细菌分离与鉴定方

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1、细菌分离与鉴定方法 嗜水气单胞菌分离鉴定 分离方法用途:在检查含两种或两种以上的待检材料（如肝、脾、肾、心、肌肉等）中的某种细菌时，须先将待检材料进行分离培养。常用的分离培养方法是琼脂平皿分区划线法，是借划线将混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来，使个别的细菌能固定在某一点，经培养生长繁殖后形成单个菌落，以达到分离获得纯种细菌的目的。 分离方法具体操作方法如下：点燃酒精灯，右手执笔式握持接种环（见图1），在酒精灯火焰上烧灼接种环，待冷，取待测菌液一环。左手抓握琼脂培养基平皿，用手掌将平皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬起一些，进行接种（见图2）。或者，将平皿的盖留在实验台上，尽量直立平皿靠近酒精灯火

2、焰，右手持接种环在琼脂表面的一端（即1区，约占整个平皿的1/61/5）涂布，划线时，接种环与琼脂表面呈 3040的角度轻轻接触，利用腕力动作，切忌划破琼脂表面。烧灼接种环，待冷后，将接种环通 过1区划线数次，在2区作连续划线，各线条间隔要小，但不能重叠。划满平皿的1/51/4区域，划完2区不需烧灼接种环，继续通过2区数次，在3区作连续划线，如此反复至划完整个平皿（如图3）。 图1 接种环的握持方法图2 平皿的握持方法1区4区3区2区 图3 划线分离的方法 左：分区 右：培养后的结果 分离方法接种完毕，盖好平皿盖，在平皿底玻璃上用记号笔注明标本名称、接种时间、接种者等。然后将平皿的底朝上，放置在

3、37孵箱内孵育24h。取出后观察琼脂表面的菌落分布情况（见图3），注意观察最后12区内是否分离出单个菌落，并观察记录菌落特征（如菌落大小、形状、透明度、色素等情况）。 烂鳃病病原菌平板划线分离： 取病鱼鳃丝一小块，置于滴有无菌水的载玻片的边缘，10分钟，用接种环蘸水，在胰胨琼脂培养基上划线。肠炎病病原菌划线分离： 用70%酒精棉球擦拭鱼体，无菌条件下，取病鱼的肝或脾或肾或心于普通营养琼脂基划线分离。赤皮病病原菌划线分离： 用刀片刮除病灶腐烂部分后用接种环挂取病料，在普通营养琼脂培养基上平板划线。28培养24h。 细菌的生长状况观察原理 细菌于适宜条件下在不同的培养基上生长，其生长状态不同。不同

4、细菌在同一种培养基中生长，生长特点也不相同。这些区别称之为培养特征，是鉴别细菌和细菌分类的依据之一。 把细菌接种在固体培养基上，在适宜的条件下经过一定时间的培养，在培养基表面（或内部）形成肉眼可见的有一个细菌大量繁殖后而成的集团，称之为菌落。不同细菌的菌落大小、光浊度、色泽均有其特征。 普通琼脂平板牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g氯化氯化钠（NaCL） 5.0g磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.0g琼脂 15.0g蒸馏水 1000mL混匀，加热溶解，调PH至7.6分装，112kPa高压灭菌15min，冷却至45倾注灭菌平板。直径90cm平皿每皿倾入1520ml培养基，培养基过少，划线分离时细

5、菌的营养较少，菌落生长过小，菌落形态不易观察，培养基也易于干燥，不易在数天内对菌落形 态进行观察。 含糖培养基灭菌条件115，1015分钟一般培养基灭菌条件121，1520分钟 细菌的生长状况观察在无菌平皿中，倒入溶化后50普通营养琼脂培养基，每皿约 20毫升，水平静置待凝固。用接种环挑去待分离菌株分区划线，28培养24h。菌落形态观察： 大小：以毫米计。 形状：圆形、不规则形、放射状等。 表面：光滑、粗糙、圆环状、乳突状等。 边缘：整齐、波形、锯齿状等。 色素：有颜色，颜色，是否可溶等。 透明度：透明、半透明、不透明。 嗜水气单胞菌菌落为光滑、微凸、圆整、无色或淡 黄色，有特殊芳香气味。 氧

6、化酶试验原理 氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，系由细胞色素a和a3所组成，一般仅存于需氧菌和兼性厌氧菌中，它使细菌能利用氧作为氢的最终受体，使分子氧还原为过氧化氢，过氧化氢的积累会有毒性，固本试验的阳性菌，不仅需氧而且能产生过氧化氢酶。氧化酶并不是直接与试剂起反应，而是先使细胞色素c氧化，然后此氧化型细胞色素c再使对苯二胺氧化，产生颜色反应，因而本试验实际也是测定细胞色素c是否存在。 氧化酶试验试剂 1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液或1%二盐酸四甲基对苯二胺水溶液。 方法 在干净的培养皿中放一张滤纸，滴上二甲基对本二胺的1%水溶液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿。用白金丝接

7、种环（不可用镍铬丝）取1824小时的菌苔，涂抹在湿润的滤纸上，在10s内涂抹菌苔现红色者这为阳性，(四甲基对本二胺呈蓝色)，1060s现红色者为延迟反应，60s以上现红色者不计，按阴性处理。 嗜水气单胞菌为阳性。 氧化酶试验注意事项二甲基对本二胺溶液易于氧化，一般于冰箱中储存两周。如溶液颜色转红褐色，则不宜使用。铁、镍等金属可催化二甲基对苯二胺呈红色，故不宜用以上材料取菌苔。如无白金丝，可用玻棒或灭菌牙签取菌苔涂抹。在滤纸上滴加试液已刚刚湿润为宜。如滤纸过湿，妨碍空气与菌苔接触，延长显色时间，造成假阴性。 AHM鉴别培养AHM为Aeromonas Hydrophila Medium 的缩写。用

8、于可疑气单胞菌菌落的鉴定。AHM鉴别培养基成分蛋白胨 5.0g酵母提取物 3.0g 胰蛋白胨 10.0gL-盐酸鸟氨酸 5.0g甘露醇 1.0g肌醇 10.0g硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O） 0.4g枸椽酸铁胺 0.5g溴甲酚紫 0.02g琼脂 3.0g 蒸馏水 1000mL制法 将各种成分（除溴甲酚紫外）溶化于1升水中，调pH6.7，加入溴甲酚紫，混匀煮沸。分装于13100mm试管，每管 5.0ml，于121，灭菌15分钟。（溴甲酚紫的有效pH范围5.26.8，颜色变化：黄紫） AHM鉴别培养方法以接种针挑取可疑菌落，穿刺接种达于管底，置352培养1824h，如反应不肯定，可继续培养1

9、824h。气单胞菌典型反应为培养基管底部为变黄，在接近于试管顶部有紫色带出现。此表明反因为甘露醇阳性，肌醇阴性，鸟氨酸脱羧酶阴性（鸟氨酸脱羧产生腐胺，可使培养基由酸变碱）。有时仅在试管顶端部有轻微变黑，此表明是因分解半胱氨酸产生硫化氢所致。沿穿刺线全部呈混浊状，表明该菌具有动力。 吲哚试验原理 细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚(靛基质)，经与试剂中的 对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色。培养基 1%蛋白胨水水溶液：调pH7.27.6，分装于1/31/4试管，115蒸汽灭菌30分钟。 Kovacs 试剂对二甲基氨基苯甲醛 5.0g 戊醇 75g（ml） 浓盐酸 25ml 吲哚试验方法

10、将新鲜的菌种接种与上述培养基中，28培养24 h。沿管壁缓缓加入35mm高的Kovacs试剂于培养液表面，在液层界面发生红色，即为阳性反应。若颜色不明显，可加45滴乙醚至培养基，摇动，使乙醚分散于液体中，将培养液静置片刻，待乙醚浮至液面后，在加吲哚试剂。如培养液中有吲哚时，吲哚可被提取在乙醚层中，浓缩的吲哚和试剂反应，则颜色明显。嗜水气单胞菌吲哚试验阳性 革兰氏染色法由丹麦病理学家Christain Gram创立，用于细菌分类学研究。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，用于细菌分类学研究。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法可将所有的细

11、菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。 革兰氏染色法基本原理用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。 革兰氏染色原理革兰氏染色过程：（结晶紫）初染 （碘液）

12、 媒染 （95%乙醇） 脱色 （番红花红） 复染。初染：当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。媒染：碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。脱色：当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，革兰氏阴性菌结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来。复染：革兰氏阳性细菌仍保留初染时的颜色，呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。 革兰氏染色法原理 革兰氏染色法之所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。 细菌细胞壁的结构 G菌：细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组

13、成，细胞壁厚，结构致密，类脂质含量低，用脱色剂处理后，肽聚糖脱水而孔径缩小，通透性降低，故革兰氏染色后细菌仍保留初染时的颜色，呈紫色。 G菌：其细胞壁肽聚糖层较薄，交联度低，类脂含量高，故脱色时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用番红花红 复染后，细菌被染上复染剂的颜色，即红色。 革兰氏染色法材料嗜水气单胞菌，葡萄球菌革兰氏染色液；载玻片；显微镜等。方法涂片：（1）取载玻片一张，试净。 （2）用灭菌的接种环取生理盐水一滴，放于载玻片的中央（如被检材料是液体，可不加生理盐水）。 （3）左手斜持菌种管，右手将菌种管棉塞稍加转动，以便拔下。（4）右

14、手持接种环，经火焰灭菌后，用右手小指拔开菌种管棉塞，管口通过火焰，用接种环取少量菌（切不可过多）。（5）管口再通过火焰，塞好棉塞。 （6）将接种环上的细菌加到载玻片的水滴内，磨匀，涂成直径约1厘米大小的薄薄菌膜。干燥：将玻片置于空气中，使其自然干燥。固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）干燥后将涂片在火焰上缓缓通过三次，其目的是使细菌粘于玻片上，染色和冲水时不易脱落；且细菌为蛋白质，被热凝固后可保持完整形态。固定时通过火焰12次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 革兰氏染色法染色：初染 媒染 脱色 复染初染：加草酸结晶紫染液于标本上，使其覆满标本，染12分钟，水

15、洗。媒染：滴加碘液冲去残水，并保持碘液覆盖1分钟，水洗。脱色：加95%酒精于玻片上来回流动，倾去酒精。如此重复23次（约30秒）。水洗。 或用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色。约2030秒钟，立即用水冲净酒精立即水洗。复染：加番红花红（沙黄液、稀释复红等），染约1分钟。水洗、干燥。镜检：干燥后用显微镜观察。革兰氏阴性菌成红色。革兰氏阳性均呈紫色。 以分散开的细菌革兰氏染色反应为准。过于密集的细菌染色后常常呈假阳性。同法在同一载玻片上以大肠杆菌和葡萄球菌混合纸片，作革兰氏染色对比。 革兰氏染色法革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度

16、，如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死及部分自行溶解，都常呈阴性反应。结果与思考在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和葡萄球菌被染成何种颜色？它们是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌？作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能保证你的染色技术操作正确，结果可靠？ G+ G-另一判断方法：取40ul 3%NaOH滴加于洁净的载波片上，用接种环刮去平板单个菌苔适量，在NaOH滴上研磨40S，用接种环挑起，若有拉丝现象，则为G-，否则为 G+ 糖发酵试验原理各种细菌因含有发酵不同糖类的酶，所

17、以分解糖类的能力各不相同，有的能分解多种糖类，有的仅能分解12中糖类，还有不能分解。细菌分解多糖类，如淀粉、菊糖等，因其分子较大，不能进入细菌细胞，必须被细菌分泌的胞外酶水解后，才能为细菌吸收利用。双糖也要胞外酶水解为单糖后被细菌所利用。细菌利用的单糖主要有葡萄糖、果糖等，细菌发酵葡萄糖可产生丙酮酸，生成乳酸、琥珀酸、甲酸、乙酸等有机酸，并生成醇类和气体（CO2和H2）。细菌分解糖类后产生的代谢产物可因菌种的不同而异，有的产酸、产气，有的则仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。 糖发酵试验培养基蛋白胨 5.0g溴甲酚紫（0.04%） 15 ml蒸馏水1000mL,调PH至7.4,分装，每瓶100m

18、l每100ml蛋白胨水中分别加入葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷及水杨苷1.0g，充分溶解，分装试管，106.44kPa高压灭菌10min。方法以幼龄斜面培养物分别接种上述发酵管，28培养24 h。凡试验管颜色从紫色变为黄色，表明细菌可发酵该种糖类，判为阳性。 嗜水气单胞菌可发酵以上5种糖类。 脱脂奶平板试验（酪蛋白胨化试验）原理大部分细菌无直接分解蛋白质的能力，多是利用蛋白质的分解产物，如蛋白胨和氨基酸等为其氮源。细菌分解蛋白质是依赖于蛋白酶和肽酶的作用，前者为胞外酶，能水解蛋白质为多肽和简单的肽，有时可释放出少量氨基酸，其功用是使不能吸收的蛋白质变为可以透入菌细胞内的多肽或氨基酸。后者为胞内

19、酶，能水解肽类为氨基酸，大部分肽酶需要锰、镁、铁、锌等离子作辅酶。 酪蛋白不溶于水，被水解的产物则能被溶解而是培养基呈现出透明状态。 脱脂奶平板试验（酪蛋白胨化试验）培养基-脱脂奶蔗糖胰蛋白胨平板磷酸二氢钾（KH2PO4） 10.0g氯化钾（KC1） 1.5g 蔗 糖 5.0g胰蛋白胨 5.0g脱脂奶粉 10.0g琼脂 15.0g蒸馏水 1000mL混匀，加热溶解，调PH至7.0，分装，112kPa高压灭菌15min，冷却至45，倾注灭菌平板。 脱脂奶平板试验（酪蛋白胨化试验）方法以待试菌接种划线于1%脱脂奶蔗糖胰蛋白胨平板，28培养24 h。若菌落周围出现清晰、透明的溶蛋白区环，则为阳性，否

20、则为阴性。嗜水气单胞菌酪蛋白胨化试验阳性 硫化氢试验原理： 某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸生成硫化氢，硫化氢与培养基中的醋酸铅或硫酸亚铁作用生成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀。黑色沉淀越多，表示生成的硫化氢量也越多。COOHCHNH2CH2SSCH2CHNH2COOHH24H2OH2S2NH3 胱氨酸 硫化氢2CH3COOH2HCOOHH2SPb(CH3COO)2PbS2CH3COOH硫化氢 醋酸铅 硫化铅（黑色） H2SFeSO4FeSH2SO4 硫化亚铁（黑色） 硫化氢试验方法：用接种针分别将大肠埃希菌、变形杆菌接种于醋酸铅培养基中，37培养1824h后观察结果。结果：阳性：沿穿刺线培养基变黑，用“”表示。阴性：培养基不变色，用“”表示。