基因工程菌的发酵

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1、基 因 工 程 菌 的 遗 传 不 稳 定 性 及 其 对 策 基 因 工 程 菌 遗 传 不 稳 定 性 的 表 现 与 机 制 改 善 基 因 工 程 菌 不 稳 定 性 的 策 略 基 因 工 程 菌 的 遗 传 不 稳 定 性 的 表 现 基 因 工 程 菌 的 遗 传 不 稳 定 性 主 要 表 现 在 重 组 质 粒 的 不 稳 定 性 ， 这 种 不 稳 定 性 具 有 下 列 两 种 表 现 形 式 ： 结 构 不 稳 定 性 重 组 DNA 分 子 上 某 一 区 域 发 生 缺 失 、 重 排 、 修 饰 ， 导 致 其 表 观 生 物 学 功 能 的 丧 失 分 配 不

2、稳 定 性 整 个 重 组 DNA 分 子 从 受 体 细 胞 中 逃 逸 （ curing） 基 因 工 程 菌 的 遗 传 不 稳 定 性 的 的 产 生 机 制 受 体 细 胞 中 的 限 制 修 饰 系 统 对 外 源 重 组 DNA 分 子 的 降 解 外 源 基 因 的 高 效 表 达 严 重 干 扰 受 体 细 胞 正 常 的 生 长 代 谢 能 量 、 物 质 的 匮 乏 和 外 源 基 因 表 达 产 物 的 毒 性 诱 导 受 体 细 胞 产 生 应 激 反 应 ： 关 闭 合 成 途 径 ， 启 动 降 解 程 序 重 组 质 粒 在 受 体 细 胞 分 裂 时 的 不

3、均 匀 分 配 这 是 重 组 质 粒 逃 逸 的 基 本 原 因 受 体 细 胞 中 内 源 性 的 转 座 元 件 促 进 重 组 分 子 的 缺 失 重 排 基 因 工 程 菌 的 遗 传 不 稳 定 性 的 的 产 生 机 制 受 体 细 胞 中 的 限 制 修 饰 系 统 对 外 源 重 组 DNA 分 子 的 降 解 外 源 基 因 的 高 效 表 达 严 重 干 扰 受 体 细 胞 正 常 的 生 长 代 谢 能 量 、 物 质 的 匮 乏 和 外 源 基 因 表 达 产 物 的 毒 性 诱 导 受 体 细 胞 产 生 应 激 反 应 ： 关 闭 合 成 途 径 ， 启 动 降

4、解 程 序 重 组 质 粒 在 受 体 细 胞 分 裂 时 的 不 均 匀 分 配 这 是 重 组 质 粒 逃 逸 的 基 本 原 因 受 体 细 胞 中 内 源 性 的 转 座 元 件 促 进 重 组 分 子 的 缺 失 重 排 重 组 质 粒 的 逃 逸 率 当 含 有 重 组 质 粒 的 工 程 菌 在 非 选 择 性 条 件 下 生 长 时 ， 培 养 系 统 中 一 部分 细 胞 不 再 携 带 重 组 质 粒 ， 这 些 空 载 细 胞 数 与 总 细 胞 数 之 比 称 为 重 组 质 粒的 宏 观 逃 逸 率 。 重 组 质 粒 逃 逸 的 原 因 有 ： 高 温 培 养 、

5、表 面 活 性 剂 （ SDS） 、 药 物 （ 利 福 平 ） 、 染 料 促 使 重 组 质 粒 渗 漏 受 体 细 胞 中 的 核 酸 酶 降 解 重 组 质 粒 重 组 质 粒 在 受 体 细 胞 分 裂 时 不 均 匀 分 配 ， 细 胞 所 含 重 组 质 粒 拷 贝 数 的 差 异 随 着 细 胞 分 裂 次 数 的 增 多 而 加 剧 影 响 基 因 工 程 菌 稳 定 性 的 因 素 载 体 的 选 择 遗 传 特 性 宿 主 的 选 择 外 源 基 因 整 合 到 宿 主 染 色 体 上 培 养 基 生 长 速 率 发 酵 工 艺 限 制 性 基 质 温 度 pH 和 溶

6、氧 外 源 基 因 表 达 提 高 基 因 工 程 菌 稳 定 性 的 策 略 改 进 载 体 受 体 系 统 以 增 加 质 粒 稳 定 性 为 目 的 的 构 建 方 法 包 括 ： 将 R1 质 粒 上 的 parB 基 因 引 入 表 达 型 载 体 中 其 表 达 产 物 可 以 选 择 性 地 杀 死 由 于 分 配 不 均 匀 所 产 生 的 无 质 粒 细 胞 正 确 设 置 载 体 上 的 多 克 隆 位 点 禁 止 DNA 片 段 插 在 稳 定 区 内 将 受 体 细 胞 的 致 死 性 基 因 安 装 在 载 体 上 同 时 构 建 条 件 致 死 性 的 相 应 受

7、体 系 统 ， 如 大 肠 杆 菌 的 ssb 基 因 （ DNA 单 链 结 合 蛋 白 编 码 基 因 ） 培 养 基 一 些 基 因 重 组 菌 在 复 合 培 养 基 中 显 示 较 高 的 质 粒 稳 定 性 微 生 物 在 含 有 有 机 氮 源 如 酵 母 抽 提 物 、 蛋 白 胨 等 营 养 丰 富 的 复 合 培 养 基 中 培 养 时 ， 由 于 培 养 基 提 供 了 生 长 必 须 的 氨 基 酸 和 其 他 物 质 ， 微 生 物 的 生 长 较 在 基 本 培 养 基 中 快 。 比 生 长 速 率 基 因 重 组 菌 的 比 生 长 速 率 对 质 粒 稳 定

8、性 有 很 大 影 响 。 提 高 比 生 长 速率 有 助 于 提 高 质 粒 稳 定 性 。 基 因 重 组 菌 的 比 生 长 速 率 与 培 养 环 境 有 关 ， 如 温 度 ， pH， 溶 氧 ， 限制 性 营 养 物 质 浓 度 ， 有 害 代 谢 产 物 浓 度 等 。 在 一 定 的 温 度 和 pH 下 ， 限 制性 基 质 浓 度 往 往 是 决 定 比 生 长 速 率 的 主 要 因 素 。 限 制 性 基 质 一 般 培 养 基 中 各 成 分 并 不 是 完 全 平 衡 的 ， 经 过 一 段 时 间 的 培 养 ， 微 生 物的 生 长 通 常 会 受 到 一 种

9、 或 几 种 物 质 的 限 制 。 限 制 性 基 质 的 种 类 对 重 组 菌 有 不同 的 影 响 pH 和 溶 解 氧 pH 和 溶 氧 影 响 重 组 酵 母 菌 的 稳 定 性 。 pH 和 溶 氧 是 影 响 微 生 物 生 长 的 重 要 参 数 ， 在 发 酵 罐 培 养 基 因 重 组 菌时 ， 通 常 都 需 要 维 持 一 定 的 pH 和 溶 氧 水 平 。 在 基 因 重 组 菌 的 高 密 度 培 养时 ， 为 了 维 持 所 需 的 溶 氧 水 平 ， 除 了 提 高 搅 拌 转 速 和 通 气 量 ， 往 往 还 要 在通 入 的 空 气 中 补 充 氧 气

10、 ， 以 提 高 发 酵 罐 的 供 氧 能 力 。 外 源 基 因 的 表 达 外 源 基 因 的 表 达 会 引 起 重 组 质 粒 的 不 稳 定 外 源 基 因 高 效 表 达 时 ， 有 可 能 因 竞 争 利 用 物 质 、 能 量 、 核 糖 体 等 干扰 宿 主 细 胞 的 正 常 代 谢 活 动 ， 并 造 成 质 粒 不 稳 定 。 例 如 ， 吲 哚 丙 烯 酸 （ IAA ） 是 trp 操 纵 子 阻 遏 物 的 部 分 去 阻 遏 剂 ， 在培 养 大 肠 杆 菌 MV12（ pVH5） 时 ， 在 培 养 基 中 加 入 不 同 量 的 IAA， 发 现随 IAA

11、 量 的 增 加 ， pVH5 带 有 的 分 支 酸 合 成 酶 和 色 氨 酸 合 成 酶 基 因 的 表 达水 平 有 很 大 提 高 ， 同 时 比 生 长 速 率 下 降 ， 培 养 液 中 Trp 的 比 例 上 升 。 电泳 分 析 表 明 60% 70% 色 氨 酸 合 成 能 力 丧 失 是 由 于 质 粒 结 构 的 变 化 ， 其余 是 由 于 质 粒 丢 失 造 成 。 提 高 基 因 工 程 菌 稳 定 性 的 策 略 施 加 选 择 压 力 根 据 载 体 上 的 抗 药 性 标 记 ， 向 培 养 系 统 中 添 加 相 应 的 抗 生 素 药 物 和 食 品 生

12、 产 时 禁 止 使 用 抗 生 素 加 入 大 量 的 抗 生 素 会 使 生 产 成 本 增 加 添 加 一 些 容 易 被 水 解 失 活 的 抗 生 素 ， 只 能 维 持 一 定 时 间 添 加 抗 生 素 选 择 压 力 对 质 粒 结 构 不 稳 定 无 能 为 力 载 体 上 的 营 养 缺 陷 型 标 记 ， 向 培 养 系 统 中 添 加 相 应 的 营 养 组 份 培 养 基 复 杂 ， 成 本 较 高 提 高 基 因 工 程 菌 稳 定 性 的 策 略 分 阶 段 控 制 培 养 因 外 源 基 因 表 达 造 成 质 粒 不 稳 定 时 ， 可 以 考 虑 将 发 酵

13、 过 程 分 阶 段 控 制 在 生 长 阶 段 使 外 源 基 因 处 于 阻 遏 状 态 ， 避 免 因 表 达 造 成 不 稳 定 性 问 题 的 发 生 ； 在 获 得 需 要 的 菌 体 密 度 后 ， 再 去 阻 遏 或 诱 导 外 源 基 因 表 达 。 连 续 培 养 时 可 以 考 虑 采 用 多 级 培 养 ， 如 在 第 一 级 进 行 生 长 ， 维 持 菌 体 的 稳 定 性 ， 在 第 二 级 进 行 表 达 。 提 高 基 因 工 程 菌 稳 定 性 的 策 略 控 制 目 的 基 因 的 过 量 表 达 使 用 可 控 型 启 动 子 控 制 目 的 基 因 的

14、 定 时 表 达 及 表 达 程 度 使 用 可 控 型 复 制 子 控 制 质 粒 的 定 时 增 殖 或 降 低 质 粒 的 拷 贝 数 优 化 基 因 工 程 菌 的 培 养 工 艺 培 养 基 组 成 ： 限 制 培 养 基 比 丰 富 培 养 基 更 有 利 于 稳 定 培 养 温 度 ： 较 低 的 培 养 温 度 有 利 于 重 组 质 粒 的 稳 定 提 高 基 因 工 程 菌 稳 定 性 的 策 略 优 化 基 因 工 程 菌 的 培 养 工 艺 工 程 菌 的 培 养 条 件 对 其 质 粒 的 稳 定 性 和 表 达 效 率 影 响 很 大 可 调 控 的 环 境 参 数

15、 为 ： 培 养 基 组 分 、 培 养 温 度 、 pH 和 溶 解 氧 浓 度 。 有 些 含 质 粒 的 菌 对 发 酵 环 境 的 改 变 比 不 含 质 粒 的 菌 反 应 慢 ， 因 而 采 用 间 隙 改 变 培 养 条 件 的 方 法 以 改 变 这 两 种 菌 的 比 生 长 速 率 ， 从 而 改 善 质 粒 的 稳 定 性 。 通 过 间 隙 供 氧 的 方 法 和 通 过 改 变 稀 释 速 率 的 方 法 都 可 提 高 质 粒 的 稳 定 性 。 培 养 基 组 成 ： 限 制 培 养 基 比 丰 富 培 养 基 更 有 利 于 稳 定 培 养 温 度 ： 较 低

16、的 培 养 温 度 有 利 于 重 组 质 粒 的 稳 定 提 高 基 因 工 程 菌 稳 定 性 的 策 略 控 制 培 养 条 件 有 些 含 质 粒 的 菌 对 发 酵 环 境 的 改 变 比 不 含 质 粒 的 菌 反 应 慢 ， 因 而 采 用间 隙 改 变 培 养 条 件 的 方 法 以 改 变 这 两 种 菌 的 比 生 长 速 率 ， 从 而 改 善 质 粒的 稳 定 性 。 通 过 间 隙 供 氧 的 方 法 和 通 过 改 变 稀 释 速 率 的 方 法 都 可 提 高 质粒 的 稳 定 性 。 例 如 研 究 表 达 干 扰 素 a 的 大 肠 杆 菌 W3110(pEC

17、901) 在 不 同 比 生 长速 率 下 的 质 粒 稳 定 性 ， 随 着 稀 释 率 的 增 加 ， 质 粒 稳 定 性 明 显 增 加 ， 干 扰素 的 比 效 价 也 明 显 增 大 . 提 高 基 因 工 程 菌 稳 定 性 的 策 略 固 定 化 固 定 化 可 以 提 高 基 因 重 组 大 肠 杆 菌 的 稳 定 性 基 因 重 组 大 肠 杆 菌 进 行 固 定 化 后 ， 质 粒 的 稳 定 性 及 目 的 产 物 的 表 达 率 都 有 了 很 大 提 高 。 在 游 离 重 组 菌 系 统 中 常 用 抗 生 素 ， 氨 基 酸 等 选 择 性 压 力 稳 定 质 粒

18、 的 手 段 ， 往 往 在 大 规 模 生 产 中 难 以 应 用 。 而 采 用 固 定 化 方 法 后 ， 这 种 选 择 压 力 则 可 被 省 去 。 不 同 的 宿 主 菌 及 质 粒 在 固 定 化 系 统 中 均 表 现 出 良 好 的 稳 定 性 。 一 、 基 因 工 程 菌 的 培 养 方 式二 、 基 因 工 程 菌 的 发 酵 工 艺 基 因 工 程 菌 发 酵 的 基 本 操 作 方 式 有 ： 分 批 培 养 分 批 培 养 操 作 简 单 ， 但 因 不 能 控 制 生 长 ， 获 得 的 菌 体 密 度 也 有 限 半 连 续 培 养 （ 补 料 分 批 ）

19、在 一 次 投 料 发 酵 的 基 础 上 ， 流 加 一 定 量 的 营 养 ， 使 细 胞 进 一 步 的 生 长 ， 或 得 到 更 多 的 代 谢 产 物 连 续 培 养 不 断 地 流 加 营 养 ， 并 不 断 地 取 出 发 酵 液 。 连 续 培 养 则 多 用 于 动 力 学 特 性 和 稳 定 性 等 研 究 。 透 析 培 养 固 定 化 培 养 补 料 分 批 培 养 补 料 分 批 培 养 是 将 种 子 接 入 发 酵 反 应 器 中 进 行 培 养 ， 经 过 一 段 时 间 ，间 歇 或 连 续 地 补 加 新 鲜 培 养 基 ， 使 菌 体 进 一 步 生 长

20、 的 培 养 方 法 。 在 分 批 培 养 中 ， 为 保 持 基 因 工 程 菌 生 长 所 需 的 良 好 微 环 境 ， 延 长 其 生长 对 数 期 ， 获 得 高 密 度 菌 体 ， 通 常 把 溶 氧 控 制 和 流 加 补 料 措 施 结 合 起 来 ，根 据 基 因 工 程 菌 的 生 长 规 律 来 调 节 补 料 的 流 加 速 率 。 连 续 培 养 连 续 培 养 是 将 种 子 接 入 发 酵 反 应 器 中 ， 搅 拌 培 养 至 菌 体 浓 度 达 到 一 定 程度 后 ， 开 动 进 料 和 出 料 蠕 动 泵 ， 以 一 定 稀 释 率 进 行 不 间 断

21、培 养 。 连 续 培 养 可 以 为 微 生 物 提 供 恒 定 的 生 活 环 境 ， 控 制 其 比 生 长 速 率 ， 为 研究 基 因 工 程 菌 的 发 酵 动 力 学 、 生 理 生 化 特 性 、 环 境 因 素 对 基 因 表 达 的 影 响 等创 造 了 良 好 的 条 件 。 但 是 由 于 基 因 工 程 菌 的 不 稳 定 性 ， 连 续 培 养 比 较 困 难 。 为 了 解 决 这 一 问题 ， 人 们 将 工 程 菌 的 生 长 阶 段 和 基 因 表 达 阶 段 分 开 ， 进 行 两 阶 段 连 续 培 养 。在 这 样 的 系 统 中 关 键 的 控 制

22、参 数 是 诱 导 水 平 、 稀 释 率 和 细 胞 比 生 长 速 率 。 优化 这 三 个 参 数 以 保 证 在 第 一 阶 段 培 养 时 质 粒 稳 定 ， 菌 体 进 入 第 二 阶 段 后 可 获得 最 高 表 达 水 平 或 最 大 产 率 。 透 析 培 养 透 析 培 养 技 术 是 利 用 膜 的 半 透 性 原 理 使 培 养 物 和 培 养 基 分 离 ， 其 主 要 目的 是 通 过 去 除 培 养 液 中 的 代 谢 产 物 来 解 除 其 对 生 产 菌 的 不 利 影 响 。 采 用 膜 透 析 装 置 是 在 发 酵 过 程 中 用 蠕 动 泵 将 发 酵

23、 液 抽 出 打 入 罐 外 的 膜 透析 器 的 一 侧 循 环 ， 其 另 一 侧 通 入 透 析 液 循 环 ， 在 补 料 分 批 培 养 中 ， 大 量 乙 酸在 透 析 器 中 透 过 半 透 膜 ， 降 低 培 养 基 中 的 乙 酸 浓 度 ， 并 可 通 过 在 透 析 液 中 补充 养 分 而 维 持 较 合 适 的 基 质 浓 度 ， 从 而 获 得 高 密 度 菌 体 。 膜 的 种 类 、 孔 径 、 面 积 ， 发 酵 液 和 透 析 液 的 比 例 ， 透 析 液 的 组 成 ， 循环 流 速 ， 开 始 透 析 的 时 间 和 透 析 培 养 的 持 续 时 间

24、 段 都 对 产 物 的 产 率 有 影 响 。 固 定 化 培 养 基 因 工 程 菌 培 养 的 一 大 难 题 是 如 何 维 持 质 粒 的 稳 定 性 。 有 人 将 固 定 化技 术 应 用 到 这 一 领 域 ， 发 现 基 因 工 程 菌 经 固 定 化 后 ， 质 粒 的 稳 定 性 大 大 提高 ， 便 于 进 行 连 续 培 养 ， 特 别 是 对 分 泌 型 菌 更 为 有 利 。 由 于 这 一 优 点 ， 基因 工 程 菌 固 定 化 培 养 研 究 已 得 到 迅 速 开 展 。 应 用 发 酵 罐 来 大 规 模 培 养 基 因 工 程 菌 。 为 了 防 止

25、工 程 菌 丢 失 携 带 的 质粒 ， 保 持 基 因 工 程 菌 的 遗 传 特 性 ， 因 而 对 发 酵 罐 的 要 求 十 分 严 格 。 由 于 生化 工 程 学 和 计 算 机 的 发 展 ， 新 型 自 动 化 发 酵 罐 完 全 能 满 足 这 些 要 求 。 常 规 的 微 生 物 发 酵 设 备 可 直 接 用 于 基 因 工 程 菌 的 培 养 。 不 同 点 在 于 ，微 生 物 发 酵 主 要 收 获 的 是 它 们 的 初 级 或 次 级 代 谢 产 物 ， 细 胞 生 长 并 非 主 要目 标 。 基 因 工 程 菌 培 养 是 为 了 获 得 最 大 量 的

26、基 因 表 达 产 物 。 由 于 这 类 物 质 是相 对 独 立 于 细 胞 染 色 体 之 外 的 重 组 质 粒 上 的 外 源 基 因 所 合 成 的 、 细 胞 并 不需 要 的 蛋 白 质 ， 因 此 ， 培 养 设 备 以 及 设 备 控 制 应 满 足 获 得 高 浓 度 的 受 体 细 胞 和 高 表 达 的 基 因 表 达 产 物 。 发 酵 罐 的 组 成 部 分 有 ： 发 酵 罐 体 保 证 高 传 质 作 用 的 搅 拌 器 、 精 细 的 温 度 控 制 和 灭 菌 系 统 、 空 气 无 菌 过 滤 装 置 残 留 气 体 处 理 装 置 参 数 测 量 与

27、控 制 系 统 （ 如 pH、 O 2、 CO2 等 ） 培 养 液 配 制 及 连 续 操 作 装 置 等 。 基 因 工 程 菌 在 发 酵 培 养 过 程 中 要 求 环 境 条 件 恒 定 ， 不 影 响 其 遗 传 特 性 ， 更 不 能 引 起 所 带 质 粒 丢 失 。对 发 酵 罐 有 特 殊 要 求 如 要 提 供 菌 体 生 长 的 最 适 条 件 培 养 过 程 不 得 污 染 保 证 纯 菌 培 养 培 养 及 消 毒 过 程 中 不 得 游 离 出 异 物 ， 干 扰 细 菌 代 谢 活 动 发 酵 罐 的 结 构 材 料 的 稳 定 性 要 好 ， 一 般 要 应

28、用 不 锈 钢 制 成罐 体 表 面 光 滑 易 清 洗 ， 灭 菌 时 没 有 死 角与 发 酵 罐 连 接 的 阀 门 要 用 膜 式 阀 ， 不 用 球 形 阀所 有 的 连 接 接 口 均 要 用 密 封 圈 封 闭 ， 不 留 “ 死 腔 ” ， 不 得 有 泄 漏搅 拌 器 转 速 和 通 气 应 适 当空 气 过 滤 系 统 要 采 用 活 性 碳 和 玻 璃 纤 维 棉 材 料培 养 液 要 经 化 学 处 理 或 热 处 理 后 才 可 排 放发 酵 罐 的 排 气 口 须 有 蒸 汽 灭 菌 或 微 孔 滤 器 除 菌 后 才 将 废 气 放 出 。轴 封 可 采 用 磁 力 搅 拌 或 双 端 面 密 封