生物制药工艺学第15章第三节重组DNA药物

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1、一 、 重 组 DNA技 术 与 基 因 工 程 的 基 本 定 义重 组 DNA技 术 是 指 将 一 种 生 物 体 ( 供 体 ) 的 基 因 与 载体 在 体 外 进 行 拼 接 重 组 , 然 后 转 入 另 一 种 生 物 体 ( 受体 ) 内 , 使 之 按 照 人 们 的 意 愿 稳 定 遗 传 并 表 达 出 新 产物 或 新 性 状 的 DNA体 外 操 作 程 序 , 也 称 为 分 子 克 隆 技术 。因 此 , 供 体 、 受 体 、 载 体 是 重 组 DNA技 术 的 三 大 基 本元 件 。 基 因 工 程 是 指 重 组 DNA技 术 的 产 业 化 设 计

2、与 应用 , 包 括 上 游 技 术 和 下 游 技 术 两 大 组 成 部 分 。上 游 技 术 指 的 是 基 因 重 组 、 克 隆 和 表 达 的 设 计 与构 建 ( 即 重 组 DNA技 术 ) ; 而 下 游 则 涉 及 到 基因 工 程 菌 或 细 胞 的 大 规 模 培 养 以 及 基 因 产 物 的 分离 纯 化 过 程 。 优 点 :1、 可 大 量 生 产 过 去 难 以 获 得 的 生 理 活 性 蛋 白和 多 肽 ; 去 除 内 源 性 物 质 的 不 足 之 处2、 提 供 足 够 数 量 的 生 理 活 性 物 质 , 以 进 行 生理 生 化 、 结 构 的

3、研 究3、 利 用 基 因 工 程 技 术 可 发 现 、 挖 掘 更 多 内 源性 生 理 活 性 物 质4、 获 得 新 型 化 合 物 产 品人 生 长 激 素 释 放 抑 制 素 ( SRM)人 胰 岛 素 首 次 克 隆表 达 时 间 国 家 用 途 首 次 进 入市 场 时 间 国 家 /地 区1977 日 本 治 疗 巨 人 症1978 美国 治 疗 糖 尿 病 1982 欧 洲人 生 长 激 素 ( HGH) 1979 美 国 治 疗 侏 儒 症 1985 美 国人 干 扰 素 ( IFN) 1980 美 国 治 疗 病 毒 感 染 症 1985 美 国乙 肝 疫 苗 1983

4、 美 国 预 防 乙 型 肝 炎 1986 欧 洲人 白 细 胞 介 素 2 1984 日 本 治 疗 肿 瘤 1989 欧 洲人 促 红 细 胞 生 成 素 治 疗 贫 血 1988 欧 洲 人 粒 细 胞 集 落 刺 激 因 子 治 疗 中 性 白 细 胞减 少 症 1991 美 国人 组 织 纤 溶 酶 原 激 活 剂( t-PA) 治 疗 血 栓 症 1987 美 国 获 得 目 的 基 因DNA的 体 外 重 组 ( 切 与 连 ) 载 体 的 选 择受 体 细 胞 的 选 择重 组 DNA分 子 转 化( 转 )转 化 子 的 筛 选 与 鉴 定 ( 选 )外 源 基 因 的 大

5、规 模 表 达 和 分 离 纯 化 产 品 的 检 验 和 制 剂 制 备 上 游 阶 段 : 实 验 室 获 得 目 的 基 因 、 酶 切 和 酶 连 、 插 入 适 当 载 体 、 转 入宿 主 细 胞 、 复 制 、 目 的 基 因 分 析 确 证 、 表 达 、 筛 选合 适 表 达 系 统 等下 游 阶 段 : 将 实 验 室 成 果 产 业 化 发 酵 参 数 确 定 、 新 型 生 物 反 应 器 研 制 、 高 效 分 离 介 质及 装 置 开 发 、 生 物 传 感 器 设 计 制 造 、 电 子 计 算 机 优化 控 制 、 产 品 质 量 控 制 v 注 意 : 上 游

6、 DNA重 组 的 设 计 必 须 以 简 化 下 游 操 作 工 艺 和 装 备为 指 导 思 想 ; 而 下 游 过 程 则 是 上 游 基 因 重 组 蓝 图 的 体 现 和 保证 , 这 是 基 因 工 程 产 业 化 的 基 本 原 则 。 1) 、 鸟 枪 法 ( 基 因 文 库 ) 基 因 组 DNA提 取 限 制 性 内 切 酶 部 分 水 解 与 载 体 连 接 转 化 、 扩 增 与 筛 选2) 、 逆 转 录 法 ( cDNA文 库 ) mRNA纯 化 cDNA第 一 合 成 第 二 链 合 成 cDNA克 隆 将 重 组 体 导 入 宿 主 细 胞 cDNA文 库 鉴

7、定 目 的 cDNA克 隆 的 分 离 和 鉴定3) 、 合 成 法4) 、 PCR法 4、 PCR法 或 逆 转 录 PCR( RT-PCR) 典 型 PCR反 应 包 括 模 板 变 性 94 以 上 ( 1 2) 退 火 50 55 ( 1 2) 延 伸 72 ( 1 2) 在 高 温 聚 合 酶 作 用 下 , 以 DNA单 链 为 模 板 , 由 引 物 起 始 从 53 延 伸 。 化 学 合 成 法 在 已 知 DNA序 列 或 多 肽 的 一 般 结 构 时 ,如 链 长 在 60bp 100bp可 用 化 学 合 成 法 直接 合 成 DNA。 1) 、 选 择 宿 主 细

8、胞 原 核 大 肠 杆 菌 : 生 长 快 ; 遗 传 研 究 深 入 ; 产 品 多 为胞 内 ( 包 含 体 ) 或 周 质 中 ; 不 能 糖 基 化 修 饰 。需 注 意 内 毒 素 污 染 。 枯 草 芽 孢 杆 菌 : 分 泌 力 强 , 不 形 成 包 含 体 ; 不修 饰 ; 胞 外 酶 可 能 会 降 解 产 物 链 霉 菌 : 分 泌 能 力 强 ; 不 致 病 , 安 全 ; 有 糖 基化 能 力 。 优 点 : 易 大 量 生 产 , 成 本 低 , 周 期 短 缺 点 : 多 为 胞 内 表 达 、 提 取 困 难 , 易 生成 包 含 体 、 含 起 始 密 码 M

9、et(AUG), 有 内毒 素 毒 性 真 核酵 母 : 研 究 基 因 表 达 调 控 最 有 效 的 单 细 胞 真 核微 生 物 ; 基 因 组 小 , 仅 为 大 肠 杆 菌 4倍 ; 传 代时 间 短 ; 无 毒 ; 有 分 泌 功 能 和 修 饰 功 能 ; 已 用于 干 扰 素 、 乙 肝 表 面 抗 原 等 重 组 DNA药 物 的生 产 。丝 状 真 菌 : 有 很 强 的 蛋 白 质 分 泌 能 力 , 能 正 确加 工 , 糖 基 化 方 式 与 高 等 生 物 相 似 , 有 成 熟 发酵 和 后 处 理 工 艺哺 乳 动 物 细 胞 : 类 似 天 然 产 物 , 但

10、 培 养 条 件 苛刻 大 肠 杆 菌 : 发 酵 包 含 体 复 性 纯 化 目 的 蛋 白真 核 细 胞 :发 酵 上 清 液 纯 化 目 的 蛋 白 高 效 表 达 的 目 的 蛋 白 在 大 肠 杆 菌 内 形 成 大 量 无 活 性 包 含 体 。 因 无 法 有 效 的 解 决 复 性 问 题 , 在 美 国 每 年 造 成 的 经 济 损 失 就 达 几 十 亿 美 元 包 含 体 电 镜 图 将 蛋 白 质 从 结 构 不 规 则 、 无 活 性 的 状 态 , 恢 复 到 有 唯 一 立 体 结 构 、 有 生 物 活 性 的 状 态 的 过 程 称 为 蛋 白 质 复 性

11、。 2) 、 表 达 载 体 要 求 :a、 能 独 立 复 制b、 有 灵 活 的 多 克 隆 位 点 和 方 便 的 筛 选 标 记c、 具 有 有 效 运 载 外 源 基 因 的 能 力 , 能 携 带 大小 不 同 的 外 源 基 因d、 容 易 控 制 , 在 细 胞 内 稳 定 性 高 , 安 全 可 靠 。 如 大 肠 杆 菌 的 pBV220系 统 , 为 温 度 诱 导 表达 载 体 , 已 成 功 用 于 IL-2, IL-3, IFN等 pET系 统 , 最 有 潜 力 的 系 统 , 可 用 乳 糖 代 替IPTG( 异 丙 基 硫 代 - -D-半 乳 糖 ) , 产

12、 物 可达 细 胞 总 蛋 白 2030%, 表 达 量 可 达 总 蛋 白50%。 3) 、 构 建 工 程 菌 目 的 基 因 与 载 体 DNA的 连 接v重 组 DNA向 宿 主 细 胞 内 转 移v筛 选 与 鉴 定 带 有 目 的 基 因 的 阳 性 克 隆v影 响 目 的 基 因 表 达 的 因 素 三 、 重 组 药 物 的 分 离 纯 化 A 重 组 蛋 白 分 离 纯 化 方 法 选 择 的 基 本 原 则 针 对 不 用 的 产 物 表 达 形 式 采 取 不 同 的 策 略 针 对 不 同 性 质 的 重 组 蛋 白 选 择 不 同 的 层 析 类 型 多 种 分 离

13、纯 化 技 术 的 联 合 运 用 合 适 分 离 纯 化 介 质 的 选 择 分 离 纯 化 过 程 的 规 模 化 针 对 不 同 的 产 物 表 达 形 式 采 取 不 同 的 策 略 采 用 分 泌 型 战 略 表 达 重 组 蛋 白 , 通 常 体 积 大 、 浓 度低 , 因 此 应 在 纯 化 之 前 采 用 沉 淀 或 超 滤 等 方 法 先 进 行浓 缩 处 理 ; 采 用 包 涵 体 型 战 略 表 达 重 组 蛋 白 , 应 先 离 心 回 收 包涵 体 ; 采 用 融 合 型 战 略 表 达 重 组 蛋 白 , 一 般 是 胞 内 可 溶 性的 , 拟 首 先 选 用

14、亲 和 层 析 进 行 纯 化 表 达 在 细 胞 膜 和 细 胞 壁 之 间 的 间 隙 中 的 蛋 白 质 , 应用 低 浓 度 的 溶 菌 酶 处 理 , 然 有 再 用 渗 透 压 休 克 法 释 放重 组 蛋 白 。 针 对 不 同 性 质 的 重 组 蛋 白 选 择 不 同 的 层 析 类 型 等 电 点 处 于 极 端 区 域 ( 大 于 8或 小 于 5) 的 重 组 蛋 白 应 首 选离 子 交 换 法 进 行 分 离 , 这 样 很 容 易 除 去 几 乎 所 有 的 杂 蛋 白 ; 重 组 蛋 白 特 异 性 的 配 体 、 底 物 、 抗 体 、 糖 链 等 都 是 首

15、 选 亲和 层 析 纯 化 方 法 的 重 要 条 件 , 原 则 是 它 们 与 目 标 蛋 白 之 间 的 解离 常 数 应 在 合 适 的 范 围 内 ( 10 8 10 4mol/L) ; 疏 水 层 析 和 反 相 层 析 是 根 据 蛋 白 质 的 疏 水 性 差 异 进 行 分 离的 ; 凝 胶 过 滤 层 析 是 根 据 蛋 白 的 分 子 量 和 体 积 差 异 进 行 分 离 的 ; 径 向 层 析 是 近 年 来 发 展 起 来 的 集 层 析 分 离 和 膜 分 离 于 一 体的 一 种 复 合 技 术 , 在 流 量 、 负 荷 量 等 参 数 方 面 显 示 出 极

16、 大 的 优越 性 。 多 种 分 离 纯 化 技 术 的 联 合 运 用 在 进 行 重 组 蛋 白 的 纯 化 时 , 通 常 需 要 综 合 使 用 多 种技 术 , 一 般 来 说 , 在 选 择 分 离 纯 化 方 法 时 应 遵 循 下 列原 则 : 应 选 择 不 同 分 离 纯 化 机 理 的 方 法 联 合 使 用 应 首 先 选 择 能 除 去 含 量 最 多 杂 质 的 方 法 应 尽 量 选 择 高 效 的 分 离 方 法 应 将 最 费 时 、 成 本 最 高 的 分 离 纯 化 方 法 安 排 在 最后 阶 段 合 适 分 离 纯 化 介 质 的 选 择常 用 的

17、蛋 白 质 分 离 纯 化 介 质 有 Sephadex和Sepharose。 理 想 的 分 离 纯 化 介 质 应 具 有 下 列性 质 : 对 目 标 蛋 白 具 有 较 高 的 分 辨 效 率 对 目 标 蛋 白 不 会 造 成 变 性 化 学 性 能 和 机 械 性 能 稳 定 , 重 复 性 好 价 格 低 廉 分 离 纯 化 过 程 的 规 模 化 蛋 白 质 分 离 纯 化 的 实 验 室 工 艺 、 技 术 、 方 法 在 大规 模 产 业 化 过 程 未 必 合 适 , 如 : 实 验 室 方 法 在 工 程 上 可 能 难 以 实 现 ( 超 声 波 破细 胞 壁 ) 实

18、 验 室 方 法 在 大 规 模 生 产 中 可 能 成 本 过 高 ( 超速 离 心 ) 因 此 , 在 很 多 情 况 下 , 实 验 室 的 技 术 路 线 不 等 于生 产 工 艺 。 v1、 原 材 料 质 量 控 制 : 2、 培 养 过 程 质 量 控 制 3、 纯 化 工 艺 质 量 控 制 4、 目 标 产 品 质 量 控 制 保 证 编 码 DNA序 列 正 确 要 了 解 以 下 特 性 : A、 目 的 基 因 来 源 、 克 隆 过 程 、 序 列 B、 表 达 载 体 名 称 、 结 构 、 遗 传 特 性 及 酶 切 图谱 、 抗 生 素 标 记 等 C、 宿 主

19、 名 称 、 来 源 、 传 代 历 史 、 检 定 结 果 及生 物 学 特 征 D、 载 体 引 入 宿 主 方 式 、 及 载 体 再 宿 主 中 状 态 E、 插 入 基 因 于 表 达 载 体 两 侧 控 制 区 核 酸 序 列 F、 启 动 和 控 制 克 隆 基 因 表 达 的 方 法 及 水 平 v种 子 克 隆 纯 而 且 稳 定 , 在 培 养 工 程 中 工程 菌 不 应 出 现 无 突 变 或 质 粒 丢 失 的 现 象v种 子 批 系 统v工 作 细 胞 库 v尽 量 去 除 污 染 病 毒 、 核 酸 、 宿 主 细 胞 杂 蛋 白等 杂 质 , 并 避 免 在 纯

20、 化 过 程 带 入 有 害 物 质 纯 化 每 一 步 应 测 定 纯 度 、 计 算 提 纯 倍 数 、 收率 等 等 1) 、 产 品 的 鉴 别氨 基 酸 组 成 分 析 : 肽 图 分 析 :N末 端 和 C末 端 氨 基 酸 测 序 :蛋 白 质 二 硫 键 的 分 析 :重 组 蛋 白 相 对 分 子 量 :等 电 点 的 测 定 :2) 、 纯 度 分 析 : SDS-PAGE, CE, IEF, HPLC3) 、 生 物 活 性 测 定4) 、 残 余 杂 质 检 测 宿 主 细 胞 蛋 白 含 量 、 宿 主 细 胞 DNA、 残 余 抗 生 素 等5) 、 安 全 性 检

21、 测 无 菌 实 验 、 热 原 实 验 、 毒 性 实 验 、 免 疫 原 性 检 查 A 体 内 生 物 学 活 性 测 定 方 法 生 物 学 模 型 生 长 激 素 大 鼠 脑 垂 体B 体 外 生 物 学 活 性 测 定 方 法 如 : MTT法 : MTT formazan (蓝 紫 色 ) 干 扰 素 类 蛋 白 : 可 用 细 胞 毒 抑 制 试 验 来 测 定 干扰 素 的 体 外 活 性 。 ( 一 ) 利 用 重 组 大 肠 杆 菌 生 产 医 用 蛋 白 或 多 肽 代 表 产 品 : 重 组 人 胰 岛 素 、 重 组 人 生 长 激 素 、 重 组 人 干 扰 素

22、、重 组 人 白 细 胞 介 素 、 重 组 人 集 落 刺 激 因 子 、 重 组 抗 体 及 其 片断 等 。 v 1) 、 干 扰 素 ( IFN- 、 、 ) 1957年 Isaccs等 发 现 病 毒 干 扰 现 象 , 即 病 毒 感染 的 细 胞 能 产 生 一 种 因 子 , 作 用 于 其 他 细 胞 干扰 病 毒 复 制 , 因 而 命 名 为 干 扰 素 。 根 据 产 生 干 扰 素 细 胞 的 来 源 、 理 化 性 质 和 生 物活 性 等 差 异 , 可 分 为 、 、 等 3种 , 其 中IFN- 为 多 基 因 产 物 , 有 23种 以 上 的 亚 型 。

23、1986年 , FDA批 准 Roch公 司 的 重 组 IFN- 2a和 Schering公 司 的 重 组 IFN- 2b, 重 组IFN- 、 分 别 在 1990年 和 1993年 上 市 。 我 国 中 国 预 防 医 学 科 学 院 病 毒 学 研 究 所 侯云 德 等 发 现 中 国 人 受 病 毒 攻 击 产 生 的 干 扰素 主 要 为 IFN- 1b型 , 1992年 我 国 第 一 个基 因 工 程 药 物 IFN- 1b获 得 国 家 一 类 新 药证 书 。 2) 胰 岛 素 (Insulin, Ins)1921年 , Banting FG等 从 胰 脏 中 分 离1

24、955年 , Sanger F测 序1965年 , 我 国 完 成 结 晶 牛 胰 岛 素 全 合 成1979年 , Rutter W等 克 隆 了 胰 岛 素 基 因1982年 , 第 一 个 重 组 人 胰 岛 素 批 准 上 市 v胰 岛 素 的 结 构 及 生 物 合 成v胰 岛 素 原 与 胰 岛 素v人 胰 岛 素 的 生 产 方 法 v产 人 胰 岛 素 大 肠 杆 菌 工 程 菌 的 构 建 策 略 v (a) AB链 分 别 表 达 法 体 外 折 叠 成 功 率 低 , 通 常 只有 10 20v (b) 人 胰 岛 素 原 表 达 法 由 于 C肽 的 存 在 , 胰 岛

25、 素原 在 复 性 条 件 下 能 形 成 天 然 的 空 间 构 象 , 为 三 对二 硫 键 的 正 确 配 对 提 供 了 良 好 的 条 件 , 使 得 体 外折 叠 率 高 达 80 以 上 目 前 Ely Lily用 这 种 工 艺 路线 年 产 几 十 吨 的 重 组 人 胰 岛 素 , 其 经 济 效 益 相 当可 观 。v (c) AB链 同 时 表 达 法 3) 生 长 激 素1944年 , 李 卓 浩 等 从 牛 垂 体 中 分 离 出 牛 生 长 激 素1956年 , 从 人 垂 体 中 分 离 出 hGH1969年 , hGH序 列 报 道 临 床 上 用 于 垂 体

26、 性 侏 儒 症 。 19561985年 , 只能 从 人 尸 体 垂 体 中 分 离 纯 化 。 但 至 1985年 , 共发 现 50多 例 克 -雅 氏 症 , 5人 病 亡 , 研 究 结 果 证实 由 垂 体 来 源 的 生 长 激 素 污 染 有 朊 病 毒 。1985年 , 垂 体 来 源 的 被 禁 用 , 同 年 , rhGH上 市 。 v1985年 , 美 国 FDA批 准 由 大 肠 杆 菌 发 酵 生 产的 重 组 人 生 长 激 素 上 市 , 随 后 各 种 途 径 生 产的 重 组 人 生 长 激 素 迅 速 充 斥 市 场 。 1997年 ,仅 美 国 Gene

27、ntech和 Ely Lily两 家 公 司 的 重 组人 生 长 激 素 年 产 量 已 达 20kg, 年 销 售 额 超 过3.5亿 美 元 。 v人 生 长 激 素 的 结 构 与 性 质v重 组 人 生 长 激 素 工 程 菌 的 构 建 优 势 :v 1.最 简 单 的 真 核 生 物 , 基 因 表 达 调 控 机 理 较 清 楚 ,并 且 遗 传 操 作 相 对 较 为 简 单 ;v 2.具 有 原 核 无 法 比 拟 的 真 核 生 物 蛋 白 翻 译 后 修 饰加 工 系 统v 3.不 含 有 特 异 性 的 病 毒 , 不 产 生 毒 素 , 有 些 酵 母菌 在 食 品

28、 工 业 当 中 有 着 几 百 年 的 应 用 历 史 , 属 于安 全 型 基 因 工 程 受 体 系 统 ;v 4.大 规 模 发 酵 工 艺 简 单 , 成 本 低 廉v 5.能 将 外 源 基 因 表 达 产 物 分 泌 至 培 养 基 中劣 势 : 虽 然 拥 有 完 整 的 蛋 白 质 糖 基 化 修 饰 系 统 , 但 其修 饰 方 式 不 用 于 高 等 真 核 生 物 。 v 举 例 : 重 组 乙 肝 疫 苗 重 组 人 血 清 白 蛋 白 v 人 血 清 白 蛋 白 HAS是 血 浆 中 的 主 要 成 分 载 体 蛋 白 。 成熟 的 人 血 清 白 蛋 白 为 一

29、非 糖 基 化 的 单 一 多 肽 链 , 由585个 氨 基 酸 组 成 , 含 有 17对 二 硫 键 , 由 此 维 系 的 空间 构 象 是 血 清 白 蛋 白 的 生 物 功 能 所 必 需 的 。 v 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 是 迄 今 为 止 最 为 优 良 的 重 组 人 血 清 白蛋 白 的 表 达 分 泌 系 统 。 产 率 可 高 达 15g/L v1.利 用 动 物 乳 腺 组 织 生 产 蛋 白 药 物v 酪 蛋 白 、 tPA 、 IL 2v2.利 用 哺 乳 动 物 细 胞 大 规 模 培 养 技 术 生 产 复杂 的 人 体 蛋 白v例 如 EPO 促 红

30、细 胞 生 成 素 ( EPO) 由 肾 脏 分 泌 的 一 种 唾 液 酸 蛋 白 , 它 能 促 进 红细 胞 系 的 增 值 、 分 化 和 成 熟 . 由 166个 氨 基 酸 残 基 组 成 的 高 度 糖 基 化 蛋 白 ,其 糖 基 对 其 生 物 活 性 至 关 重 要 目 前 用 哺 乳 动 物 细 胞 表 达 系 统 如 CHO细 胞 生 产 。 临 床 为 治 疗 肾 衰 导 致 贫 血 的 首 选 药 物 , 全 世 界销 售 额 超 过 10亿 美 元 。 v1957年 Jacobson等 证 实 , 肾 脏 是 血 清 EPO的主 要 来 源 , 含 量 极 微 小

31、 , 无 法 分 离 纯 化 获 得纯 品 。 直 到 1985年 , Jacobs等 才 先 后 成 功 克隆 出 人 、 猴 、 小 鼠 的 EPO基 因 , 随 后 重 组 人EPO在 CHO细 胞 中 获 得 表 达 , 并 通 过 层 析 纯化 技 术 制 备 出 rHuEPO纯 品 , 于 1989年 获 得美 国 FDA批 准 后 首 次 投 放 市 场 。 v 根 据 已 知 天 然 EPO的 氨 基 酸 序 列 , 合 成 相 应 的 寡 聚 核 苷 酸探 针 , 筛 选 出 人 EPO基 因 , 引 入 真 核 生 物 质 粒 表 达 载 体PD11,用 磷 酸 钙 微 量

32、 沉 淀 法 转 染 CHO细 胞 , 克 隆 培 养 后 , 检测 培 养 上 清 中 EPO的 生 物 学 活 性 , 筛 选 出 高 效 表 达 EPO的细 胞 株 , 按 照 中 国 生 物 制 品 规 程 要 求 建 立 种 子 库 , 检 定合 格 后 用 于 生 产 。v CHO工 程 细 胞 在 条 件 培 养 基 中 培 养 时 , 表 达 的 EPO分 泌到 培 养 上 清 中 , 上 清 液 中 除 了 EPO外 , 还 含 有 培 养 基 成 分和 其 他 杂 蛋 白 , 利 用 EPO 本 身 的 物 理 化 学 性 质 , 将 培 养 上清 液 加 热 至 80 ,

33、 或 用 6mol/L盐 酸 胍 、 8mol/L尿 素 沉 淀 ,可 以 除 去 大 多 数 杂 蛋 白 。 上 清 液 超 滤 浓 缩 后 , 经 过 一 系 列 的凝 胶 过 滤 层 析 , 如 Sephadex G 25, Sephacryl S 200及 Bio gel P 等 多 步 凝 胶 过 滤 , 其 EPO的 纯 度 可 达 到 90以 上 。 进 一 步 纯 化 可 用 Sepharose 4B偶 联 EPO单 克 隆 抗 体或 多 克 隆 抗 体 亲 和 层 析 或 经 高 压 液 相 层 析 , 其 EPO纯 度 可达 99 以 上 。 根 据 氨 基 酸 序 列合 成 寡 聚 核 苷 酸 筛 选 出 EPO基 因 与 真 核 载 体 连 接 转 化 重 组 质 粒转 染 CHO筛 选 高 表 达 CHO工 程 细 胞 建 立 种 子 库CHO工 程 细 胞 培 养 培 养 液 去 杂 蛋 白 初 提 取 液80 盐 酸 胍 凝 胶 层 析 EPO 纯 度达 90HPLC 或 亲 合 层析 EPO纯 度 达 99

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