细菌的分离、接种和培养

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1、实 验 五 细 菌 的 分 离 、 接 种和 培 养 目 的 要 求 实 验 原 理 实 验 材 料 实 验 步 骤 操 作 规 范 示 例 作 业 一 、 目 的 要 求 掌 握 从 环 境 （ 土 壤 、 水 体 、 活 性 污 泥 等 ） 中 分 离 和 纯 化微 生 物 的 方 法 和 原 理 ； 倒 平 板 ； 细 菌 纯 种 分 离 ： 稀 释 混 合 平 板 分 离 法 、 稀 释 涂 布 平 板分 离 法 和 平 板 划 线 法 ； 接 种 技 术 ； 无 菌 操 作 技 术 ； 在 自 然 界 中 ， 不 同 种 类 的 微 生 物 绝 大 多 数 都 是 混 杂 生 活 在

2、 一起 的 ， 为 了 生 产 和 科 学 研 究 的 需 要 ， 当 我 们 希 望 获 得 某 一 种 微 生物 时 ， 就 必 须 从 混 杂 的 微 生 物 类 群 中 分 离 出 它 ， 以 得 到 只 含 有 这一 种 微 生 物 的 纯 培 养 物 ， 这 种 获 得 纯 培 养 物 的 方 法 称 为 微 生 物 的分 离 与 纯 化 。 为 了 获 得 纯 种 的 微 生 物 ， 一 般 根 据 该 微 生 物 营 养 或 培 养 特 点(微 生 物 对 营 养 、 酸 碱 度 、 氧 等 条 件 )， 或 对 某 种 抑 制 剂 的 耐 受 性 不同 ， 或 对 某 种 环

3、 境 条 件 要 求 不 同 ， 从 而 制 作 或 设 置 一 些 选 择 性 培养 基 ， 或 选 择 性 培 养 条 件 ， 再 用 稀 释 涂 布 平 板 法 或 稀 释 混 合 平 板法 或 划 线 法 分 离 ， 纯 化 该 微 生 物 ， 直 至 得 到 该 纯 种 菌 株 。二 、 实 验 原 理 三 、 实 验 试 剂 与 器 材 土 壤 样 品 （ 环 境 样 品 ） 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 ； 无 菌 试 管 、 无 菌 三 角 瓶 、 无 菌 玻璃 涂 棒 、 无 菌 吸 管 、 接 种 环 、 无菌 培 养 皿 ； 超 净 工 作 台 （ 一 ） 稀 释

4、混 合 平 板 法四 、 实 验 步 骤 1. 土 壤 稀 释 液 的 制 备 称 取 土 样 10g， 放 入 盛 90ml无 菌 水 三 角 瓶 中 ， 振 荡 15 20分 钟 ， 使 微 生 物 细 胞 分 散 ， 静 置 约 20 30秒 ， 即 成 10-1的 土 壤悬 液 。 另 取 装 有 9ml无 菌 水 的 试 管 ， 编 号 为 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、10-6， 用 无 菌 吸 管 吸 取 10-1土 壤 悬 液 l ml， 加 入 编 号 10-2的 无 菌试 管 中 ， 吹 吸 三 次 ， 使 之 混 合 均 匀 ， 即 成 10-2的 土 壤

5、 稀 释 液 。再 用 另 一 支 吸 管 吸 取 10-2试 管 中 的 土 壤 稀 释 液 1ml， 加 入 编 号10-3的 无 菌 试 管 中 ， 轻 轻 摇 动 ， 使 之 混 合 均 匀 ， 即 成 10-3的 土壤 稀 释 液 ， 一 定 要 每 次 更 换 一 支 无 菌 吸 管 （ 连 续 稀 释 ） 。 同法 依 次 分 别 稀 释 成 10 -4、 10-5和 10-6等 一 系 列 稀 释 度 菌 悬 液 。 2. 平 板 制 作 将 无 菌 培 养 皿 编 上 10-3、 10-4、 10-5号 码 ， 每 一 号 码 设三 个 重 复 ， 用 1ml无 菌 吸 管

6、按 无 菌 操 作 要 求 吸 10-5稀 释 液各 1ml， 分 别 放 入 编 号 10-5的 三 个 培 养 皿 中 。 同 法 吸 取 10-5稀 释 液 各 1ml， 分 别 放 入 编 号 10-4的 三 个 培 养 皿 中 。 再 吸取 10-3稀 释 液 各 1ml， 分 别 放 入 编 号 10-3的 三 个 培 w1养 皿 中 。然 后 在 9个 培 养 皿 中 分 别 倒 入 15ml已 融 化 并 且 冷 却 至 45左 右 的 牛 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 培 养 基 ， 加 盖 后 轻 轻 摇 动 培 养皿 ， 使 培 养 基 均 匀 分 布 ， 平 置 于 桌

7、面 上 ， 待 凝 固 后 即 成平 板 ， 整 个 操 作 过 程 应 严 格 按 照 无 菌 操 作 。 3. 培 养 与 移 植 待 平 板 完 全 冷 凝 后 ， 将 平 板 倒 置 37 恒 温 箱 中 培 养24 48小 时 ， 检 查 分 离 结 果 。 将 培 养 后 长 出 的 单 个 菌 落分 别 挑 取 接 种 到 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 的 斜 面 上 ， 然 后 置于 37 恒 温 箱 中 培 养 ， 待 菌 苔 长 出 后 ， 检 查 菌 苔 是 否 单纯 ， 也 可 用 显 微 镜 涂 片 染 色 检 查 是 否 是 单 一 的 微 生 物 ，若 有

8、其 它 杂 菌 混 杂 ， 就 可 再 一 次 进 行 分 离 、 纯 化 ， 直 至获 得 纯 培 养 。 （ 二 ） 稀 释 涂 布 平 板 法 此 法 与 稀 释 混 合 平 板 法 基 本 相 同 ， 无 菌 操 作 也 一 样 ，所 不 同 的 是 先 将 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 融 化 ， 在 火 焰 旁 注 入培 养 皿 ， 摇 匀 后 制 成 平 板 ， 然 后 用 三 支 1ml无 菌 吸 管 分 别由 10-4、 10-5、 10-6三 管 土 壤 稀 释 液 中 各 吸 取 0.2ml对 号 放 入已 写 好 稀 释 度 的 平 板 中 ， 用 无 菌 玻 璃

9、 涂 棒 在 培 养 基 表 面 轻轻 地 涂 布 均 匀 ， 然 后 分 别 倒 置 于 37 温 箱 中 培 养 后 ， 再 挑取 单 个 菌 落 ， 直 至 获 得 纯 培 养 。 （ 三 ） 平 板 划 线 分 离 法 制 备 土 壤 稀 释 液 倾 注 平 板 培 养 挑 菌 落 接 种 和 分 离 工 具1 接 种 针 2.接 种 环 3.接 种 钩 4.5.玻 璃 涂 棒 6.接 种 圈 7.接种 锄 8.小 解 剖 刀 移 接 斜 面常 用 的 接 种 方 法划 线 接 种点 接 种穿 刺 接 种涂 布 接 种液 体 接 种注 射 接 种 斜 面 接 种 时 的 无 菌 操 作

10、(1)接 种 灭 菌 (2)开 启 棉 塞 (3)管 口 灭 菌 (4)挑 起 菌 苔 (5)接 种 (6)塞 好 棉 塞 纯 化 （ 平 板 划 线 法 ）倒 平 板 划 线 培 养 挑 菌 落 纯 种 （ 纯 培 养 ） 平 板 划 线 分 离 的 方 法1.斜 线 法 2.曲 线 法 3.方 格 法 4.放 射 法 5.四 格 法 五 、 微 生 物 实 验 技 术 操 作 规 范 示 例（ 一 ） 斜 面 接 种 无 菌 操 作 技 术（ 二 ） 倒 平 板 及 平 板 划 线 接 种 （ 一 ） 斜 面 接 种 无 菌 操 作 技 术 (二 ） 倒 平 板 及 平 板 划 线 接 种 （ 三 ） 平 板 划 线 接 种 ： 六 、 作 业1. 简 述 无 菌 操 作 过 程 中 的 注 意 点 。2. 拟 出 从 土 壤 中 分 离 细 菌 的 主 要 实 验 步 骤 。3. 如 何 检 验 平 板 上 某 个 单 菌 落 是 不 是 纯 培 养 ？4. 培 养 时 为 什 么 要 将 培 养 皿 倒 置 培 养 ？ 一、视频演示二、取自己做的培养皿，观察，并作图三、挑取菌落，进行革兰氏染色，初步判别革兰氏阴性或阳性菌四、将自己的培养皿、试管清洗干净，放入抽屉五、作业：从土壤中分离细菌的主要实验步骤。