发酵培养技术

《发酵培养技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《发酵培养技术（28页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、第 4章 发 酵 培 养 技 术 分 批 发 酵补 料 分 批 发 酵半 连 续 发 酵连 续 发 酵发酵培养技术 恒 化 器 反 馈 恒 化 器 多 级 连 续 发 酵 细 胞 循 环 连 续 发 酵 4.1 分 批 发 酵 分 批 发 酵 是 指 在 一 封 闭 培 养 系 统 中 含 有 初 始 限 制量 的 基 质 的 发 酵 方 式 。 即 种 子 接 种 到 培 养 基 中 后 ，除 了 气 体 流 通 外 发 酵 液 始 终 留 在 发 酵 罐 中 ， 直 至发 酵 结 束 。 图 3-1 分 批 培 养 的 典 型 生 长 曲 线停 滞 期加 速 期对 数 期减 速 期平 衡

2、期死 亡 期分批发酵过程 一 、 停 滞 期即 刚 接 种 后 的 一 段 时 间 内 ， 因 菌 种 对 新 的 生 长 环 境 有一 适 应 过 程 ， 细 胞 数 目 和 菌 量 不 变 的 过 程 。其 长 短 主 要 取 决 于 种 子 的 活 性 、 接 种 量 、 培 养 基 的 可 利用 性 和 浓 度 。 一 般 种 子 采 用 对 数 生 长 期 且 达 到 一 定 浓 度的 培 养 物 ， 该 种 子 能 耐 含 高 渗 化 合 物 和 低 CO2分 压 的 培养 基 。工 业 生 产 从 发 酵 产 率 和 发 酵 指 数 以 及 避 免 染 菌 考 虑 ，应 尽 量

3、缩 短 适 应 期 。 这 可 通 过 使 用 合 适 的 种 子 和 提 高接 种 量 来 达 到 。 二 、 加 速 期通 常 很 短 ， 比 生 长 速 率 可 在 短 时 间 内 从 最 小 升 到 最 大 值 。 三 、 对 数 期当 细 胞 已 完 全 适 应 其 周 围 环 境 后 ， 便 进 入 恒 定 的 对 数 或指 数 生 长 期 比 生 长 速 率 达 最 大 ， 且 为 一 常 数 ， 可 用 m表 示 。 可 用 下 式表 示 ： dtdXXm 1另 外 ， 处 于 对 数 期 的 细 胞 的 形 态 、 大 小 和 生 理 特 征 比 较 一致 ， 细 胞 内 蛋

4、 白 质 、 核 酸 等 大 分 子 组 成 保 持 不 变 ， 新 陈 代谢 旺 盛 。对 数 生 长 期 的 长 短 主 要 取 决 于 培 养 基 ， 包 括 溶 氧 的 可 利用 性 和 有 害 代 谢 产 物 的 积 累 。 对 数 期 越 长 ， 最 后 获 得 的活 菌 数 就 越 多 ， 因 此 ， 生 产 上 通 常 应 尽 可 能 地 延 长 对 数生 长 期 。 四 、 减 速 期随 着 养 分 的 减 少 ， 有 害 代 谢 物 的 积 累 ， 生 长 不 可 能 再 无限 制 地 继 续 。 这 时 虽 然 细 胞 量 仍 旧 在 增 加 ， 但 其 比 生 长速 率

5、 不 断 下 降 ， 细 胞 在 代 谢 与 形 态 方 面 逐 渐 蜕 化 。减 速 期 的 长 短 取 决 于 菌 对 限 制 性 基 质 的 亲 和 力 (Ks)， 亲和 力 高 ， 即 Ks值 小 ， 则 减 速 期 短 。 五 、 平 衡 期实 际 上 是 一 种 生 长 和 死 亡 的 动 态 平 衡 ， 净 生 长 速 率 等 于零 ， 即 (为 比 死 亡 速 率 )。 由 于 此 时 菌 体 的 次 级 代谢 十 分 活 跃 ， 许 多 次 级 代 谢 产 物 在 此 时 大 量 合 成 ， 菌 的形 态 也 发 生 较 大 的 变 化 (如 菌 体 分 化 ， 染 色 变

6、浅 ， 形 成 空胞 等 )。 六 、 死 亡 期当 养 分 耗 竭 ， 对 生 长 有 害 代 谢 物 在 发 酵 液 中 大 量 积 累 便进 入 死 亡 期 。 这 时 。 ， 生 长 呈 负 增 长 。 工 业 发 酵 一般 不 会 等 到 菌 体 开 始 自 溶 时 才 结 束 培 养 。 发 酵 周 期 的 长短 不 仅 取 决 于 前 面 五 期 的 长 短 还 取 决 于 X 0。 七 、 分 批 发 酵 过 程 产 物 的 形 成 动 力 学dtdPXqP 1产 物 比 生 成 速 率单 位 质 量 菌 体 细 胞 在 单 位 时 间 内 所 能 生 成 的 产 物 的 量

7、产物形成动力学 生 长 耦 联 型 非 生 长 耦 联 型 混 合 生 长 耦 联 型 XPP YdtdPXq /1 微 生 物 分 解 基 质 途 径的 直 接 产 物 和 某 些 酶类 ， 如 酒 精 、 黑 曲 霉葡 萄 糖 氧 化 酶 和 根 霉脂 肪 酶 ， 其 产 物 浓 度与 菌 体 生 长 随 时 间 的变 化 呈 平 行 关 系 dtdPXqP 1 产 物 的 形 成 速 度 与 菌体 生 长 速 率 无 关 ， 而与 菌 体 量 的 多 少 有 关 。如 次 生 代 谢 产 物 Pq Luedeking-Piret方 程 。如 乳 酸 、 黄 原 胶 和 一些 次 生 代

8、谢 产 物 发 酵 图 3-2 分 批 发 酵 生 长 与 产 物 形 成 的 动 力 学 模 型 . (a) 生 长耦 联 型 ； (b) 混 合 生 长 耦 联 型 ； (c) 非 生 长 耦 联 型 当 产 物 为 生 长 耦 联 型 时 ， 则 延 长 与 产 物 合 成 有 关 的对 数 生 长 期 ；当 产 物 为 非 生 长 耦 联 型 时 ， 如 次 生 代 谢 产 物 ， 则 以缩 短 菌 体 的 对 数 生 长 期 ， 并 迅 速 获 得 足 够 量 的 菌 体细 胞 后 延 长 生 产 期 ， 以 提 高 产 量 ；当 产 物 为 混 合 生 长 耦 联 型 时 ， 则

9、根 据 其 耦 联 程 度 而灵 活 调 节 。 八 、 分 批 发 酵 过 程 中 基 质 的 消 耗 动 力 学A. 得 率 系 数细 胞 对 基 质 的 得 率 系 数 YX/S ： SXY SX 细 胞 对 氧 的 得 率 系 数 YX/O： 2OXY OX 产 物 对 基 质 的 得 率 系 数 YP/S： SPY SP 当 限 制 性 基 质 为 碳 源 时 ， 消 耗 掉 的 碳 源 一 部 分 用 于 形 成细 胞 物 质 ， 一 部 分 形 成 产 物 ， 一 部 分 产 生 能 量 供 细 胞 维持 生 命 活 动 ， 对 其 进 行 质 量 衡 算 可 得 ， 则B. 基

10、 质 消 耗 速 率基 质 的 消 耗 细 胞 生 长 所 耗 基 质 产 物 生 成 所 耗 基 质 细 胞 维 持 生 命 活 动 所 耗 基 质 即 dtdSdtdSdtdSdtdS mPG 若 用 一 些 得 率 系 数 来 表 示 ， 则 ， YG 细 胞 的 得 率 系 数 ； YP 产 物 得 率 系 数 ； m 维 持 系 数 GG dSdXY PP dSdPY dtdSXm m1 mXdtdPYYXdtdS PG 1上 式 为 基 质 消 耗 速 率 方 程 。 YX/S、 YP/S 是 对 碳 源 的 总 消耗 而 言 ， 而 YG、 YP 则 分 别 是 对 用 于 生

11、长 和 用 于 产 物 生成 所 消 耗 的 碳 源 而 言 。 即代 入 上 式 ， 则 ， mXdtYdPXdtYXdX mXdtYdPdtYdXdtdSdtdSdtdSdtdS PG PGmPG 如 果 用 比 速 率 来 表 示 基 质 消 耗 和 产 物 生 成 ：dtdSXqS 1 dtdPXqP 1基 质 比 消 耗 速 率产 物 比 生 成 速 率因 此 ， 基 质 消 耗 速 率 方 程 也 可 表 示 为 mYqYq PPGS mXdtdPYYXdtdS PG 1 当 产 物 生 成 可 忽 略 不 计 时 ， 则 mYq GS 根 据 qS的 定 义 有 ： SXS Yd

12、tdXXdXdSdtdSXq 111 合 并 上 面 两 式 ， 则 ， mYY GSX 11因 此 ， 测 定 细 胞 在 不 同 比 生 长 速 率 时 下 的 YX/S ， 根据 上 式 的 1/ YX/S 对 1/作 图 ， 就 可 求 出 m 和 YG 。 4.2 补 料 分 批 发 酵 补 料 分 批 发 酵 又 称 为 流 加 分 批 发 酵 (fed-batch)， 是 指 在分 批 发 酵 过 程 中 ， 间 隙 或 连 续 的 补 加 新 鲜 培 养 基 的 培 养技 术 。 由 于 只 有 料 液 的 输 入 ， 没 有 输 出 ， 因 此 ， 发 酵 液的 体 积 在

13、不 断 增 加 。 其 目 的 是 克 服 由 于 养 分 的 不 足 ， 导致 发 酵 过 早 结 束 。补 料 分 批 发 酵 与 分 批 发 酵 相 比 ， 其 优 点 在 于 能 使 发 酵 系统 中 维 持 很 低 的 基 质 浓 度 ， 导 致 1) 可 以 除 去 快 速 利 用 碳源 的 阻 遏 效 应 ， 即 葡 萄 糖 效 应 ， 并 维 持 适 当 的 菌 体 浓 度 ，不 致 于 加 剧 供 氧 的 矛 盾 ； 2) 避 免 有 毒 代 谢 副 产 物 的 积 累 。其 应 用 范 围 十 分 广 泛 ， 包 括 各 种 产 物 的 发 酵 。 近 年 来 尤其 在 基

14、 因 工 程 菌 的 高 密 度 发 酵 中 ， 其 优 势 更 加 明 显 。 4.3 半 连 续 发 酵 1. 概 念在 补 料 分 批 发 酵 的 基 础 上 加 上 间 歇 放 掉 部 分 发 酵 液 (行业 中 称 为 带 放 )便 可 称 为 半 连 续 发 酵 。2. 优 点 可 补 入 适 当 的 养 分 或 前 体 ； 代 谢 有 害 物 被 稀 释 ， 从 而 有 利 于 产 物 的 继 续 合 成 ； 避 免 代 谢 终 产 物 的 反 馈 抑 制 作 用 。 放 掉 发 酵 液 的 同 时 也 丢 失 了 未 利 用 的 养 分 和 处 于 生 产旺 盛 期 的 菌 体

15、 ； 定 期 补 充 和 带 放 使 发 酵 液 稀 释 ， 送 去 提 炼 的 发 酵 液 体积 更 大 ； 发 酵 液 被 稀 释 后 可 能 产 生 更 多 的 代 谢 有 害 物 ， 最 终 限制 发 酵 产 物 的 合 成 ； 一 些 经 代 谢 产 生 的 前 体 可 能 丢 失 ； 有 利 于 非 产 生 菌 突 变 株 的 生 长 。 3. 缺 点 4.4 连 续 发 酵 1. 概 念连 续 培 养 是 发 酵 过 程 中 一 边 补 入 新 鲜 的 料 液 ， 一 边 以 相同 的 流 速 放 料 ， 维 持 发 酵 液 原 来 的 体 积 。 2. 种 类 恒 化 器 反

16、馈 恒 化 器 多 级 连 续 发 酵 细 胞 循 环 连 续 发 酵 继 续 稀 释 速 率 ： D=F/V XXVFXXVFdtdX 0在 稳 态 条 件 下 ， dX/dt=0， 上 式 变 为 ： DVF 因 此 ， 在 稳 态 下 可 通 过 控 制 补 料 速 率 来 控 制 比 生长 速 率 。 这 是 恒 化 器 的 最 重 要 的 特 性 之 一 。 稳 态 时 放 掉 发 酵 液 中 的 细 胞 量 等 于 生 成 细 胞 量 恒 化 器 返 回 是 一 种 通 过 调 节 补 料 速 率 来 保 持 生 长 参 数 为 一 恒 定值 的 连 续 发 酵 。 稀 释 率 和

17、 比 生 长 速 率 便 得 到 相 应 的调 节 。 包 括 细 胞 密 度 (混 浊 度 )、 pH、 溶 解 氧 、 排 气中 的 CO2、 营 养 和 产 物 浓 度 等 。 反 馈 恒 化 器 返 回 即 在 培 养 液 排 出 时 将 细 胞 截 留 然 后 再 将 其 返 回 罐 内 。细 胞 截 留 方 法 有 过 滤 、 沉 淀 、 离 心 和 固 定 化 等 。 也可 分 为 外 部 循 环 和 内 部 循 环 两 种 。 其 中 最 常 见 的 是膜 分 离 技 术 与 发 酵 的 耦 合 。 细 胞 循 环 连 续 发 酵 其 主 要 优 点 是 ： 可 充 分 利 用

18、 仍 旺 盛 的 菌 体 细 胞 ； 降 低 产 物 的 浓 度 ， 消 除 其 反 馈 抑 制 作 用 ；1) 降 低 代 谢 副 产 物 的 浓 度 ， 消 除 其 对 细 胞 和 代 谢的 毒 性 作 用 。 返 回 是 在 恒 化 器 中 增 加 罐 的 个 数 的 一 种 连 续 发 酵 。 其优 点 是 可 在 不 同 级 的 罐 内 可 控 制 不 同 的 条 件 ， 以满 足 不 同 时 期 的 菌 种 的 代 谢 活 动 要 求 。 在 多 种 碳源 的 利 用 和 次 生 代 谢 产 物 的 生 产 中 其 优 点 更 加 明显 。 多 级 连 续 发 酵 发 酵 培 养 技 术 有 哪 些 ？ 各 种 技 术 的 特 点 是 什 么 ？ 分 批 培 养 过 程 微 生 物 细 胞 生 长 经 历 了 哪 几 个 阶 段 ？各 自 的 特 点 是 什 么 ？ 分 批 发 酵 中 产 物 的 形 成 从 动 力 学 角 度 有 几 种 类 型 ？各 自 的 特 点 是 什 么 ？ 名 词 解 析 ： 比 生 长 速 率 、 基 质 比 消 耗 速 率 、 产 物 比生 成 速 率 、 对 基 质 的 细 胞 得 率 系 数 、 对 基 质 的 产 物 得率 系 数 、 基 质 消 耗 速 率 方 程 、 Luedeking-Piret方 程 。 思 考 题