流式细胞术的样品制备

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1、 FCM的 样 品 制 备 包 括 单 分 散 细 胞 悬 液 制 备技 术 ， 细 胞 生 物 学 特 征 标 记 技 术 及 荧 光 染 色 技术 ， FCM是 对 细 胞 或 细 胞 器 的 结 构 和 某 些 功 能进 行 定 量 测 定 ， 并 可 以 根 据 细 胞 亚 群 的 特 点 性质 对 其 进 行 分 类 的 技 术 。FCM的 实 验 对 象 是 单 细 胞 或 单 细 胞 核 的 悬 液 ， 在FCM技 术 中 制 备 出 合 格 的 单 细 胞 悬 液 是 非 常 重要 的 环 节 ， 这 些 单 细 胞 悬 液 主 要 来 源 于 单 层 细胞 、 血 液 、 脱

2、 落 细 胞 、 实 体 组 织 及 石 蜡 包 埋 组织 等 。 一 、 单 层 培 养 细 胞 分 散 为 单 个 细 胞 贴 壁 的 单 层 培 养 细 胞 单 细 胞 悬 液 的 制 备操 作 步 骤 ：1、 将 单 层 培 养 细 胞 (对 数 生 长 期 )中 的 旧 培 养 液 倒 掉 。2、 加 入 少 量 0.25%胰 酶 ， 消 化 细 胞 ， 在 倒 置 显 微 镜 下 观察 ， 见 细 胞 稍 变 圆 时 ， 立 即 终 止 消 化 （ 假 如 含 有 10%胎牛 血 清 的 培 养 基 ） ， 收 集 细 胞 ， 离 心 后 去 上 清 ， PBS液洗 涤 细 胞 一

3、 次 ， 离 心 去 掉 上 清 液 ， 约 留 0.5ml细 胞 悬 液 ，用 振 荡 器 使 细 胞 分 散 。3、 如 果 不 是 及 时 上 机 检 测 ， 则 需 要 对 细 胞 进 行 固 定 ， 常规 固 定 液 为 70%乙 醇 ， 然 后 保 存 于 4 冰 箱 中 。 （ 二 ） 悬 浮 培 养 细 胞 单 细 胞 悬 液 的 制 备操 作 步 骤 ：1、 离 心 去 除 旧 培 养 液 ， PBS液 洗 涤 细 胞 一 次 ， 离 心 去 掉上 清 液 ， 约 留 0.5ml细 胞 悬 液 ， 用 振 荡 器 使 细 胞 分 散 。2、 如 果 不 是 及 时 上 机 检

4、 测 ， 则 需 要 对 细 胞 进 行 固 定 ， 常规 固 定 液 为 70%乙 醇 ， 然 后 保 存 于 4 冰 箱 中 。 二 、 实 体 组 织 单 分 散 细 胞 的 制 备 新 鲜 实 体 组 织 新 鲜 实 体 组 织 是 手 术 或 活 检 后 根 据检 测 目 的 而 采 取 的 样 品 ， 此 样 品 应 及 时进 行 适 当 的 保 存 处 理 ， 如 及 时 用 固 定 剂或 低 温 对 组 织 进 行 保 存 ， 以 避 免 由 于 室温 过 高 、 放 置 时 间 过 长 而 造 成 组 织 自 溶 ，影 响 检 测 结 果 。 新 鲜 实 体 组 织 单 细

5、胞 悬 液 制 备 方 法 如 下 ： 酶 消 化 法 机 械 法 剪 碎 法 网 搓 法 研 磨 法 化 学 试 剂 处 理 法 酶 消 化 法 酶 对 实 体 组 织 分 散 作 用 原 理 主 要 有 三 方 面 ： 一 是 可 以 破 坏 组 织 间 的 胶 原 。 二 是 可 以 水 解 组 织 细 胞 的 紧 密 连 结 装 置 的 蛋 白 性 物 质 。 三 是 可 以 水 解 组 织 间 的 粘 多 糖 物 质 。 酶 消 化 法 是 实 体 组 织 分 散 为 单 细 胞 的 主 要 方 法 ， 常 用的 酶 类 试 剂 有 ： 蛋 白 酶 类 ， (如 胃 蛋 白 酶 ，

6、木 瓜 蛋 白 酶 ， 链 蛋 白 酶 和 中 性蛋 白 酶 等 )都 能 够 释 放 所 有 组 织 中 的 细 胞 ； 胰 酶 ， 能 水 解 脂 键 和 肽 键 ； 胶 原 酶 ， 能 降 解 几 种 分 子 类 型 的 胶 原 ； 溶 菌 酶 ， 能 水 解 糖 蛋 白 和 肽 的 糖 苷 键 ； 弹 性 蛋 白 酶 ， 能 消 化 连 接 组 织 的 糖 蛋 白 和 弹 性 蛋 白 的 纤 维 ， 可 用 于 解 离 血 管 、 心 脏 和 肝 脏 的 细 胞 。 为 使 组 织 细 胞 分 散 下 来 ， 应 用 酶 学 方 法 必 须 注 意 条 件 的选 择 和 影 响 因 素

7、 ： 酶 需 要 溶 解 于 适 当 的 溶 液 中 ， 而 这 种 溶 液 不 致 于 造 成 酶 效价 降 低 注 意 组 织 在 消 化 液 中 的 消 化 时 间 注 意 酶 活 性 的 PH值 注 意 酶 的 适 用 浓 度 随 时 注 意 影 响 酶 活 性 的 其 他 因 素 各 种 酶 的 分 散 程 度 都 有 一 定 的 限 制 性 ， 特 别 是 在 进 行 免疫 标 记 实 验 时 ， 酶 处 理 可 能 改 变 细 胞 膜 的 成 分 ， 从 而 影 响 细胞 亚 群 的 区 分 。 应 指 出 ， 用 于 组 织 分 散 的 很 多 酶 是 不 够 纯 的 ，不 仅

8、 含 有 一 种 占 主 导 的 酶 ， 而 且 在 不 同 程 度 上 也 混 有 其 他 污染 物 质 ， 它 们 的 活 性 可 能 有 利 于 组 织 分 散 ， 也 可 能 对 组 织 的结 构 或 功 能 产 生 不 利 的 影 响 。 酶 学 方 法 的 一 般 程 序 ： 将 适 合 于 酶 消 化 的 组 织 置 于 离 心 管 中 。 将 选 好 的 酶 溶 液 1-2ml加 入 盛 有 被 消 化 组 织 的 试管 中 。 一 般 消 化 20-30分 钟 (恒 温 37C或 室 温 )， 消 化 期间 要 间 接 振 荡 或 吹 打 。 终 止 消 化 ， 收 集 细

9、胞 悬 液 ， 以 尼 龙 网 (200目 )过滤 ， 除 去 大 团 块 ， 以 低 速 离 心 除 去 细 胞 碎 片 。 将 制 备 好 的 单 细 胞 进 行 流 式 细 胞 术 分 析 或 保 存 。 机 械 法 机 械 法 分 裂 实 体 组 织 包 括 ： 用 剪 刀 剪 碎 或用 锋 利 的 解 剖 刀 剁 碎 ， 用 匀 浆 器 匀 浆 ， 用 细 注射 针 头 抽 吸 细 胞 以 分 散 细 胞 ， 采 用 网 搓 法 同 样也 能 获 得 大 量 的 细 胞 ， 机 械 法 易 造 成 细 胞 悬 液中 细 胞 碎 片 ， 所 以 机 械 法 常 与 其 他 方 法 配

10、合 使用 。 常 用 的 几 种 机 械 法 制 备 过 程 如 下 ：剪 碎 法 ： 将 组 织 块 放 入 平 皿 中 ， 加 入 少 量 的 盐 水 。 用 剪 刀 将 组 织 剪 至 匀 浆 状 。 加 入 10ml生 理 盐 水 。 用 吸 管 吸 取 组 织 匀 浆 ， 先 以 100目 尼 龙 网 过 滤 到 试 管 中 。 离 心 沉 淀 1000prm3-5分 钟 ， 再 用 生 理 盐 水 洗 三 次 ， 每次 以 短 时 低 速 离 心 沉 淀 (500-800prm)去 除 细 胞 碎 片 。 以 300目 尼 龙 网 过 滤 除 去 细 胞 团 块 。 70%冰 乙

11、醇 固 定 ， 放 入 4 冰 箱 。 网 搓 法 ： 将 100目 铜 网 扎 在 小 烧 杯 上 。 把 剪 碎 的 组 织 放 在 网 上 ， 以 眼 科 镊 子 轻 轻 搓 组 织块 ， 边 搓 边 用 生 理 盐 水 冲 洗 ， 直 到 将 组 织 搓 完 。 用 300目 的 尼 龙 网 过 滤 细 胞 悬 液 除 去 大 的 团 块 收 集 细 胞 悬 液 ， 离 心 沉 淀 1000prm， 5分 钟 。 70%乙 醇 固 定 ， 置 4 冰 箱 备 用 。 研 磨 法准 备 一 只 70ml组 织 研 磨 器 将 组 织 剪 碎 至 小 块 。 放 入 组 织 研 磨 器 中

12、 ， 加 入 1-2ml生 理 盐 水 。 转 动 研 棒 ， 研 至 匀 浆 即 可 。 加 入 生 理 盐 水 10-20ml， 冲 洗 研 器 。 收 集 细 胞 悬 液 ， 并 经 300目 尼 龙 网 过 滤 ， 离 心沉 淀 500-800prm， 1-2分 钟 ， 再 用 生 理 盐 水 洗 三次 ， 离 心 沉 淀 。 化 学 试 剂 处 理 法 化 学 试 剂 处 理 法 的 主 要 原 理 是 将 细 胞 间 起 粘 连 作 用 的 钙 镁 离 子 置 换 出 来 ， 从 而 使 细 胞 分 散 下 来 。 试 剂 配 制 ： 0.2%EDTA配 制 EDTA0.2g溶 解

13、 后 ， 加 入 Hanks液 100ml， 封 装 高 压 消毒 ， 置 0-4 保 存 。 胰 酶 加 EDTA配 制 胰 酶 0.25g+PBS(PH7.0)200ml， 浓 度 0.125%，EDTA0.2g+PBS(PH7.0)200ml， 浓 度 0.2%。 各 取 40ml混 合 ， 分 装 置 冰 箱 保 存 ， 用 时 过 滤 既 可 。 实 验 步 骤 ： 将 组 织 切 成 薄 片 放 入 试 管 。 加 入 EDTA液 5ml， 室 温 ， 半 小 时 ， 弃 之 。 加 入 胰 酶 +EDTA液 5-10ml， 在 37 恒 温 水 浴 30分 钟 ， 间 断 振 荡

14、 3-5次 。 用 300目 尼 龙 网 过 滤 ， 离 心 沉 淀 1000prm， 5分钟 ， 再 以 生 理 盐 水 洗 2-3次 ， 离 心 500-800prm，1-2分 钟 。 70%乙 醇 固 定 置 冰 箱 中 被 检 。 实 验 证 实 ， 用 化 学 试 剂 处 理 组 织 导 致 细 胞成 活 率 降 低 ， 细 胞 产 额 较 低 ， 细 胞 碎 片 和 细 胞丛 结 的 量 不 稳 定 ， 因 此 ， 化 学 试 剂 处 理 方 法 不单 独 使 用 ， 可 与 其 他 方 法 联 合 使 用 。 机 械 法 常 常 造 成 严 重 的 细 胞 损 伤 ， 较 低 的

15、细 胞 产 量 ， 为 使 细 胞 碎 片 不 影 响 FCM检 测 结 果 ，需 采 用 适 当 的 方 法 除 去 碎 片 或 尽 量 减 少 碎 片 。 酶 学 法 对 实 体 肿 瘤 的 分 散 解 聚 是 较 理 想 的 ，但 是 会 对 所 测 化 学 成 分 造 成 不 良 影 响 ， 所 以 根据 使 用 目 的 去 选 择 合 适 的 单 细 胞 悬 液 制 备 方 法 ，才 能 获 得 理 想 的 样 品 和 更 好 的 FCM结 果 。 注 意 事 项 ： 新 鲜 组 织 标 本 应 及 时 进 行 保 存 ， 以 免 组 织 在 室 温 下 放置 时 间 过 长 ， 造

16、 成 细 胞 自 溶 导 致 DNA降 解 ， 影 响 FCM测 定 结 果 。 根 据 实 验 目 的 选 用 最 佳 的 细 胞 固 定 方 法 ， 以 免 由 于 固定 剂 的 原 因 ， 造 成 FCM检 测 结 果 的 不 稳 定 。 酶 学 法 要 注 意 条 件 的 选 择 和 影 响 因 素 ， 要 注 意 酶 的 溶剂 ， 消 化 时 间 、 pH值 、 浓 度 等 方 面 对 酶 消 化 法 的 影 响 。 需 注 意 不 同 的 组 织 选 用 适 当 的 方 法 ， 如 富 于 细 胞 的 肿瘤 (淋 巴 瘤 、 视 神 经 母 细 胞 瘤 、 脑 瘤 、 未 分 化

17、癌 、 髓 样癌 以 及 一 些 软 组 织 肉 瘤 )不 一 定 要 用 酶 学 或 化 学 法 ， 往往 用 单 独 的 机 械 法 就 可 以 收 到 大 量 单 分 散 细 胞 。 在 使 用 酶 学 方 法 时 ， 要 重 视 酶 的 选 用 ， 如 含 有 大 量 结缔 组 织 的 肿 瘤 ， 如 食 管 癌 、 乳 癌 、 皮 肤 癌 等 ， 用 胶 原 酶 为 好 ， 因 为 胶 原 酶 具 有 在 Ca2 、 Mg 2 存 在 或 在 血 清状 态 下 不 发 生 活 性 降 低 的 特 征 。 实 验 方 法 ： 石 蜡 包 埋 组 织 在 切 片 机 上 切 取 40-5

18、0m厚 的 组织 片 3-5片 。 将 切 取 的 组 织 片 放 入 试 管 中 。 加 入 二 甲 苯 5-8ml脱 蜡 (在 室 温 下 )， 1-2天 ， 视石 蜡 脱 净 与 否 ， 可 更 换 一 次 二 甲 苯 ， 蜡 脱 净 后弃 去 二 甲 苯 。 水 化 ： 依 次 加 入 100%、 95%、 70%、 50%梯 度的 酒 精 5ml， 每 步 10分 钟 ， 去 乙 醇 ， 加 入 蒸 馏水 3-5ml， 10分 钟 后 弃 之 。 消 化 ： 加 入 2ml 0.5%胃 蛋 白 酶 (pH值 1.5-2.0)置37 恒 温 水 浴 中 消 化 30分 钟 ， 消 化

19、期 间 每 隔 10分 钟 振 荡 一 次 。石蜡包埋组织单细胞悬液的制备 消 化 30分 钟 后 ， 立 即 加 入 生 理 盐 水 终 止 消 化 。 经 300目 尼 龙 网 过 滤 ， 未 消 化 完 的 组 织 片 可 以二 次 消 化 。 收 集 细 胞 悬 液 ， 离 心 沉 淀 1500prm， 以 生 理 盐水 漂 洗 1-2次 ， 离 心 沉 淀 1500prm， 再 以 生 理 盐水 漂 洗 1-2次 ， 离 心 沉 淀 500-800prm， 去 碎 片 。 制 备 好 的 单 细 胞 悬 液 作 涂 片 ， AO染 色 在 荧 光显 微 镜 下 观 察 ， 应 为 完

20、 整 细 胞 核 ， 核 发 出 黄 绿色 荧 光 。 单 细 胞 样 品 1 106细 胞 /ml， 加 入 荧 光 染 液 溴 化乙 啶 (EB)或 碘 化 丙 啶 (PI)1ml， 置 0-4 冰 箱 30分 钟 ， 经 300目 尼 龙 网 过 滤 后 上 机 检 测 。 注 意 事 项 ：l 一 定 将 石 蜡 从 组 织 中 脱 干 净 ， 检 验 是 否 将 石 蜡脱 净 的 方 法 是 ， 弃 去 二 甲 苯 ， 加 入 100%乙 醇 ，如 无 絮 状 物 浮 起 ， 即 视 为 石 蜡 已 脱 净 ， 反 之 则没 有 脱 净 。l 消 化 时 间 不 可 过 长 ， 以

21、免 造 成 已 释 放 出 的 细 胞核 被 消 化 掉 。l 切 片 不 可 过 薄 或 过 厚 ， 过 薄 则 碎 片 增 多 ， 影 响流 式 分 析 结 果 ， 过 厚 造 成 脱 蜡 不 净 或 脱 蜡 时 间过 长 ， 一 般 以 40-50m为 宜 。 二 、 血 液 单 细 胞 样 品 的 制 备 血 液 是 天 然 的 单 细 胞 分 散 细 胞 悬 液 ， 血 中的 细 胞 成 分 在 生 理 状 态 下 呈 分 散 的 游 离 状 态 ，它 是 流 式 细 胞 分 析 的 最 合 适 的 样 品 ， 全 血 中 含有 红 细 胞 ， 白 细 胞 和 血 小 板 三 种 有

22、 形 成 分 ， 但流 式 细 胞 的 检 测 是 以 某 一 群 细 胞 为 测 定 对 象 ，因 此 在 检 测 前 须 将 所 测 的 某 群 细 胞 分 离 出 来 ，下 面 分 别 介 绍 几 种 血 细 胞 的 分 离 制 备 方 法 。 淋 巴 细 胞 的 制 备 取 肝 素 抗 凝 血 2.0ml， 用 生 理 盐 水 2ml将 全 血 稀 释 至 4ml。 先 将 3ml人 淋 巴 细 胞 分 离 液 放 入 另 一 个 离 心 管 ， 然 后 将稀 释 后 的 血 沿 试 管 内 壁 缓 缓 加 入 到 分 离 液 面 之 上 ， 勿用 力 过 大 ， 以 免 造 成 血

23、液 与 分 离 液 混 合 ， 保 持 清 晰 的分 层 状 态 。 离 心 2000prm， 30分 钟 ， 室 温 18-20 ， 离 心 后 可 见 试管 内 的 血 液 清 楚 的 分 为 4层 ， 上 层 为 血 浆 层 ， 中 层 为 分离 液 层 (淋 巴 细 胞 所 处 的 位 置 在 血 浆 层 与 分 离 液 层 中 间 )，底 层 为 红 细 胞 ， 红 细 胞 上 为 粒 细 胞 。 用 吸 管 将 上 层 与 中 层 之 间 的 淋 巴 细 胞 吸 出 ， 收 集 到 另一 支 离 心 管 ， 用 生 理 盐 水 稀 释 至 10ml， 离 心 洗 涤 2次 ，每 次

24、 均 以 1500prm, 10分 钟 ， 弃 上 清 后 即 得 到 纯 度 较 高的 淋 巴 细 胞 ， 但 可 有 少 量 的 单 核 细 胞 。 70%冰 乙 醇 固 定 ， 置 4 冰 箱 保 存 。 粒 细 胞 的 制 备 用 淋 巴 细 胞 分 离 液 对 细 胞 进 行 分 层 。 粒 细 胞 的 比 重 较 淋 巴 细 胞 稍 大 ， 因 此 经 分 离 液 分 离 后的 粒 细 胞 ， 分 层 于 红 细 胞 之 上 ， 分 离 液 的 底 部 。 以 吸 管 慢 慢 将 粒 细 胞 层 吸 出 ， 置 另 一 支 离 心 管 内 ， 以5ml的 Hanks液 洗 涤 三

25、次 ， 每 次 离 心 沉 淀 1500prm， 10分 钟 。 在 吸 取 粒 细 胞 的 同 时 常 附 带 一 些 红 细 胞 ， 因 此 需 将 红细 胞 去 除 ， 加 入 1.0ml低 渗 溶 液 ， 30-40秒 。 再 以 Hanks液 洗 涤 2次 ， 即 可 获 得 纯 度 大 于 95%以 上 的粒 细 胞 。 单 核 细 胞 制 备1. 取 肝 素 1000u/ml抗 凝 全 血 3.0m1,加 入 3.0ml生 理 盐 水 将 血 稀 释 ,均 在 无 菌 条 件 下 操 作 。2.1640培 养 液 10.0ml,放 入 培 养 瓶 内 ,将 稀 释 血 加 入 培

26、 养 液 中 ,混 匀 ,与 培 养 瓶 接 触 面 要 大 。3.放 入 37 恒 温 箱 内 孵 育 30-40分 钟 ,取 出 培 养 瓶 ,将 血 倾 倒 掉 ,用 生 理 盐 水 将 培 养 瓶 轻 轻 冲 洗 一 次 ,以 去 掉 残 留 的 血 液 ,这 时 培 养 瓶 壁 上 贴 附 了 大 量的 单 核 细 胞 ,因 为 单 核 细 胞 具 有 短 时 培 养 期 内 贴附 快 的 特 点 ,而 其 他 细 胞 没 有 这 个 特 性 ,所 以 利用 这 一 特 性 进 行 短 时 培 养 可 获 得 较 纯 的 单 核 细胞 。 4.将 粘 附 于 培 养 瓶 壁 上 的

27、单 核 细 胞 消 化 下 来 ,用0.25%胰 酶 消 化 10 15分 钟 ,室 温 下 ,并 不 断 摇 震 ,以 促 使 细 胞 脱 落 下 ,单 核 细 胞 的 粘 附 力 很 强 ,用酶 消 化 往 往 获 得 细 胞 数 少 ,目 前 亦 采 用 机 械 的 方法 ,用 一 橡 皮 刷 ,伸 入 培 养 瓶 在 瓶 壁 上 轻 擦 ,将 细胞 刮 取 下 ,但 切 勿 用 力 过 大 ,造 成 细 胞 损 伤 过 多 。5 . 脱 落 下 来 的 细 胞 移 入 离 心 管 , 离 心 沉 淀1500prm,5分 钟 ,再 以 生 理 盐 水 漂 洗 2 3 次 ,每 次离 心

28、800prm,2分 钟 ,以 去 除 碎 片 杂 质 。6.将 细 胞 涂 片 ,以 丫 啶 橙 染 色 ,置 荧 光 显 微 镜 下 观 察形 态 和 纯 度 。7.将 细 胞 以 70%乙 醇 固 定 ,置 0-4 冰 箱 保 存 备 检 。 三 、 脱 落 细 胞 单 细 胞 悬 液 的 制 备 在 临 床 实 际 工 作 中 ， 可 收 集 到 大 量 自 然 脱 落的 细 胞 ， 这 些 细 胞 标 本 经 过 简 单 的 处 理 ， 就 可得 到 较 好 的 单 分 散 细 胞 悬 液 ， 所 以 是 流 式 细 胞术 检 测 的 天 然 样 品 ， 下 面 介 绍 几 种 常 见

29、 的 脱 落细 胞 样 品 制 备 方 法 。 宫 颈 脱 落 细 胞 悬 液 的 制 备1.首 先 用 生 理 盐 水 冲 洗 宫 颈 表 面 的 分 泌 物 ,以 海 棉 轻 拭 宫颈 表 面 ,将 海 棉 中 吸 附 的 脱 落 细 胞 洗 脱 到 20ml生 理 盐 水中 。2.收 集 细 胞 悬 液 ,以 1500prm离 心 沉 淀 ,用 生 理 盐 水 洗 涤 2次 ,每 次 5分 钟 ,弃 上 清 后 加 入 70%乙 醇 3ml固 定 备 检 。 食 管 脱 落 细 胞 悬 液 的 制 备1.将 食 管 拉 网 器 上 的 细 胞 洗 脱 到 10ml生 理 盐 水 中 ,以

30、1500prm离 心 沉 淀 ,再 用 生 理 盐 水 洗 涤 2次 ,离 心 500-800prm1-2分 钟 ,弃 上 清 。2.调 整 细 胞 数 在 1X106/ml,可 进 行 标 记 染 色 上 机 ,如 不 马 上检 测 可 用 70% 的 冰 乙 醇 固 定 保 存 。3.在 标 记 染 色 前 如 发 现 细 胞 有 团 块 聚 集 ， 可 用 0.5%胃 蛋 白酶 (PH1.5-2.0)在 37 水 浴 箱 中 消 化 5-10分 钟 ， 振 荡 分 散为 单 细 胞 悬 液 。 胸 腹 水 脱 落 细 胞 的 制 备1.抽 取 胸 腹 水 200-300ml， 加 入 抗

31、 凝 剂 (肝 素 或 枸 橼 酸 钠 )5ml，放 入 容 器 中 置 4 冰 箱 静 置 6-12小 时 ， 弃 上 清 。2.留 取 沉 淀 液 10-20ml， 吸 入 试 管 内 ， 以 生 理 盐 水 洗 三 次 ， 以1500prm离 心 沉 淀 5分 钟 。3.离 心 沉 淀 后 加 入 冷 枸 橼 酸 缓 冲 液 5ml， 在 室 温 下 放 置 20分 钟 。4.用 300目 筛 网 过 滤 后 ， 以 PBS洗 去 枸 橼 酸 缓 冲 液 ， 离 心 沉 淀去 上 清 ， 加 入 70%乙 醇 固 定 备 检 。 内 镜 刷 检 样 品 单 细 胞 悬 液 制 备1.将

32、刷 检 的 毛 刷 放 入 10ml盐 水 中 洗 脱 ， 收 集 悬 液 进 入 试 管 ,以 1500prm离 心 沉 淀 ， 再 以 生 理 盐 水 漂 洗 2-3次 ， 每 次500-800prm离 心 沉 淀 2分 钟 ， 弃 上 清 。2.以 300目 筛 网 过 滤 ， 去 除 细 胞 团 块 。3.70%冷 乙 醇 固 定 ， 置 于 冰 箱 备 检 。 冲 洗 液 样 品 单 细 胞 悬 液 制 备1.用 300-500ml生 理 盐 水 冲 洗 胃 或 膀 胱 ， 冲 洗 一 定 时 间 后 ，吸 出 冲 洗 液 放 入 容 器 中 ， 于 冰 箱 内 置 6-12小 时 。2.取 沉 淀 20-40ml， 离 心 沉 淀 ， 并 以 生 理 盐 水 洗 两 次 ，