， Ligand blot。 一 ， 酵 母 双

5、 杂 交 系 统Yeast Two-Hybrid System 1989年 Field 和 Song等 人 在 酵 母 细 胞 中 设 计 的 分 析 蛋 白 质 相互 作 用 的 方 法 ， 以 真 核 细 胞 转 录 激 活 因 子 的 结 构 和 活 性 特 点为 基 础 的 。 Stelzl 等 (2005)和 Raul 等 (2005)则 先 后 分 析 了 人 脑 组 织 、 人已 知 ORF中 大 规 模 的 蛋 白 质 相 互 作 用 网 络 。 Rain 等 (2001)用 该 法 绘 制 了 人 类 胃 肠 道 病 原 菌 Helicobacter pylori 的 大 规

6、 模 蛋 白 质 相 互 作 用 图 谱 。 随 后 ， Giot 等 (2003)和 Li 等 (2004)在 果 蝇 和 线 虫 中 也 成 功 地研 究 了 大 规 模 的 蛋 白 质 相 互 作 用 。 酵 母 激 活 因 子 GAL4： N端 ： 147个 氨 基 酸 组成 的 DNA结 合 域 (DNA binding domain, BD)， C端 ： 113个 氨 基 酸 组 成 的 转 录 激 活 域(transcription activation domain, AD)。 GAL4分 子 的 DNA结 合 域 可 以 和 上 游 激 活 序列 (upstream acti

7、vating sequence， UAS)结 合 ，而 转 录 激 活 域 则 能 激 活 UAS下 游 的 基 因 进 行转 录 。 组 成 部 分 ： （ 1） 与 BD融 合 的 蛋 白 表 达 载 体， 被 表 达 的 蛋 白 称 诱 饵 蛋 白 （ bait） ； （ 2）与 AD融 合 的 蛋 白 表 达 载 体 ， 被 其 表 达 的 蛋 白称 靶 蛋 白 （ prey） ； （ 3） 带 由 一 个 或 多 个 报告 基 因 的 宿 主 菌 株 。 酵 母 双 杂 交 系 统 工 作 原 理 酵母双杂交实验流程 酵 母 双 杂 交 系 统 的 应 用 范 围 检 测 已 知 蛋

8、 白 质 之 间 的 相 互 作 用 ； 确 定 蛋 白 质 相 互 作 用 功 能 区 域 位点 ； 筛 选 与 靶 蛋 白 发 生 相 互 作 用 的 未知 蛋 白 。 不 需 分 离 和 标 记 靶 蛋 白 ， 采 用 高 拷 贝 和 强 启 动 子 的 表 达 载 体 使 杂 合 蛋 白 过 量表 达 ， 避 免 蛋 白 质 纯 化 过 程 ； 检 测 在 活 细 胞 内 进 行 ， 真 实 反 应 体 内 蛋 白 质 间 相 互 作 用 情 况 ； 敏 感 度 高 ， 可 检 测 存 在 于 蛋 白 质 之 间 的 微 弱 的 或 暂 时 的 相 互 作 用 ； 可 进 行 高 通

9、量 筛 选 ； 成 本 低 ， 无 需 特 殊 的 检 测 设 备 。 基 因 型 和 表 型 相 联 系 ， 可 直 接 得 到 相 互 作 用 蛋 白 的 编 码 序 列 。酵 母 双 杂 交 系 统 的 优 点 限 于 检 测 定 位 于 细 胞 核 内 的 蛋 白 质 间 相 互 作 用 ； 假 阳 性 ： 本 身 具 有 激 活 转 录 功 能 的 蛋 白 ； cDNA反 向 插 入 ； 融 合 蛋 白 可 能 会 影 响 蛋 白 的 真 实 结 构 和 功 能 。 蛋 白 质 与 蛋 白 质酵 母 双 杂 交 系 统 的 局 限 性 二 ， 噬 菌 体 表 面 展 示 技 术 Ph

10、age Display 噬 菌 体 ： 感 染 细菌 、 真 菌 、 放 线菌 或 螺 旋 体 等 微生 物 的 病 毒 。 1985年 Smith 证 实 噬 菌 体 fd基 因 组 能 通 过 基 因 工 程 的 手段 进 行 改 造 。 1988年 Parmley 将 已 知 抗 原 决 定 簇 与 噬 菌 体 P N端 融合 呈 现 在 其 表 面 。 1990年 McCafferty 用 噬 菌 体 展 示 技 术 筛 选 溶 菌 酶 的 单 链抗 体 成 功 使 噬 菌 体 展 示 技 术 进 入 一 个 广 泛 应 用 的 时 代 。 一 系 列 噬 菌 体 文 库 的 构 建

11、噬 菌 体 展 示 技 术 焕 发 出 了 新 的生 命 力 。 噬 菌 体 展 示 技 术 的 发 展 简 史 利 用 固 相 支 持 物 上 的 抗 体 或 受 体 ，采 用 亲 和 筛 选 法 从 噬 菌 体 文 库 中 筛选 出 能 结 合 筛 选 分 子 的 目 的 噬 菌 体 。在 噬 菌 体 pIII和 p 衣 壳 蛋 白 N端 插 入外 源 待 筛 基 因 编 码 的 蛋 白 或 cDNA文库 ， 形 成 的 融 合 蛋 白 表 达 在 噬 菌 体 颗粒 的 表 面 ；外 源 多 肽 或 蛋 白 质 表 达 在 噬 菌 体 的表 面 ， 其 编 码 基 因 可 通 过 分 泌

12、型 噬菌 体 的 单 链 DNA测 序 推 导 出 来 。噬 菌 体 表 面 展 示 技 术 原 理 噬 菌 体 表 面 展 示 操 作 流 程构 建 cDNA文 库 ，使 外 源 基 因 与 外壳 蛋 白 基 因 融 合 ，导 入 噬 菌 体 Display Bind to antigen Wash to remove unbound phage EluteAmplify Analyze Detect Elisa噬 菌 体 展 示 技 术 一 般 要 经 过 多 轮 的筛 选 ， 这 样 就 可 以 得 到 在 文 库 中 含量 很 低 的 与 配 基 特 异 作 用 的 蛋 白 质 。 大

13、 规 模 筛 选 与 特 异 抗 体 或 受 体 相 互 作 用 的 未 知 蛋 白 质 ； 研 究 抗 体 或 受 体 与 抗 原 或 底 物 的 结 合 位 点 ； 可 用 于 构 建 随 机 多 肽 库 、 抗 体 库 和 蛋 白 文 库 ； 研 究 新 型 多 肽 药 物 、 疫 苗 和 抗 体 ； 可 研 究 蛋 白 质 与 核 酸 相 互 作 用 的 生 物 学 过 程 ； 非 蛋 白 小 分 子 与 蛋 白 相 互 作 用 的 研 究 ； 酶 作 用 底 物 的 分 析 。噬 菌 体 表 面 展 示 应 用 范 围 应 用 范 围 非 常 广 ； 可 用 于 高 通 量 筛 选

14、； 可 研 究 含 量 很 低 的 与 配 体 特 异 作 用 的 蛋 白 质 ； 可 直 接 得 到 相 互 作 用 蛋 白 的 编 码 序 列 。噬 菌 体 表 面 展 示 优 点 需 要 标 记 的 抗 体 或 配 体 来 检 测 结 合 情 况 ； 外 源 蛋 白 大 小 受 到 限 制 ， 不 能 研 究 大 分 子 量 蛋 白 质 的 相 互 作 用 ； 原 核 表 达 体 系 中 外 源 蛋 白 质 无 法 正 确 折 叠 或 修 饰 ； 融 合 蛋 白 可 能 会 影 响 到 蛋 白 质 本 身 的 结 构 或 生 物 活 性 。噬 菌 体 表 面 展 示 缺 点 1. 谷 胱

15、 苷 肽 -S-转 移 酶 沉 淀 试 验 (GST-pull down)三 、 基 于 亲 和 层 析 的 蛋 白 质 相 互 作 用 研 究 平 台2. 免 疫 共 沉 淀 (Co-immunoprecipitation)3. Ligand blot基 本 原 理 是 将 一 种 蛋 白 质 或 抗 体 固 定 于 某 种 基 质 上 （ 如 Sepharose，NC膜 或 PVDF膜 等 ） ， 当 细 胞 抽 提 液 经 过 改 基 质 时 ， 可 与 该 固 定 蛋 白相 互 作 用 的 配 体 蛋 白 被 吸 附 ， 而 没 有 吸 附 的 非 目 标 蛋 白 则 随 洗 脱 液

16、流出 。 被 吸 附 的 蛋 白 可 以 通 过 改 变 洗 脱 液 或 者 洗 脱 条 件 而 回 收 下 来 ， 然后 对 其 进 行 分 析 鉴 定 。 1. 谷 胱 苷 肽 -S-转 移 酶 沉 淀 试 验 (GST-pull down)1988年 smith等 利 用 谷 胱 甘 肽 S转 移 酶 融 合 标 签 从 细 菌 中 一 步 纯 化出 GST融 合 蛋 白 ， 从 此 GST融 合 蛋 白 在 蛋 白 质 相 互 作 用 研 究 领 域里 得 到 了 极 大 的 推 广 。GST-pull down方 法 是 将 诱 饵 蛋 白 质 和 GST标 签 融 合 表 达 。

17、一 步纯 化 后 与 含 有 目 的 蛋 白 质 的 溶 液 培 育 ， 之 后 利 用 谷 胱 甘 肽 琼 脂糖 球 珠 将 融 合 蛋 白 :目 的 蛋 白 复 合 物 沉 淀 下 来 ， 然 后 进 行 聚 丙 烯酰 胺 凝 胶 电 泳 或 质 谱 鉴 定 与 诱 饵 蛋 白 质 相 互 作 用 的 蛋 白 质 。 GSTX 谷 胱 甘 肽 -琼 脂 糖 球 珠细 胞 裂 解 物 4 下 孵 育 2h GST融 合 蛋 白 GSTX GSTX GSTXY GST-pull down筛 选 未 知 的 结 合 蛋 白设 置 GST对 照 ， 排除 GST的 影 响Y Y Y BindWas

18、h to remove unbound protein Elute AnalyzeBind GST-pull down验 证 两 个 已 知 蛋 白 的 相 互 作 用GSTX 谷 胱 甘 肽 -琼 脂 糖 球 珠纯 化 的 Y蛋 白 4 下 孵 育 2h GST融 合 蛋 白 GSTX GSTX GST+ +GST 纯 化 的 Y蛋 白GSTY YY BindWash to remove unbound protein DetectBind Bind 不 需 要 制 备 抗 体 来 检 测 结 合 情 况 ； 不 需 要 对 诱 饵 蛋 白 进 行 标 记 ， 避 免 了 使 用 同 位 素

19、 等 危 险 物 质 ；GST-pull down的 优 点GST-pull down的 缺 点2. 假 阳 性 。 蛋 白 质 所 带 电 荷 引 起 的 ， 并 不 是 生 理 性 的 相 互 作 用 ； 有 时 会 检 测 到 两 种 在 细 胞 中 不 可 能 相 遇 却 有 极 强 亲 和 力 的 蛋 白 。 该 方 法 只 适 用 于 确 定 体 外 的 相 互 作 用 ；3. 融 合 蛋 白 可 能 会 影 响 蛋 白 的 真 实 结 构 和 功 能 。 原 理 ： 当 细 胞 在 非 变 性 条 件下 被 裂 解 时 ， 完 整 细 胞 内 存在 的 许 多 蛋 白 质 蛋 白

20、 质 间的 相 互 作 用 被 保 留 了 下 来 。如 果 用 蛋 白 质 X的 抗 体 免 疫沉 淀 X， 那 么 与 X在 体 内 结合 的 蛋 白 质 Y也 能 沉 淀 下 来。 之 后 纯 化 靶 蛋 白 免 疫 复 合物 ， 凝 胶 电 泳 分 离 后 ， 质 谱鉴 定 靶 蛋 白 的 结 合 蛋 白 。 2. 免 疫 共 沉 淀 (Co-immunoprecipitation) Binding wash elutionY Y Y Y Y细 胞 裂 解 物 Detection免 疫 共 沉 淀 技 术 流 程 检 测 是 在 生 理 条 件 下 进 行 ， 可 以 真 实 地 体

21、现 在 生 命 过 程 中 蛋 白 质之 间 的 相 互 作 用 ； 可 进 行 大 规 模 的 筛 选 ； 可 检 测 依 赖 于 修 饰 的 蛋 白 质 之 间 的 相 互 作 用 ; 可 以 分 离 得 到 天 然 状 态 的 相 互 作 用 蛋 白 复 合 物 。免 疫 共 沉 淀 技 术 的 优 点免 疫 共 沉 淀 技 术 的 缺 点 灵 敏 性 不 高 。 不 能 检 测 和 分 析 低 表 达 量 的 蛋 白 之 间 的 相 互 作 用 ； 假 阳 性 。 受 免 疫 球 蛋 白 的 干 扰 容 易 产 生 假 阳 性 ； 需 要 制 备 高 质 量抗 体 。 以 终 产 物

22、为 检 测 对 象 ， 检 测 不 到 瞬 间 有 相 互 作 用 的 蛋 白 质 ； 3. 亲 和 印 记 ， Ligand blot将 PAGE胶 上 分 离 好 的 蛋 白 样 品 转 移 到 硝 酸 纤 维 膜 上 ， 然后 检 测 哪 种 蛋 白 能 与 标 记 的 诱 饵 蛋 白 发 生 作 用 ， 最 后 通过 显 影 或 显 色 反 应 信 号 确 定 相 互 作 用 蛋 白 ， 最 后 通 过 质谱 对 其 进 行 鉴 定 。 诱 饵 蛋 白 的 标 记 技 术 PNAS, 2007JBC, 2005FEBS J, 2008 样 品 蛋 白 的 分 离 和 固 定 技 术 L

23、igand blot的 应 用 BBRC, 2007 1. 转 膜 前 需 要 将 蛋 白 质 复 性 ， 不 能 完 全 恢 复 到 天 然 状 态 ；Ligand blot技 术 的 缺 点2. 需 要 对 蛋 白 进 行 标 记 或 要 制 备 抗 体 ；2. 灵 敏 度 不 高 ， 很 难 鉴 定 分 离 低 表 达 量 的 相 互 作 用 蛋 白 ；2. 实 验 在 体 外 进 行 ， 很 难 鉴 定 修 饰 的 蛋 白 或 蛋 白 复 合 体 。Ligand blot技 术 的 优 点1. 操 作 简 便 ， 尤 其 是 对 于 在 变 性 条 件 下 也 能 发 生 相 互 作

24、用的 蛋 白 的 鉴 定 和 验 证 ；2. 可 鉴 定 靶 蛋 白 与 受 体 的 结 合 位 点 。 OutlineRegulatory RNAs in BacteriaDiscovery of sRNATarget of sRNAPrediction sRNA in Bacillus cereus group Regulatory RNAs in BacteriaRiboswitchesCRISPR sRNAs (small RNAs) Riboswitches位 于 所 调 节 的 mRNA的 5端与 所 调 节 的 mRNA一 起 转 录通 过 改 变 RNA的 结 构 来 影 响

25、转 录 或 翻 译由 两 部 分 组 成 ： aptamer region， 结 合 配 体 ； expression platform， 改 变 RNA结 构能 感 应 氨 基 酸 ， 核 苷 酸 ， 金 属 离 子 等 小 分 子 ， 也能 感 应 细 胞 组 分 （ 如 特 殊 的 tRNA） ， 还 能 感 应温 度 等 环 境 因 素 Riboswitches的 响 应 配 体 的 作 用 方式通 过 改 变 mRNA的 结 构 影 响 转 录 或 翻 译 Waters and Storz ,Cell, 2009 Riboswitches响 应 温 度 的 作 用 方式低 温 时 ，

26、 SD序 列 与 ASD序 列 配 对 形 成 茎 环 结 构 ， 当 温 度 升 高 时 ， 茎 环 结 构 解 开 ， 露 出 SD序 列 Henkin, Genes Dev., 2008 CRISPR结 构 与 功 能 CAS gene:CRISPR-associated gene功 能 多 数 未 知 ， 但 往 往 具 有 DNA或 RNA结 合 domain， 解 螺 旋 酶Domain， 内 切 酶 或 者 外 切 酶domainLeader sequence： 大 概 550bp左 右Repeated DNA： 24-47bp， 重 复 2-249次Spacer： 26-72b

27、p Waters and Storz ,Cell, 2009 CRISPR介 导 的 phage抗 性Sorek et al., Nat. Rev. Microbiol., 2008 sRNAsRNAs that Modulate Protein ActivityCis-encoded base pairing sRNATrans-encoded base pairing sRNAExtend of sRNA sRNAs that Modulate Protein Activity大 肠 杆 菌 中 作 用 的 例 子Waters and Storz ,Cell, 2009 Cis-encod

28、ed base pairing sRNA具 有 独 立 的 启 动 子 和 转 录 终 止 子 ， 没 有 ORF一 般 由 目 标 mRNA的 互 补 链 编 码 ， 直 接 位 于 ORF的 互 补 链 或 者 operon的 中 间与 目 标 mRNA某 区 域 完 全 配 对 目 前 大 部 分 来 源 于 噬 菌 体 ， 质 粒 ， 转 座 子 ； 在 质 粒 中 ， 调 节 复 制 ， 分 离 等 ；在 转 座 子 中 调 节 转 座 频 率 ； 在 噬 菌 体 中 ， 调 节 溶 原 与 溶 解Brantl, Future Microbiol., 2009 Action menc

29、hanism of Cis-encoded base pairing sRNA 直 接 结 合 到 RBS区 或 者 mRNA中 间 ， 引 起 mRNA降 解 或 者 翻 译 终 止Waters and Storz ,Cell, 2009 Trans-Encoded Base Pairing sRNAs往 往 位 于 基 因 之 间 的 间 隔 区 ， 有 独 立 的 启 动 子 和 转 录 终 止 位 点长 度 一 般 50到 600bp， 主 要 是 50到 200nt之 间与 目 标 基 因 相 隔 较 远与 目 标 基 因 形 成 不 完 全 的 匹 配 ， 往 往 需 要 辅 助

30、蛋 白 来 加 强 这 种 匹 配 与 目 标 基 因 的 匹 配 的 区 域 一 般 10-25bpPichon et al., Bioinformatics, 2008; Brantl, Future Microbiol., 2009 Functions of Cis-Encoded Base Pairing sRNAs Brantl, Future Microbiol., 2009 作 用 特 点低 浓 度 ， 匹 配 碱 基 较 少 时 需 要 辅 助 蛋 白 Hfq浓 度 较 高 ， 匹 配 区 域 较 长 时 ， 不 需 要 Hfq大 部 分 在 环 境 变 化 情 况 下 表 达 ： 离 子 浓 度 变化 ， 外 膜 压 力 ， 营 养 条 件 变 化 等 等 ； 组 成 型表 达 的 比 较 少每 个 sRNA可 调 节 多 个 目 标