流式细胞术贝克曼

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1、应用分类1、膜表面抗原和胞浆内蛋白分析2、DNA含量及细胞周期分析3、定量分析4、细胞功能分析5、凋亡研究6、细胞间相互左右7、细胞分选 临床应用疾病诊断:为疾病诊断提供直接的或支持诊断的依据免疫调节：细胞因子/受体的相互作用 共刺激分子受体/配体的相互作用 发病机理：肿瘤的发病与机体的免疫力低下、以及信号传递 障碍有关药物/疫苗效果的评价：肿瘤生物治疗的时机选择、以及效果 的监测 免疫状态评价： 移植、放化疗等. 细 胞 周 期 分 析 :在 细 胞 周 期 (G0， G1， S，G2 ， M)的 各 个 时 期 ， DNA的 含 量 随 各 时 相 呈 现出 周 期 性 的 变 化 。 通

2、 过 核 酸 染 料 标 记 DNA， 并由 流 式 细 胞 仪 进 行 分 析 ， 可 以 得 到 细 胞 各 个 时期 的 分 布 状 态 ， 计 算 出 G0/G1%， S%及 G2/M%。了 解 细 胞 的 周 期 分 布 及 细 胞 的 增 殖 活 性 。 也 可利 用 细 胞 周 期 蛋 白 （ CYCLIN） 、 Ki67、 核 增 殖抗 原 （ PCNA） 等 ， 对 细 胞 周 期 进 行 精 确 的 分 期 ：G0、 G1、 S、 G2、 M.DNA含量及细胞周期分析 0 200 400 600 800 1000DNA contentCount Normal Cell Cy

3、cle 1. 肿瘤的早期诊断。2. 肿瘤的良恶性判断。3. 观察细胞的增殖状态及周期分布。4. 疗效监测 细 胞 功 能 分 析 1.吞 噬 功 能 试 验 2.氧爆发试验3.根 据 T淋 巴 细 胞 分 泌 细 胞 因 子 的 不 同 将 CD4+或CD8+分 为 介 导 细 胞 免 疫 的 I型 细 胞 和 介 导 体 液免 疫 的 II型 细 胞 .4.药 物 泵 的 功 能 检 测 5.NK细胞的肿瘤杀伤活性检测6.血小板的粘附,聚集功能检测 树突状细胞分析（Dendritic Cells,DC)u DC是主要的抗原递呈细胞，同时又是重要的先天免疫细胞，还是具有免疫调控功能的一个细胞群

4、，没有发现特异性的抗原标记u DC研究的主要内容包括直接分析计数、体外诱导检测,一般分为两群PDC,MDCu当前DC检测的方法：1）Lin-,CD11c,CD123,同时可能表达CD80,CD86,CD83,DR等2）利用BDCA1,2,3,4对外周血或其它组织DC进行分析3）CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85 /CD123 T细胞分析u相对计数淋巴细胞亚群数量检查项目和意义疾病CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低严重降低增高降低SARS降低降低降低降低降低 慢性活动性肝炎、肝硬化降低正常或增高降低降低肿瘤降低降低增高降低

5、降低 CD4细胞绝对计数u对AIDS病人的诊断、疗效和预后有重要的指导意义，一般认为CUTOFF值为200/ul.u绝对计数是加入浓度已知的标准微球与标本一起测定，流式细胞仪控制软件在设置后能自动计算出浓度u对任何细胞群体都可以进行绝对计数 Th1Th2细胞因子分泌细胞测定u根据产生的细胞因子的类型和生物学功能,人的4+细胞可以分为1、2u1细胞产生 2、 12、 、 等细胞因子,主要参与细胞介导的免疫反应、迟发性过敏反应,并在清除病毒等细胞内致病因子方面起着重要作用 u2细胞分泌 4、 5、 6、 10、 13等细胞因子,主要促进体液免疫反应,中和胞外病原体u相应地，CD8+T细胞也可以分为

6、Tc1和Tc2 Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。Th2细胞 ：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症。 Th1Th2检测Tipsu一定要确定T细胞是否已经活化，细胞转运阻滞是否成功，胞膜打孔是否有效 u一定要用胞浆内同型对照（特别是FITC标记时），以便分别部分弱表达的细胞因子。 TETRAMERu抗原递呈细胞（APC）携带抗原

7、片段通过与TCR复合物结合，在APC和T细胞的MHC相容和其它共刺激分子的相互作用下激活T细胞并产生细胞免疫效应。MHC-四聚体染色技术用于抗原特异性T细胞分析的原理在于体外模仿上述抗原递呈的过程来实现对特异性T细胞的鉴定，通过流式细胞仪这种高通量分析仪器对标本中这群细胞进行分析 u四聚体技术的优势是：可以对特异性免疫细胞进行定量；用流式细胞仪检测可以快速测定大量细胞，可以同时进行其它表面染色，可以直接用外周血测定而不需要培养；四聚体染色不会杀伤细胞，因此染色后的细胞可以进行分选或其它功能分析；四聚体对所有的特异性T细胞都能够结合，而不仅仅是对有功能的细胞进行检测。 u不同厂家的MHC四聚体产

8、品不太一样：贝克曼库尔特公司创造性地构建和表达了MHC分子3链的区域突变的蛋白（iTAg），能降低其与非特异性T细胞结合，大大提高了特异性。并且将MHC四聚体直接标记荧光，和常用的抗原多肽负载后整体商品化，也有单独的MHC分子（iTAg）单独出售，极大方便了研究者 CD4CD25 Tregu调控性T细胞的主要功能是抑制机体免疫功能，太强则免疫耐受，太弱会引起自身免疫反应u调控性T细胞调节抗原递呈细胞对抗原的递呈u调控性T细胞的表型是CD4+CD25bright，逐渐发现越来越多的其它分子可能能够更精确限定（eg.FOX-1?)u CD25也是免疫细胞晚期活化的标记，但表达的平均荧光强度不足够强

9、 非特异性的先天免疫细胞u 细胞:占外周血T细胞的10以下，非抗原依赖型免疫细胞，在传染病、肿瘤病人外周血数量增加，表达CD3量较普通T细胞多u NK细胞：占外周血淋巴细胞825，传染病和肿瘤病人数量偏低。NK细胞可以根据NKR的不同而分类，丙型肝炎的发生和预后可能与NK细胞的表型相关u DC：分布与淋巴组织和外周血，为非成熟状态，遇到相应的抗原后主要分泌IFN-alpha来发挥左右 其它重要分子的流式分析的意义u粘附分子：物种间高度保守，与细胞间通讯，干细胞HOMING，肿瘤的发生可能有很重要的关系，如CD11C/CD18-CD54与DC成熟和迁移有关；CD209-CD102与抗原递呈有关u

10、 CD26:移植后造血干细胞表达可能不利于该细胞的homing，有证据表明抑制造血干细胞有利用移植成功 流式细胞术在移植中的应用u移植配型和群体反应性抗体的检测u荧光示踪标记的移植细胞：CFSE是一个确定的荧光标记物，开发其它稳定的荧光素应该更有帮助 流式细胞仪分选u为达到最高的分选效率，实用中最好先用磁珠分选系统进行初步分选u活细胞分选非常有用 流式细胞术在生物医学研究的新方向u细胞多态性分析：受体、抗原折叠、HLA等，包括CXCR4,CCR5,DC-SIGN(与AIDS易感性有关），NKR(中国科大研究领先项目）u信号传导（实际主要为胞浆内磷酸化及去磷酸化蛋白的检测）u新型荧光特异性探针：

11、胞内病原体检测、转录因子检测、细胞器或细胞生命活动指标的新荧光素的应用u利用分选的细胞进行体内和体外功能研究 u与其它定位性的荧光设备联合使用（如MPE,CONFOCAL,IC100等） Cell Lab IC 100 Complete data mining and analysis Flexible Analysis Plug-in architecture Scalable across an enterprise -2 -1 0 1 2 3 4 50.30.40.50.60.70.8 LogEC50FLIN u流式细胞仪是一个高通量的开发系统，随着新抗体和新标记的发现和开发，将在疾病诊断和生物医学的研究方面为大家发挥更大的作用