食品有害微生物检测与控制.ppt

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1、Zhejiang Pharmaceutical CollegeZhejiang Pharmaceutical College 食 品 有 害 细 菌 检 测 与 控 制 (8)施 家 威反 应抗 原 抗 体 Zhejiang Pharmaceutical College Company Logo 1、 什 么 是 生 理 生 化 试 验 ？2、 常 见 的 生 理 生 化 试 验 出 现 的 现 象 有 哪 些 ？ 指 通 过 利 用 生 物 化 学 的 方 法 来 测 定 微 生 物的 代 谢 产 物 、 代 谢 方 式 和 条 件 等 来 鉴 别 细 菌 的类 别 、 属 种 的 试 验

2、。 Zhejiang Pharmaceutical College 1、 抗 原 抗 体 反 应 的 原 理2、 抗 原 抗 体 反 应 的 特 点3、 影 响 抗 原 抗 体 反 应 的 因 素4、 免 疫 学 检 测 技 术 的 类 型Ag(抗 原 ):Antigen;Ab (抗 体 ):Antibody Zhejiang Pharmaceutical College 一 、 抗 原 抗 体 反 应 的 原 理 抗 原 抗 体 反 应 ， 指 抗 原 与 相 应 抗 体 之 间所 发 生 的 特 异 性 结 合 反 应 。 主 要 是 指 抗 原 和 抗 体 在 体 外 结 合 所 表 现

3、的 反 应 。 由 于 抗 体 主 要 存 在 于 血 清 中 ， 所 以体 外 实 验 中 的 抗 原 抗 体 反 应 曾 称 作 血 清 学 反应 （ serological reaction)。 但 是 随 着免 疫 学 的 发 展 ， 血 清 学 的 含 义 已 不 能 概 括 目前 的 研 究 内 容 ， 现 在 多 以 抗 原 抗 体 反 应 代 替血 清 学 反 应 一 词 。 Zhejiang Pharmaceutical College 一 、 抗 原 抗 体 反 应 的 原 理静 电 引 力（ electrostatic forces）范 德 华 引 力 :作 用 最 小（

4、 van der Waals interactions）氢 键 :最 具 特 异 性（ hydrogen bond ）疏 水 作 用 力 :作 用 最 大 1、 抗 原 抗 体 结 合 力（ hydrophobic interactions） Zhejiang Pharmaceutical College 一 、 抗 原 抗 体 反 应 的 原 理1.1 静 电 引 力 抗 原 和 抗 体 分 子 带 有 相 反 电 荷 的 氨 基 和羧 基 基 团 之 间 相 互 的 引 力 ， 称 为 静 电 引 力 ，又 称 库 伦 引 力 。 抗 原 抗 体 结 合 力离 子 键 强 度 的 大 小

5、与 两 个 相 互 作 用 基 团 间 的 距 离 的平 方 成 反 比 。 Zhejiang Pharmaceutical College 一 、 抗 原 抗 体 反 应 的 原 理1.2范 德 华 引 力v概 念 ： 抗 原 和 抗 体 相 互 接 近 时 ， 各 自 所 携 带 的原 子 与 原 子 、 分 子 与 分 子 由 于 分 子 极 化 作 用 而出 现 的 引 力 。 抗 原 抗 体 结 合 力 作 用 大 小 取 决于 二 者 分 子 空 间构 型 的 互 补 性 结 合 力 的 大 小 与 两 个相 互 作 用 基 团 的 极 化 程度 的 乘 积 成 正 比 、 与 它

6、们 之 间 距 离 的 7次 方 成反 比 。 Zhejiang Pharmaceutical College 一 、 抗 原 抗 体 反 应 的 原 理1.3氢 键 结 合 力 供 氢 体 上 的 氢 原 子 与 受 氢 体 原 子 间 的 引 力 。 羧 基 、 氨 基 和 羟 基 是 主 要 供 氢 体 ， 而 羧 基 氧 、羧 基 碳 和 肽 键 氧 等 原 子 是 主 要 受 氢 体 。 抗 原 抗 体 结 合 力 氢 键 结 合 力 与 供 氢 体 和 受 氢 体 之 间 距 离 的 6次 方 成 反 比 。 最 具 特 异 性 （ 必 须 供 氢 体 和 受 氢 体 互 补 才

7、能 实 现 氢 键 的 结 合 ） Zhejiang Pharmaceutical College 一 、 抗 原 抗 体 反 应 的 原 理1.4 疏 水 作 用 力 两 个 疏 水 基 团 在 水 溶 液 中 相 互 接 触 时 ， 由 于对 水 分 子 排 斥 而 趋 向 聚 集 的 力 。 抗 原 抗 体 结 合 力 结 合 力 最 强 ， 约 占总 结 合 力 的 50 。 Zhejiang Pharmaceutical College 一 、 抗 原 抗 体 反 应 的 原 理范 德 华 力静 电 引 力 抗 原疏 水 作 用 力 排 斥 水抗 体氢 键 结 合 力 HH- - +

8、 + 抗 原 抗 体 结 合 力- - + + Zhejiang Pharmaceutical College 一 、 抗 原 抗 体 反 应 的 原 理2.1亲 和 力 (affinity) 抗 体 分 子 上 一 个 抗 原 结 合 点 与 对 应 的 抗 原 决 定 簇 之 间相 适 应 而 存 在 着 的 引 力 ， 是 抗 原 抗 体 间 固 有 的 结 合 力抗 原 抗 体 的 亲 和 力 和 亲 合 力2、 抗 原 抗 体 的 亲 和 力 和 亲 合 力 Zhejiang Pharmaceutical College Company Logo12 亲 和 常 数 （ K） ：K值

9、 越 大 抗 体 的 亲 和 力 越 高 与 抗 原 结 合 越 牢 固抗 体 与 抗 原 结 合 是 可 逆 的 反 应 ， 在 平 衡 时 其 Zhejiang Pharmaceutical College 一 、 抗 原 抗 体 反 应 的 原 理2.2亲 合 力 (avidity) 抗 原 抗 体 的 亲 和 力 和 亲 合 力亲 合 力 （ avidity） ： 是 指 一 个 抗 体 分 子 与整 个 抗 原 表 位 之 间 结 合 的 强 度 ， 与 抗 体 结 合 价直 接 相 关 。 另 外 也 与 亲 和 力 强 弱 有 关 。 Zhejiang Pharmaceutica

10、l College 一 、 抗 原 抗 体 反 应 的 原 理3、 亲 水 胶 体 转 化 为 疏 水 胶 体 抗 体 和 大 多 数 抗 原 同 属 蛋 白 质 。 在 通 常 的 血 清学 反 应 条 件 下 均 带 有 负 电 荷 ， 使 极 化 的 水 分 子 在其 周 围 形 成 水 化 层 ， 成 为 亲 水 胶 体 ， 因 此 蛋 白 质不 会 自 行 凝 集 出 现 沉 淀 。 当 Ag与 Ab结 合 后 ， 表面 电 荷 减 少 ， 水 化 层 变 薄 ； 而 且 由 于 Ag-Ab复合 物 形 成 后 ， 与 水 接 触 的 表 面 积 减 少 ， 由 亲 水 胶体 转 化

11、 为 疏 水 胶 体 。 此 时 在 电 解 质 (如 NaCl)的作 用 下 ， 使 各 疏 水 胶 体 之 间 进 一 步 靠 拢 、 沉 淀 ，形 成 可 见 的 Ag-Ab复 合 物 。 Zhejiang Pharmaceutical College 一 、 抗 原 抗 体 反 应 的 原 理 亲 水 胶 体 转 化 为 疏 水 胶 体可 见 反 应抗 原 抗 体 复 合 物 (疏 水 胶 体 ) 电 解 质 抗 原(亲 水 胶 体 ) 抗 体(亲 水 胶 体 ) + Zhejiang Pharmaceutical College 二 、 抗 原 抗 体 反 应 的 特 点特 异 性

12、可 逆 性比 例 性 阶 段 性 Zhejiang Pharmaceutical College 二 、 抗 原 抗 体 反 应 的 特 点1、 特 异 性特 异 性 ： 抗 原 与 抗 体结 合 反 应 的 专 一 性分 子 基 础 :抗 原 表 位 与 抗体 分 子 高 变 区 之 间 空 间构 型 的 互 补 性 抗 原 抗 体 反 应 特 异 性 示 意 图 由 于 抗 原 抗 体 反 应 具 有高 度 特 异 性 ， 故 可 用 已 知的 抗 原 （ 抗 体 ） 来 检 测 相应 未 知 的 抗 体 （ 或 抗 原 ） 。 Zhejiang Pharmaceutical Colleg

13、e 二 、 抗 原 抗 体 反 应 的 特 点交 叉 反 应 （ cross reactions）两 种 不 同 的 抗 原 分 子 具 有 部 分 相 同 或 类 似 结构 的 抗 原 表 位 ， 可 与 彼 此 相 应 的 发 生 反 应 特 异 性 Zhejiang Pharmaceutical College 二 、 抗 原 抗 体 反 应 的 特 点2、 可 逆 性可 逆 性 ： 抗 原 与 相 应 抗 体 结 合 成 复 合 物 后 ， 在一 定 条 件 下 又 可 解 离 为 游 离 抗 原 与 抗 体 的 特 性 影 响 因 素 : 抗 体 对 相 应 抗 原 的 亲 合 力

14、（ 亲 合 力 越 高 ，结 合 越 牢 固 ， 越 不 易 解 离 ） 环 境 因 素 对 复 合 物 的 影 响 pH、 离 子 强 度 Zhejiang Pharmaceutical College 二 、 抗 原 抗 体 反 应 的 特 点3、 比 列 性 Ag与 Ab的 结 合 常 需 适 当 比 例 才 出 现 可 见反 应 ， 在 最 适 比 例 时 反 应 最 明 显 ； 这 种 现 象可 以 用 “ 格 子 学说 ” 来 解 释 ：Ab(IgG)为 二 价 ，Ag通 常 为 多 价 ，只 有 Ag， Ab结 合形 成 大 的 复 合 物 ，肉 眼 才 可 见 。 Zhejia

15、ng Pharmaceutical College 二 、 抗 原 抗 体 反 应 的 特 点 只 有 当 Ag与 Ab比 例 适 当 时 ， 才 能 形 成大 的 复 合 物 ， 比 例 不 适 当 ， 就 只 能 形 成 小 的 复合 物 而 抑 制 反 应 现 象 的 出 现 ， 此 所 谓 带 现 象 ；前 带 现 象 ： Ab过 剩 ， Ag过 少 ； 稀 释 Ab， 凝 集 反 应 常 见 ；后 带 现 象 ： Ag过 剩 ， Ab过 少 ； 稀 释 Ag、 沉 淀 反 应 常 见 。 比 例 性 Zhejiang Pharmaceutical College 二 、 抗 原 抗

16、体 反 应 的 特 点 比 例 性沉淀的抗体量 抗 原 量抗 原 抗 体 反 应 与 沉 淀 形 成 Zhejiang Pharmaceutical College 二 、 抗 原 抗 体 反 应 的 特 点4、 阶 段 性第 一 阶 段 ： 特 异 性 结 合 阶 段 ， 反 应 快 ， 不 可 见 第 二 阶 段 ： 反 应 可 见 阶 段 ， 反 应 慢 ， 出 现 凝 集 、 沉 淀 和 细 胞 溶 解 等 现 象 Zhejiang Pharmaceutical College 三 、 影 响 抗 原 抗 体 反 应 的 因 素抗 原 、 抗 体 反 应 物 的 自 身 因 素环 境

17、因 素 Zhejiang Pharmaceutical College 三 、 影 响 抗 原 抗 体 反 应 的 因 素1、 反 应 物 自 身 因 素抗 原 :理 化 性 状 、 表 位 种 类 和 数 目抗 体 :来 源 、 特 异 性 、 亲 和 性 、 效 价 Zhejiang Pharmaceutical College 三 、 影 响 抗 原 抗 体 反 应 的 因 素1、 反 应 物 自 身 因 素1.1 抗 原 抗 原 的 理 化 性 状 、 抗 原 决 定 簇 的 数 目 和 种 类均 可 影 响 血 清 学 反 应 结 果 例 如 ， 可 溶 性 抗 原 与 相 应 抗

18、体 反 应 出 现 沉 淀 ，而 颗 粒 性 抗 原 与 相 应 抗 体 反 应 则 出 现 凝 集 ； 单价 抗 原 与 抗 体 结 合 不 出 现 可 见 反 应 ； 粗 糙 型 细菌 在 生 理 盐 水 中 易 出 现 自 凝 ； 红 细 胞 与 IgG类 抗体 结 合 不 出 现 直 接 凝 集 等 。 Zhejiang Pharmaceutical College 三 、 影 响 抗 原 抗 体 反 应 的 因 素 反 应 物 自 身 因 素1.2 抗 体 抗 体 对 反 应 的 影 响 表 现 在 以 下 三 个 方 面 :(1)来 源 : 来 自 不 同 动 物 的 免 疫 血

19、清 ， 其 反 应 性 有差 异 。 家 兔 等 大 多 数 动 物 的 免 疫 血 清 具 有 较 宽 的 等价 带 ， 通 常 在 抗 原 过 量 时 才 易 出 现 可 溶 性 免 疫 复 合物 ； 马 等 大 动 物 和 人 的 免 疫 血 清 等 价 带 较 窄 ， 少 量的 抗 原 或 抗 体 过 剩 ， 均 可 形 成 可 溶 性 免 疫 复 合 物 ；家 禽 免 疫 血 清 不 能 结 合 哺 乳 动 物 的 补 体 ， 并 且 在 高盐 浓 度 （ 8.5% NaCl） 溶 液 中 沉 淀 现 象 明 显 。 单 克隆 抗 体 一 般 不 适 用 于 沉 淀 反 应 或 凝

20、集 反 应 。 Zhejiang Pharmaceutical College 三 、 影 响 抗 原 抗 体 反 应 的 因 素 反 应 物 自 身 因 素(2)特 异 性 与 亲 和 力 特 异 性 和 亲 和 力 是 影 响 血 清 学 反 应 的 两 个 关键 因 素 ， 它 们 共 同 影 响 试 验 结 果 的 准 确 程 度 。 免 疫 动 物 早 期 获 得 的 抗 血 清 特 异 性 较 好 ， 但亲 和 力 低 ； 后 期 获 得 的 抗 血 清 一 般 亲 和 力 较 高 ， 但长 期 免 疫 易 使 免 疫 血 清 中 抗 体 的 类 型 和 反 应 性 变 得更 为

21、复 杂 。 因 此 ， 用 于 检 验 的 试 剂 必 须 尽 量 选 用 特 异 性 高 、亲 和 力 强 的 抗 体 ， 才 能 保 证 和 提 高 试 验 结 果 的 可 靠性 。 Zhejiang Pharmaceutical College 三 、 影 响 抗 原 抗 体 反 应 的 因 素 反 应 物 自 身 因 素（ 3） 浓 度 : 抗 体 的 浓 度 往 往 是 与 抗 原 相 对 而 言 。 合 适 的浓 度 才 出 现 明 显 的 反 应 现 象 。 因 此 许 多 试 验 应 进 行抗 体 预 滴 定 ， 找 出 最 适 反 应 浓 度 Zhejiang Pharmac

22、eutical College 三 、 影 响 抗 原 抗 体 反 应 的 因 素2、 环 境 因 素2.1 电 解 质 抗 原 抗 体 结 合 后 由 亲 水 性 变 为 疏 水 性 ， 此时 易 受 电 解 质 影 响 ， 如 有 适 当 浓 度 电 解 质 存 在 ，就 会 使 抗 原 抗 体 失 去 一 部 分 电 荷 而 相 互 凝 集 或 沉淀 ， 出 现 可 见 反 应 ;若 无 电 解 质 存 在 ， 则 不 出 现 可见 反 应 。 通 常 在 血 清 学 试 验 中 ， 以 0.85% NaCl溶液 作 为 抗 原 抗 体 的 稀 释 液 及 反 应 液 ， 其 中 Na+

23、和Cl-可 分 别 中 和 胶 体 颗 粒 上 的 电 荷 ， 使 胶 体 颗 粒 的电 势 下 降 ， 形 成 可 见 的 沉 淀 物 或 凝 集 物 。电 解 质 浓 度 过 高 ， 则 会 出 现 非 特 异 性 蛋 白 质 沉 淀 ，即 盐 析 。 Zhejiang Pharmaceutical College 三 、 影 响 抗 原 抗 体 反 应 的 因 素 Zhejiang Pharmaceutical College 三 、 影 响 抗 原 抗 体 反 应 的 因 素2.2 酸 碱 度 合 适 的 pH是 抗 原 抗体 反 应 的 必 要 条 件 之 一 。血 清 学 试 验

24、一 般 以 pH6-9为 宜 ， 超 出 此 范 围 可 影 响抗 原 和 抗 体 的 理 化 性 质 ，导 致 假 阳 性 或 假 阴 性 结 果 。当 pH为 3左 右 时 ， 接 近 细菌 抗 原 的 等 电 点 ， 可 出 现非 特 异 性 酸 凝 集 ， 造 成 假象 。 Zhejiang Pharmaceutical College 三 、 影 响 抗 原 抗 体 反 应 的 因 素2.3 温 度 抗 原 抗 体 反 应 一 般 在 15-40 范 围 内 均 可 进 行 ，最 适 温 度 为 37 。 在 此 范 围 内 温 度 越 高 ， 分 子 运 动速 度 加 快 ， 增

25、加 抗 原 抗 体 接 触 机 会 ， 反 应 速 度 越 快 ，但 亦 容 易 引 起 复 合 物 解 离 ;温 度 越 低 ， 反 应 速 度 缓 慢 ，但 抗 原 抗 体 结 合 牢 固 ， 易 于 观 察 。 某 些 特 殊 的 抗 原抗 体 反 应 需 要 特 定 的 温 度 ， 如 冷 凝 集 素 在 4 时 与 红细 胞 结 合 ， 20 以 上 反 而 解 离 。 Zhejiang Pharmaceutical College 三 、 影 响 抗 原 抗 体 反 应 的 因 素 Zhejiang Pharmaceutical College 三 、 影 响 抗 原 抗 体 反

26、应 的 因 素2.4 作 用 时 间抗 原 抗 体 反 应 应 有 足 够 的 时 间 ， 不 同 反 应 时 间 不 同 。 Zhejiang Pharmaceutical College 三 、 影 响 抗 原 抗 体 反 应 的 因 素 此 外 ， 抗 原 抗 体 反 应 在 液 相 中 反 应 时 ， 适 当振 荡 与 搅 拌 ， 也 可 促 进 抗 原 抗 体 分 子 的 接 触 ， 加 速反 应 。 电 解 质 : 生 理 盐 水 或 缓 冲 液酸 碱 度 : pH 6 pH 9温 度 : 15 40 ， 37 最 适 Zhejiang Pharmaceutical College

27、 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型 反 应 类 型 实 验 技 术 结 果 判 断凝 集 反 应 直 接 凝 集 试 验 观 察 凝 集 现 象间 接 凝 集 试 验 同 上抗 球 蛋 白 试 验 同 上沉 淀 反 应 液 相 沉 淀 试 验 观 察 沉 淀 ， 检 测 浊 度免 疫 电 泳 技 术 观 察 扫 描 沉 淀 峰 、 沉淀 弧补 体 参 与的 反 应 补 体 溶 血 试 验 观 察 测 定 溶 血 现 象补 体 结 合 试 验 同 上 Zhejiang Pharmaceutical College 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ）

28、检 测 技 术 的 类 型 反 应 类 型 实 验 技 术 结 果 判 断中 和 反 应 病 毒 中 和 试 验 检 测 病 毒 感 染 性毒 素 中 和 试 验 检 测 外 毒 素 毒 性标 记 免 疫 反应 荧 光 免 疫 技 术 检 测 荧 光 现 象放 射 免 疫 技 术 检 测 放 射 性 强 度酶 免 疫 技 术 检 测 酶 底 物 显 色发 光 免 疫 技 术 检 测 发 光 强 度金 免 疫 技 术 检 测 金 颗 粒 沉 淀 Zhejiang Pharmaceutical College 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型 1.1环 状 沉

29、 淀 反 应1、 常 见 的 免 疫 学 检 测 技 术n原 理 ： 将 可 溶 性 抗 原 层 积 于 抗 体 之上 ， 如 果 二 者 相 应 ， 则 可 在 抗 原 、 抗体 两 液 接 触 界 面 形 成 白 色 的 沉 淀 环 。试 验 组 阳 性 对 照 组 阴 性 对 照 组 Zhejiang Pharmaceutical College 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型 1.2双 向 琼 脂 扩 散 试 验n 原 理 ： 可 溶 性 Ag与 Ab在 含 有 电 解 质 的 半 固 体 （ 1%）琼 脂 内 进 行 自 由 扩 散 ， 当 两

30、 者 由 高 浓 度 向 低 浓 度扩 散 相 遇 时 ， 如 果 二 者 相 对 应 而 且 比 例 适 当 ， 则可 在 相 遇 处 形 成 白 色 的 沉 淀 线 ， 为 阳 性 反 应 。 另外 ， 沉 淀 带 对 于 组 成 它 的 Ag、 Ab具 有 特 异 地 不可 透 过 性 ， 而 对 其 它 的 Ag与 Ab是 可 透 过 的 ， 所以 一 条 沉 淀 带 仅 代 表 一 种 AgAb系 统 的 沉 淀 物 。 Zhejiang Pharmaceutical College 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型 Zhejiang Pharm

31、aceutical College 2、 食 源 性 微 生 物 检 测 中 的 应 用 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 ELISA( enzyme-linked immunosorbent assay) 是 在 酶联 免 疫 技 术 的 基 础 上 发 展 起 来 的 免 疫 测 定 技 术 。 它 的 基 本 原 理 是 将 抗 原 或 抗 体 吸 附 在 固 相 载体 表 面 ， 通 过 加 入 酶 标 抗 体 或 抗 原 ， 进 行 抗 原抗 体 反 应 ， 形 成 酶 标 免 疫 复 合 物 ， 洗 涤 后 ， 游离 的 酶 标 抗 体 或 抗 原 被 洗 掉 ， 再 加 入 酶 底

32、 物 与免 疫 复 合 物 结 合 显 色 ， 进 而 进 行 定 性 或 定 量 测定 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型2.1 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 技 术 Zhejiang Pharmaceutical College 阪 崎 肠 杆 菌 ( ES) 是 一 种 对 新 生 儿 和 免 疫 力低 下 人 群 的 高 危 致 病 微 生 物 ， 周 鹤 峰 等 通 过 制备 ES 高 特 异 性 单 克 隆 抗 体 对 其 进 行 特 异 性 间接 ELISA 检 测 ， 大 幅 降 低 检 测 成 本 ， 具 有 灵敏 度 高 、 稳 定 性

33、 强 、 特 异 性 强 、 便 捷 等 特 点 ，为 食 品 中 ES 的 快 速 检 测 奠 定 了 研 究 基 础 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型周 鹤 峰 ,邵 敏 ,李 长 福 ,葛 正 龙 . 检 测 阪 崎 肠 杆 菌 间 接ELISA方 法 的 建 立 J. 中 国 乳 品 工 业 ,2013,41(01):51-54. Zhejiang Pharmaceutical College 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型2.1免 疫 层 析 技 术免 疫 层 析 技 术IC( immunochromato

34、graphy) 始 于M.Beggs 等 设计 的 人 绒 毛 促性 腺 激 素 免 疫胶 体 金 层 析 系统 Zhejiang Pharmaceutical College 2.2.1 荧 光 微 球 免 疫 层 析 技 术 荧 光 微 球 免 疫 层 析 技 术 的 原 理 是 利 用 荧 光微 球 表 面 修 饰 的 羧 基 可 共 价 结 合 抗 体 发 出 的 荧光 信 号 强 而 稳 定 的 特 点 发 展 起 来 的 新 型 检 测 技术 ， 具 有 易 于 定 量 检 测 的 特 点 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型 Zhejiang P

35、harmaceutical College 解 泉 源 等 通 过 以 下 方 法 制 备 大 肠 杆 菌 O157 H7荧光 微 球 免 疫 层 析 试 纸 条 进 行 食 源 性 微 生 物 检 测 先 将荧 光 微 球 羧 基 化 ， 用 EDC 介 导 共 价 偶 联 鼠 源 抗 大 肠 杆菌 O157 H7 单 克 隆 抗 体 ， 将 喷 涂 在 硝 酸 纤 维 素 膜上 的 兔 多 抗 和 驴 抗 鼠 抗 体 分 别 作 为 检 测 线 ( T 线 ) 和 质控 线 ( C 线 ) ， 进 而 确 定 免 疫 层 析 反 应 动 态 平 衡 时 间 ，再 利 用 双 抗 体 夹 心

36、 显 色 ， 测 定 吸 光 度 ， 进 而 达 到 定 量 检测 的 目 的 应 用 荧 光 微 球 免 疫 层 析 技 术 制 备 的 试 纸 条能 同 时 检 测 4 株 目 标 菌 与 34 株 不 同 种 类 的 食 源 性 微生 物 ， 目 标 菌 仅 与 金 黄 色 葡 萄 球 菌 有 微 弱 交 叉 反 应 ， 特异 性 较 好 ， 并 且 具 有 操 作 简 便 、 速 度 快 的 特 点 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型 解 泉 源 ,赖 卫 华 ,刘 春 梅 ,等 . 大 肠 杆 菌 O157:H7荧 光 微 球 免 疫 层 析 试

37、纸 条 的研 制 J. 食 品 科 学 ,2013,34(16):353-357. Zhejiang Pharmaceutical College 2.2.2胶 体 金 免 疫 层 析 技 术 免 疫 胶 体 金 技 术 GICA( immune colloidal gold technique) 是 以 胶 体 金 作为 示 踪 标 记 物 应 用 于 免 疫 反 应 的 新 型 免 疫 标 记技 术 ， 可 用 于 检 测 食 品 中 常 见 的 致 病 菌 ( 大 肠 杆菌 、 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、 沙 门 氏 菌 、 布 氏 杆 菌 、霍 乱 弧 菌 等 ) 。 四 、 抗

38、体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型 Zhejiang Pharmaceutical College 王 玉 金 等 通 过 3 步 建 立 大 肠 杆 菌 O157 H7的 胶 体 金 免 疫 层 析 快 速 筛 查 方 法 。目 标 菌 与 9 种 常 见 食 源 性 微 生 物 ( 非 O157 H7 大 肠 杆 菌 、 伤 寒 杆 菌 、 痢 疾 杆 菌 、变 形 杆 菌 、 霍 乱 杆 菌 、 副 溶 血 性 弧 菌 、 肠 球 菌 、黏 质 沙 雷 氏 菌 、 肺 炎 克 雷 伯 杆 菌 ) 同 时 检 测 无 交叉 反 应 ， 特 异 性 强 四 、 抗 体

39、 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型王 玉 金 ,杨 书 豪 ,刘 丽 ,等 . 大 肠 杆 菌 O157 H7胶 体 金 免 疫层 析 快 速 检 测 法 的 建 立 J. 河 南 科 学 ,2012,30(07):874-877. Zhejiang Pharmaceutical College 2.2.3 纳 米 金 技 术 自 从 16 世 纪 欧 洲 现 代 化 学 的 奠 基 人 、 杰 出的 医 师 化 学 家 Paracelsus 制 备 出 “饮 用 金 ”用来 治 疗 精 神 类 疾 病 以 来 ， 纳 米 金 ( nanogold) 就 开 始 受 到

40、重 视 纳 米 金 指 金 的 微 小 颗 粒 ， 直径 1 100 nm， 具 有 高 电 子 密 度 、 介 电 特性 和 催 化 作 用 ， 能 与 多 种 生 物 大 分 子 结 合 ， 且不 影 响 其 生 物 活 性 由 于 易 于 制 备 和 修 饰 ， 因此 被 广 泛 使 用 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型 Zhejiang Pharmaceutical College 金 黄 色 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 B( SEB) 是 一 种 常见 的 影 响 食 品 特 别 是 乳 品 质 量 安 全 的 高 风 险 食源 性 微 生 物

41、毒 素 ， 孙 秀 兰 等 采 用 离 子 液 体 保 护的 聚 苯 胺 纳 米 金 复 合 膜 传 感 器 对 其 进 行 检 测 。离 子 液 体 保 护 的 聚 苯 胺 纳 米 金 复 合 膜 比 传 统 纳米 金 离 子 能 更 有 效 地 阻 止 金 的 聚 合 ， 且 具 有 更高 的 分 散 性 ， 聚 苯 胺 导 电 膜 可 提 高 材 料 传 导 性以 降 低 检 出 限 ， 复 合 膜 保 护 剂 进 一 步 稳 定 抗 体 ，进 而 提 高 检 测 结 果 的 稳 定 性 修 饰 的 复 合 膜 传感 器 克 服 了 ELISA 易 出 现 假 阳 性 的 缺 陷 ， 乳

42、品 检 测 回 收 率 在 88% 119% 之 间 。 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型 朱 珠 ,王 永 ,兰 青 阔 ,等 . 应 用 焦 磷 酸 测 序 技 术 快 速 检 测 食 品中 沙 门 氏 菌 J. 食 品 科 学 ,2013,34(02):182-186. Zhejiang Pharmaceutical College 2.3免 疫 磁 珠 分 离 技 术 免 疫 磁 珠 分 离 法 是 将 磁 性 微 球 与 免 疫 化 学 技术 结 合 起 来 的 一 种 方 法 该 方 法 先 用 抗 体 包 被的 磁 珠 与 样 品 混 合 ，

43、 再 用 一 个 磁 场 装 置 收 集 磁珠 免 疫 磁 珠 分 离 法 能 快 速 地 从 食 品 成 分 中 分离 出 靶 细 菌 ， 克 服 选 择 性 培 养 基 的 抑 制 作 用 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型 Zhejiang Pharmaceutical College 2.4酶 联 荧 光 免 疫 分 析 技 术 ELFIA( enzyme-linked fluorescent immunoassay) 是 在 酶 联 免疫 吸 附 技 术 基 础 上 发 展 起 来 的 将 酶 系 统 与 荧 光免 疫 分 析 结 合 的 微 生

44、物 快 速 检 测 技 术 。 它 是 利用 理 想 的 荧 光 底 物 代 替 生 色 底 物 ， 实 现 提 高 分析 灵 敏 度 ， 扩 大 测 量 范 围 以 及 减 少 试 剂 用 量 的目 的 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型 Zhejiang Pharmaceutical College 2.4化 学 发 光 免 疫 分 析 技 术化 学 发 光 免 疫 分 析 CLIA ( chemiluminescence immunoassay technique) 是 将 具 有 高 灵 敏 度 的 化 学 发 光 测定 技 术 与 高 特 异 性

45、的 免 疫 反 应 结 合 的 新 型 免 疫测 定 技 术 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型 Zhejiang Pharmaceutical College 小 结 抗 原 抗 体 反 应 是 指 抗 原 与 相 应 抗 体 之 间 所 发生 的 特 异 性 结 合 反 应 。 抗 原 抗 体 之 间 的 结 合 力 涉 及 静 电 引 力 、 范 德华 引 力 、 氢 键 和 疏 水 作 用 力 。 抗 原 抗 体 反 应 的 特 点 是 特 异 性 、 可 逆 性 、 比例 性 和 阶 段 性 。 影 响 抗 原 抗 体 反 应 的 因 素 包 括

46、反 应 物 的 自 身因 素 和 环 境 因 素 。 免 疫 学 检 测 技 术 的 基 础 是 抗 原 抗 体 反 应 四 、 抗 体 抗 原 （ 免 疫 学 ） 检 测 技 术 的 类 型 Zhejiang Pharmaceutical College 作 业v介 绍 基 于 以 下 任 一 一 种 技 术 的 视 频 有 害 微生 物 检 测 方 法 ， 并 进 行 介 绍 。v免 疫 磁 珠 分 离 技 术v酶 联 荧 光 免 疫 分 析 技 术v化 学 发 光 免 疫 分 析 技 术v要 求 ： 书 面 介 绍 不 少 于 500字 ；v PPT介 绍 不 少 于 5min;v 下 节 课 随 机 上 台 介 绍 。 Company Logo Zhejiang Pharmaceutical CollegeZhejiang Pharmaceutical College