酶通论1经典案例

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1、第 8章 酶 通 论 酶 学 研 究 简 史 酶 (enzyme)希 腊 语 原 意 : in yeast， 生 物 体 内 催 化 化学 反 应 的 物 质 ， 细 胞 中 的 球 蛋 白 多 数 为 酶 。 1783年 Spallamzan 发 现 鸟 的 胃 液 能 消 化 肉 。 1814年 Kirchhoff发 现 稀 酸 对 淀 粉 的 加 水 分 解 作 用 。并 发 现 麦 芽 抽 提 液 加 入 淀 粉 后 能 生 成 麦 芽 糖 , 即 麦 芽 抽 提液 中 必 定 有 能 水 解 淀 粉 的 水 溶 性 物 质 ferment (酵 素 )。 1830年 Kuhle开 始

2、 使 用 Enzyme这 一 术 语 。 1833年 Payen Mg 2+ ions are required for activity. The phosphodiester bond at the site of self-cleavage is indicated by an arrow. (三 )核 酶 的 研 究 意 义 及 应 用 前 景 核 酶 的 发 现 表 明 RNA既 能 够 携 带遗 传 信 息 ， 又 具 有 生 物 催 化 功 能 ，因 此 人 们 推 测 RNA很 可 能 早 于 DNA和 蛋 白 质 ， 是 生 物 进 化 史 中 首 先出 现 的 生 物 大

3、分 子 ， 这 是 一 种 生命 起 源 的 新 概 念 。 对 核 酶 结 构 与作 用 机 理 的 研 究 可 帮 助 人 们 设 计生 物 体 内 本 不 存 在 的 核 酶 ， 作 为工 具 酶 去 催 化 特 定 的 反 应 。 由 于 Cech和 Altman的 实 验 是 同 时 且 各 自 独 立 的发 现 了 核 酶 ， 他 们 的 发 现 具 有 巨 大 的 意 义 ， 因 此 两人 被 授 予 1989年 诺 贝 尔 化 学 奖 。 七 、 抗 体 酶 (一 )抗 体 酶 的 概 念 以 对 硝 基 苯 酚 磷 酸 胆 碱 酯 为 半 抗 原 得 到 的 单 克 隆 抗

4、体 有 酯酶 活 性 ； 以 含 有 吡 啶 甲 酸 的 膦 酸 酯 类 似 物 为 半 抗 原 得 到 的 单 克隆 抗 体 可 以 水 解 羧 酸 酯 化 合 物 ； 以 N-甲 基 原 卟 啉 为 半 抗 原 得 到的 单 克 隆 抗 体 可 以 催 化 平 面 状 卟 啉 的 金 属 螯 合 反 应 。 (a) The intramolecular hydrolysis of a hydroxy ester to yield as products a -lactone and the alcohol phenol. Note the cyclic transition state.

5、(b) The cyclic phosphonate ester analog of the cyclic transition state. Antibodies raised against this phosphonate ester act as enzymes: they are catalysts that markedly accelerate the rate of ester hydrolysis. Catalytic antibodies are designed to specifically bind the transition-state intermediate

6、in a chemical reaction. (a) Antigen used to create an abzyme with aminotransferase activity.(b) Aminotransferase reaction catalyzed by the abzyme. (二 ) 抗 体 酶 的 研 究 意 义 及 应 用 前 景 对 抗 体 酶 的 制 备 和 研 究 不 仅 为 过 渡 态 理 论及 诱 导 契 合 假 说 提 供 了 有 利 的 实 验 证 据 ， 所 制备 的 各 种 抗 体 酶 在 医 学 与 工 业 领 域 也 具 有 良 好的 应 用 前 景

7、 ， 例 如 具 有 立 体 专 一 性 的 抗 体 酶 可在 制 药 工 业 上 用 于 制 备 单 一 构 型 的 药 物 分 子 ，某 些 同 时 具 有 抗 体 功 能 与 酶 功 能 的 抗 体 酶 由 于可 以 特 异 性 地 识 别 癌 细 胞 表 面 的 特 殊 抗 原 ， 并在 此 部 位 催 化 无 活 性 药 物 前 体 的 转 化 反 应 ， 可用 于 靶 向 治 疗 癌 症 。 八 、 酶 工 程 简 介 (一 ) 化 学 酶 工 程1.天 然 酶 的 合 理 应 用 酶 类 在 医 药 、 食 品 、 科 研 、 化 工 领 域 的 应 用 及 新 酶 制剂 的 开

8、 发 。2.化 学 修 饰 酶 酶 功 能 基 的 化 学 修 饰 ， 如 酰 化 反 应 修 饰 天 冬 酰 胺 酶（ 抗 白 血 病 ） 可 提 高 其 稳 定 性 。 修 饰 胰 凝 乳 蛋 白 酶 的 表面 氨 基 ， 增 强 其 亲 水 性 ， 可 提 高 其 热 稳 定 性 ； 交 联 反 应 ，如 半 乳 糖 苷 酶 A经 交 联 修 饰 后 稳 定 性 增 强 ； 大 分 子 修 饰作 用 ， 如 用 葡 萄 糖 修 饰 淀 粉 酶 ， 用 聚 乙 二 醇 修 饰 天 冬 酰胺 酶 ， 用 肝 素 、 葡 萄 糖 或 聚 乙 二 醇 修 饰 尿 激 酶 均 可 提 高 其热 稳

9、 定 性 。 3.固 定 化 酶 吸 附 法 ； 偶 联 法 ； 交 联 法 ； 包 埋 法 ； 固 定 化 细 胞 ； 酶 电 极和 传 感 器 。4.人 工 模 拟 酶 以 环 糊 精 为 基 础 制 成 的 胰 凝 乳 蛋 白 酶 人 工 模 拟 酶 催 化 效率 与 天 然 酶 相 似 ， 稳 定 性 较 天 然 酶 好 。常 用 的 酶 的 固 定 化 方 法1, 吸 附 法 ； 2, 共 价 结 合 法 ； 3, 交 联 法 ； 4, 凝 胶 包 埋 法 ； 5, 微 胶 囊 化 法 (二 ) 生 物 酶 工 程1.用 基 因 工 程 生 产 酶 已 有 200多 种 酶 的 基

10、因 克 隆 成 功 ， 有 一 些 可 以高 效 表 达 ， 尿 激 酶 原 、 tPA等 已 投 入 生 产 。2.用 蛋 白 质 工 程 改 造 酶 用 蛋 白 质 工 程 改 造 酶 ， 可 以 改 变 酶 的 催 化 活性 、 底 物 专 一 性 、 调 节 功 能 、 对 辅 酶 的 要 求 ， 可以 提 高 酶 的 稳 定 性 ， 一 些 例 子 （ 7个 ） 如 表 8-10所示 。3.设 计 新 的 酶 基 因 ， 合 成 自 然 界 不 曾 有 的 新 酶 已 有 明 显 进 展 ， 有 广 阔 的 发 展 前 景 。 基 本 要 求1.掌 握 酶 催 化 作 用 的 特 点

11、 。 （ 重 点 ）2.掌 握 酶 的 化 学 本 质 及 其 组 成 。 （ 重 点 ）3.熟 悉 酶 的 命 名 和 分 类 。 （ 重 点 ）4.掌 握 酶 的 专 一 性 。 （ 重 点 ）5.掌 握 酶 的 活 力 测 定 和 分 离 纯 化 的 常 用 方 法 。 重 点 ）6.熟 悉 核 酶 和 抗 体 酶 。 （ 难 点 ）7.熟 悉 酶 工 程 的 基 本 知 识 和 发 展 现 状 。 （ 重 点 ） 作 业 题第 349页 第 9题 ；第 349页 第 10题 ；第 349页 第 12题 ；第 349页 第 13题 ；第 349页 第 14题 ；第 349页 第 15题

12、； 第 9章 酶 促 反 应 动 力 学 一 、 化 学 动 力 学 基 础 (一 ) 反 应 速 率 及 其 测 定 Plot of the course of a firstorder reaction. The half-time, t1/2, is the time for one-half of the starting amount of A to disappear. (二 )反 应 分 子 数和 反 应 级 数1.反 应 分 子 数2.反 应 级 数(三 )各 级 反 应 的特 征 1.一 级 反 应 其 速 率 与 反 应 物 浓度 的 一 次 方 成 正 比 。 -dc/d

13、t = kc -dc/dt = kclnc = -kt + lnc0Lnc = -kt + B （ 直线 ）K = (1/t)ln(c0/c)c =（ 1/2） c0 时K = (ln2)/t1/2t1/2 = (ln2)/k半 衰 期 与 反 应 物 的 初始 浓 度 无 关 2.二 级 反 应反 应 的 速 率 与 反 应 物 浓 度 的二 次 方 成 正 比（ 1） 若 A和 B为 同 一 物 质-dc/dt = kc2，dc/c2 = - kdtc/c0 = 1/(1+kc0t)c/c0 = 1/2 时k = 1/c0t1/2 （ 3） A和 B的 初 始 浓 度 不 同 :k = 1

14、/t（ ab)/lnb(ax)/a(bx)（ 2） A和 B的 初 始 浓 度 相 同 : k = (1/t)x/a(ax) a:反 应 物 A的 初 始 浓 度 ； b:反 应 物 B的 初 始 浓 度(a-x):反 应 时 间 为 t时 A的 浓 度(b-x):反 应 时 间 为 t时 B的 浓 度k = 1/at1/2 t1/2 = 1/ka 3.零 级 反 应反 应 速 率 与 反 应 物 的 浓 度 无 关-dc/dt = k或 dx/dt = kx = kt或 k = x/t Effect of substrate concentration on the initial velo

15、city of an enzyme-catalyzed reaction. Vmax is extrapolated from the plot, because V0 approaches but never quite reaches Vmax. The substrate concentration at which V0 is half maximal is Km, the Michaelis constant. The concentration of enzyme in an experiment such as this is generally so low that S E

16、even when S is described as low or relatively low. The units shown are typical for enzyme-catalyzed reactions and are given only to help illustrate the meaning of V0 and S. 二 、 底 物 浓 度 对 酶 反 应 速 率的 影 响 (Note that the curve describes part of a rectangular hyperbola, with one asymptote at Vmax. If the

17、 curve were continued below S = 0, it would approach a vertical asymptote at S = -Km.) The reaction rate, v, as a function of S is described by a rectangular hyperbola. At very high S, v = Vmax. That is, the velocity is limited only by conditions (temperature, pH, ionic strength) and by the amount o

18、f enzyme present; v becomes independent of S. Such a condition is termed zero-order kinetics. Under zero-order conditions, velocity is directly dependent on enzyme. The H2O molecule provides a rough guide to scale. The substrate is bound at the active site of the enzyme. Substrate saturation curve f

19、or an enzyme-catalyzed reaction. The amount of enzyme is constant, and the velocity of the reaction is determined at various substrate concentrations. (一 )中 间 产 物 学说 中 间 产 物 学说 的 实 验 依 据 ：（ 1） 核 酸 和 酶 的复 合 物 可 直 接 用电 镜 观 察 ； （ 2）图 9-7 ； （ 3） 复合 物 的 溶 解 度 和稳 定 性 有 所 变 化 ；（ 4） 有 些 复 合 物可 直 接 分 离 得 到 。

20、 Time course for the consumption of substrate, the formation of product, and the establishment of a steady-state level of the enzyme-substrate ES complex for a typical enzyme obeying the Michaelis Menten, BriggsHaldane models for enzyme kinetics. The early stage of the time course is shown in greate

21、r magnification in the bottom graph.酶 催 化 的 反 应 中 各 成 份 的 变 化 酶 反 应 的 初 速 度 与 底 物 浓 度 之 间 的 关 系The curve expressing the relationship between S and V0 has the same general shape for most enzymes (it approaches a rectangular hyperbola), which can be expressed algebraically by the Michaelis-Menten equa

22、tion. Michaelis and Menten derived this equation starting from their basic hypothesis that the ratelimiting step in enzymatic reactions is the breakdown of the ES complex to product and free enzyme. (二 )酶 促 反 应 的 动 力 学 方 程 式 1.米 氏 方 程 的 推 导 k 2Et = Vmax= Km Briggs (b) parallel lines indicate a Ping-

23、Pong (double-displacement) pathway. 三 、 酶 的 抑 制 作 用（ 一 ） 抑 制 程 度 的 表 示 方 法 相 对 活 力 分 数 a = vi/v0 相 对 活 力 百 分 数 a =（ vi/v0） 100% 抑 制 分 数 I = 1 a = 1 -（ vi/v0） 抑 制 百 分 数 I = (1-a) 100% = 1-（ vi/v0) 100%（ 二 ） 抑 制 作 用 的 类 型 不 可 逆 的 抑 制 作 用 可 逆 的 抑 制 作 用（ 三 ） 可 逆 抑 制 作 用 和 不 可 逆 抑 制 作 用 的 鉴 别 透 析 、 超 滤 、

24、 凝 胶 过 滤 能 否 除 去 抑 制 剂 ； 酶 浓 度 对 反 应 速 度 作 图 ， 不 可 逆 抑 制 剂 使 直 线 右 移 ， 可逆 抑 制 剂 使 直 线 的 斜 率 下 降 （ 图 9-18） 。 （ 四 ） 可 逆 抑 制 作 用 的 动 力 学Three types of reversible inhibition. (a) Competitive inhibitors bind to the enzymes active site. (b) Uncompetitive inhibitors bind at a separate site, but bind only t

25、o the ES complex. (c) Mixed inhibitors bind at a separate site, but may bind to either E or ES. K I is the equilibrium constant for inhibitor binding to E; KI is the equilibrium constant for inhibitor binding to ES. Eo = E + ES + EI 竞 争 性 抑 制 LineweaverBurk plot of competitive inhibition, showing li

26、nes for no I, I, and 2I. Note that when S is infinitely large (1/S = 0), Vmax is the same, whether Iis present or not. In the presence of I, the negative x-intercept = -1/Km(1+I/KI). E + S ES E + P + Ki + Ki E ES非 竞 争 性 抑 制 (Noncompetitive inhibition)Eo = E + ES + EI + ESI LineweaverBurk plot of pur

27、e noncompetitive inhibition. Note that I does not alter Km but that it decreases Vmax. In the presence of I, the y-intercept is equal to (1/Vmax)(1+I/KI). Eo = E + ES + ESI 反 竞 争 性 抑 制 混 合 型 LineweaverBurk plot of mixed noncompetitive inhibition. Note that both intercepts and the slope change in the

28、 presence of I. (a) When KI is less than KI; (b) when KI is greater than KI. vVmax = k3ESk3E0 = Ef +ES+ EIES （ 1)由 于 Km = EfSES 则 ES= Ef SKm (2)由 于 Ki = EfIEI 则 EI= Ef I Ki (3)将 (2)和 (3)代 入 （ 1) vVmax = Ef S/ KmE f + Ef S/ Km + Ef I/ Ki分 子 和 分 母 同 除 以Ef ,同 称 以 Km = SKm + S+ Km I/ Ki即 v = Vmax SKm（ 1

29、+ （ I/ Ki） + S 竞 争 性 抑 制 动 力 学 方 程 的 推 导 不同类型抑制作用的米氏方程 （ 五 ） 一 些 重 要 的 抑 制 剂不 可 逆 抑 制 剂 非 专 一 抑 制 剂 ： 有 机 磷 (作 用 于 羟 基 酶 类 ，特 别 是 胆 碱 酯 酶 ， 可 用 肟 类 解 毒 ） 、 有 机 汞 和 有机 砷 (作 用 于 巯 基 ， 可 用 过 量 的 巯 基 化 合 物 解毒 ） 、 重 金 属 盐 （ 使 蛋 白 质 变 性 失 活 ， 可 用 螯 合剂 解 毒 ） 、 氰 化 物 、 硫 化 物 和 一 氧 化 碳 （ 作 用 于酶 中 的 金 属 离 子 ，

30、 使 酶 失 活 而 阻 止 呼 吸 ） 、 青 霉素 （ 抑 制 细 菌 的 糖 肽 转 移 酶 ） 等 ； 专 一 抑 制 剂 ： Ks型 抑 制 剂 修 饰 活 性 基 团 ，K cat型 抑 制 剂 为 自 杀 型 底 物 ； Suicide SubstratesMechanism-Based Enzyme Inactivators Suicide substrates are inhibitory substrate analogs designed so that, via normal catalytic action of the enzyme, a very reactive

31、 group is generated. This reactive group then forms a covalent bond with a nearby functional group within the active site of the enzyme, thereby causing irreversible inhibition. Suicide substrates, also called Trojan horse substrates, are a type of affinity label. As substrate analogs, they bind wit

32、h specificity and high affinity to the enzyme active site; in their reactive form, they become covalently bound to the enzyme. This covalent link effectively labels a particular functional group within the active site, identifying the group as a key player in the enzymes catalytic cycle. Penicillin

33、is an irreversible inhibitor of the enzyme glycoprotein peptidase,which catalyzes an essential step in bacterial cell wall synthesis. Penicillin consists of a thiazolidine ring fused to a -lactam ring to which a variable group R is attached. A reactive peptide bond in the -lactam ring covalently att

34、aches to a serine residue in the active site of the glycopeptide transpeptidase. (The conformation of penicillin around its reactive peptide bond resembles the transition state of the normal glycoprotein peptidase substrate.) The penicilloylenzyme complex is catalytically inactive. The bond between

35、the enzyme and penicillin is indefinitely stable; that is, penicillin binding is irreversible. 可 逆 抑 制 剂 磺 胺 类 药 物 ， 对 氨 基 苯 甲 酸 的 类 似 物 ； 一 些 抗 癌 药 物 ， 碱 基 类 似 物 ， 叶 酸 类 似 物 ，谷 氨 酰 胺 类 似 物 ； 过 渡 态 底 物 类 似 物 。 四 、 温 度 对 酶 反 应 的 影 响 化 学 反 应 速 率 一 般 都 受 温 度 影 响 ， 反 应 速 率随 温 度 的 升 高 而 加 快 ， 但 在 酶 促 反 应

36、 中 ， 随 着 温度 的 升 高 ， 酶 会 因 热 变 性 而 失 活 ， 从 而 使 反 应 速率 减 慢 ， 直 至 酶 完 全 失 活 。 因 此 在 较 低 的 温 度 范围 内 ， 酶 促 反 应 速 率 随 温 度 升 高 而 增 大 ， 超 过 一定 温 度 后 ， 反 应 速 率 反 而 下 降 ， 以 反 应 速 率 对 温度 作 图 可 得 到 一 条 钟 形 曲 线 ， 曲 线 的 顶 点 对 应 的温 度 称 为 酶 作 用 的 最 适 温 度 （ optimum temperature， Tm） ， 此 温 度 对 应 的 酶 促 反 应 速率 最 大 。 有 些

37、 耐 热 的 酶 有 很 好 的 应 用 价 值 。 The effect of temperature on enzyme activity. The relative activity of an enzymatic reaction as a function of temperature. The decrease in the activity above 50oC is due to thermal denaturation. 五 、 pH对 酶 反 应 的 影 响 pH对 酶 促 反 应 速 率 的 影 响 作 用 主 要 表 现 在 以 下 几 个方 面 ： （ 1） pH过

38、高 或 过 低 可 导 致 酶 高 级 结 构 的 改 变 ， 使酶 失 活 ， 又 称 为 酸 变 性 或 碱 变 性 ， 酶 活 性 部 位 具 有 柔 性 ，比 其 他 部 位 更 容 易 在 酸 、 碱 的 作 用 下 发 生 构 象 变 化 ， 导致 酶 活 力 的 下 降 ； （ 2） 酶 具 有 许 多 可 解 离 的 基 团 ， 在 不 同 的 pH环 境中 ， 这 些 基 团 的 解 离 状 态 不 同 ， 所 带 电 荷 不 同 ， 它 们 的解 离 状 态 对 酶 与 底 物 的 结 合 能 力 以 及 酶 的 催 化 能 力 都 有重 要 作 用 ， 因 此 溶 液 p

39、H的 改 变 可 通 过 影 响 这 些 基 团 的 解离 状 态 来 影 响 酶 活 性 ； （ 3） pH通 过 影 响 底 物 的 解 离 状 态 以 及 中 间 复 合 物ES的 解 离 状 态 影 响 酶 促 反 应 速 率 。 The pH activity profiles of four different enzymes. Trypsin, an intestinal protease, has a slightly alkaline pH optimum, whereas pepsin, a gastric protease, acts in the acidic conf

40、ines of the stomach and has a pH optimum near 2. Papain, a protease found in papaya, is relatively insensitive to pHs between 4 and 8. Cholinesterase activity is pH-sensitive below pH 7 but not between pH 7 and 10. The cholinesterase pH activity profile suggests that an ionizable group with a pK nea

41、r 6 is essential to its activity. Might it be a histidine residue within the active site? 六 、 激 活 剂 对 酶 反 应 的 影 响 一 些 无 机 离 子 和 有 机 小 分 子 可 提 高 酶 的 活 性 ， 称 作 激 活 剂 。 一 些 酶 制剂 需 加 入 激 活 剂 才 能 有 较 大 的 活 性 。 激 活 剂 按 照 分 子 大 小 ， 可 分 为 三 类 ：1.无 机 离 子 可 分 为 金 属 离 子 、 氢 离 子 和 阴 离 子 三 种 。 起 激 活 剂 作 用 的 金 属

42、离 子 有 钾 、 钠 、 钙 、 镁 、 锌 、 铁 等 ， 原 子 序 数 在1155之 间 。 其 中 镁 和 锌 是 多 种 激 酶 及 合 成 酶 的 激 活 剂 。 阴 离 子 的 激 活 作 用 一 般 不 明 显 ， 较 突 出 的 是 动 物 唾 液 中 的 淀 粉 酶 受 氯离 子 激 活 ， 溴 的 激 活 作 用 稍 弱 。 激 活 剂 的 作 用 有 选 择 性 ， 一 种 酶 的 激 活 剂 对 另 一 种 酶 可 能 起 抑 制 作 用 。 有 些 离 子 还 有 拮 抗 作 用 ， 如 钠 抑 制 钾 的 激 活 作 用 ， 钙 抑 制 镁 的 激 活 作 用

43、。 有 些 金 属 离 子 可 互 相 替 代 ， 如 激 酶 的 镁 离 子 可 用 锰 取 代 。 激 活 剂 的 浓 度 也 有 影 响 ， 浓 度 过 高 可 能 起 抑 制 作 用 。 如 对 于 NADP +合 成酶 ， 镁 离 子 浓 度 在 510 10-3mol/L时 起 激 活 作 用 ， 在 30 10-3mol/L时 酶 活下 降 。 2.中 等 大 小 有 机 分 子 某 些 还 原 剂 如 半 胱 氨 酸 、 还 原 型 谷 胱 甘 肽 、氰 化 物 等 能 激 活 某 些 酶 ， 打 开 分 子 中 的 二 硫 键 ，提 高 酶 活 ， 如 木 瓜 蛋 白 酶 、

44、 D-甘 油 醛 -3-磷 酸 脱氢 酶 等 。 另 一 种 是 EDTA， 可 螯 合 金 属 ， 解 除 重 金 属对 酶 的 抑 制 作 用 。3.蛋 白 质 类 指 可 对 某 些 无 活 性 的 酶 原 起 作 用 的 酶 。 基 本 要 求1.熟 悉 化 学 动 力 学 基 础 。2.掌 握 米 氏 方 程 及 相 关 计 算 ， 了 解 多 底 物反 应 的 动 力 学 特 点 。 (重 点 、 难 点 ）3.掌 握 酶 抑 制 作 用 的 有 关 概 念 、 动 力 学 特点 和 酶 抑 制 作 用 的 应 用 。 (重 点 、 难 点 ）4.掌 握 温 度 和 pH对 酶 反 应 的 影 响 机 制 。（ 重 点 ）5.熟 悉 激 活 剂 对 酶 反 应 的 影 响 。 作 业 题1.第 381页 第 1题 ；2.第 381页 第 2题 ；3.第 381页 第 3题 ；4.第 381页 第 4题 ；5.第 381页 第 5题 ；6.第 381页 第 6题 ；7.第 382页 第 7题 ；8.第 382页 第 8题 ；9.第 381页 第 9题 ；10.第 383页 第 12题 ；11.推 导 非 竞 争 性 抑 制 的 动力 学 方 程 。