第三章 免疫分析法课件.ppt

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1、 生 物 药 物 分 析 第 三 章 免 疫 分 析 法 一 、 概 述二 、 抗 原三 、 抗 体 与 免 疫 反 应四 、 免 疫 分 析 方 法 及 应 用主要内容 一 、 概 述二 、 抗 原三 、 抗 体 与 免 疫 反 应四 、 免 疫 分 析 方 法 及 应 用主要内容 免 疫 学 是 研 究 免 疫 系 统 的 结 构 与 功 能 ， 了解 其 在 免 疫 应 答 反 应 中 对 机 体 有 益 的 防 卫 功 能和 有 害 的 病 理 损 伤 的 机 制 ， 研 究 有 效 的 免 疫 措施 ， 实 现 以 防 病 ， 治 病 为 目 的 的 一 门 现 代 医 学学 科 。

2、一、概述 什 么 叫 免 疫 分 析 ？ 基 于 抗 原 和 抗 体 的 特 异 性 反 应 进 行 检 测 的 一 种 技术 手 段 。 抗 原 抗 体 反 应 是 指 抗 原 与 相 应 的 抗 体 之间 发 生 的 特 异 性 结 合 反 应 。 它 既 可 以 发 生 在 体 内 ，也 可 以 发 生 在 体 外 。 在 体 内 发 生 的 抗 原 抗 体 反 应 为 体 液 免 疫 应 答 的 效应 作 用 。 体 外 的 抗 原 抗 体 结 合 反 应 主 要 用 于 抗 原或 抗 体 的 检 测 ， 用 于 免 疫 学 诊 断 。 (1) 在 实 验 药 物 动 力 学 和 临

3、床 药 物 学 中 ， 测 定 生 物 利 用 度和 药 物 代 谢 动 力 学 参 数 等 生 物 药 剂 学 中 的 重 要 数 据 ， 以便 了 解 药 物 在 体 内 的 吸 收 、 分 解 、 代 谢 和 排 泄 情 况 ；(2) 在 药 物 的 临 床 检 测 中 ， 对 治 疗 指 数 小 、 超 过 安 全 剂 量易 发 生 严 重 不 良 反 应 或 最 佳 治 疗 浓 度 和 毒 性 反 应 浓 度 有交 叉 的 药 物 血 液 浓 度 进 行 监 测 ；(3) 在 药 物 生 产 中 ， 从 发 酵 液 或 细 胞 培 养 液 中 快 速 测 定 有效 组 分 的 含 量

4、 ， 以 实 现 对 生 产 过 程 的 在 线 监 测 ；(4) 对 药 品 中 是 否 存 在 特 定 的 微 量 有 害 杂 质 进 行 评 价 。在 药 物 分 析 中 ， 免 疫 分 析 法 的应 用 主 要 集 中 在 以 下 几 方 面 ： 免 疫 分 析 ： 利 用 抗 原 与 抗 体 的 特 异 性 结 合 作 用 ， 来 选 择 性 识 别 和 测 定 ，可 以 作 为 抗 体 或 抗 原 的 待 测 物 .免 疫 分 析 方 法 非 标 记 免 疫 分 析 （ 抗 原 抗 体 结 合 理 化 性 质 发 生 变 化 ） 标 记 免 疫 分 析标 记 物有 无 非 放 射

5、免 疫 分 析放 射 免 疫 分 析 （ 放 射 污 染 ）酶 联 免 疫 分 析荧 光 免 疫 分 析电 化 学 免 疫 分 析化 学 发 光 免 疫 分 析免 疫 分 析 免 疫 分 析 检 测 的 发 展放 射 免 疫 检 测 （ 兴 起 于 20世 纪 70年 代 )酶 联 免 疫 检 测 （ 兴 起 于 20世 纪 80年 代 ，各 临 床 机 构 普 遍 使 用 ） ；以 化 学 发 光 为 代 表 的 光 生 物 学 标 记 及 免 疫 检 测 技 术 （ 20世 纪 90年 代 开 始 推 广 使用 ， 产 品 步 入 成 长 期 ） 三 个 阶 段 。 特 点可 逆 性 比

6、例 性反 应 阶 段 性特 异 性免 疫 分 析 法 的 特 点 特 异 性 特 异 性 ： 抗 原 与 抗 体 结 合 反 应 的 专 一 性 分 子 基 础 :抗 原 表 位 与 抗 体 分 子 高 变 区 之 间空 间 构 型 的 互 补 性 可 逆 性可 逆 性 ： 抗 原 与 相 应 抗 体 结 合 成 复 合 物 后 ， 在 一 定 条件 下 又 可 解 离 为 游 离 抗 原 与 抗 体 ， 解 离 后 的 抗 原 或 抗体 均 能 保 持 原 有 的 结 构 和 活 性 。影 响 因 素 ： 抗 体 对 相 应 抗 原 的 亲 合 力 亲 合 力 越 高 ， 结 合 越牢 固

7、， 越 不 易 解 离 环 境 因 素 对 复 合 物 的 影 响 pH、 离 子 强 度 比 例 性 和反 应 阶 段 性比 例 性 ： 抗 原 与 抗 体 发 生 可 见 反 应 需 遵 循 一 定 的量 比 关 系前 带 (prezone)： 抗 体 过 量后 带 (postzone)： 抗 原 过 量等 价 带 (equivalence zone)： 抗 原 抗 体 比 例 合 适 一 、 概 述二 、 抗 原三 、 抗 体 与 免 疫 反 应四 、 免 疫 分 析 方 法 及 应 用主要内容 2 . 1 定义 抗 原 （ antigen） ： 指 在 机 体 中 引 起 特 异 性

8、免 疫 应 答反 应 的 物 质 。 免 疫 原 性 （ immunogenicity） ： 被 注 射 入 动 物 体 内 后， 使 其 产 生 循 环 抗 体 或 改 变 免 疫 细 胞 的 反 应 性 抗 原 特 异 性 （ antigenic specificity） ： 具 有 能 与 特 异抗 体 作 用 的 性 质 全 抗 原 （ complete antigen） 半 抗 原 （ hapten） ： 只 能 与 特 异 抗 体 作 用 ， 但 不 引 起机 体 免 疫 应 答 的 分 子 2 . 2 药物分子的抗原性 1、 药 物 分 子 的 免 疫 原 性 大 多 数 的 药

9、 物 分 子 通 常 都 是 半 抗 原 ； 一 些 蛋 白 类 药 物 、 多 肽 类 药 物 、 激 素 类 药 物也 是 完 全 抗 原 。 2、 药 物 分 子 的 抗 原 特 异 性 药 物 分 子 和 蛋 白 质 载 体 结 合 后 ， 抗 原 特 异 性可 能 会 发 生 改 变 。 3、 药 物 分 析 中 ， 为 了 得 到 高 效 价 的 抗 血清 ， 通 常 会 与 蛋 白 质 载 体 合 成 人 工 抗 原 进行 试 验 。 常 用 载 体 ： 牛 血 清 白 蛋 白 （ BSA） 、 卵 清白 蛋 白 （ OA） 、 破 伤 风 类 毒 素 （ TT） 、钥 孔 蛋

10、白 （ KLH） 等 。 （1）半抗原和载体结合的化学反应 多 肽 类 激 素 ： 活 化 蛋 白 质 或 多 肽 的 游 离 羧 基 形 成 肽 键； 与 蛋 白 质 或 多 肽 的 游 离 羧 基 缩 合 形 成 肽 键 甾 体 ： 通 过 含 游 离 羧 基 的 甾 体 衍 生 物 与 载 体 蛋 白 相 连 抗 生 素 ： -内 酰 胺 环 在 偏 碱 性 条 件 下 可 以 与 蛋 白 质 的自 由 氨 基 以 酰 胺 键 的 形 式 共 价 结 合 ； 氨 基 糖 苷 类 抗 生素 用 碳 化 二 亚 胺 为 连 接 剂 实 现 药 物 和 载 体 蛋 白 的 连 接 （2）半抗原

11、和载体的选择原则 半 抗 原 ： 最 好 含 有 芳 香 结 构 ； 应 考 虑 抗 原抗 体 反 应 的 微 环 境 ； 合 理 利 用 分 子 类 似 物之 间 的 交 叉 反 应 。 载 体 ： 载 体 对 监 测 系 统 的 影 响 ； 载 体 效 应在 免 疫 过 程 中 的 影 响 。 （3）合成抗原的测定 定 性 测 定 方 法 ： 光 谱 分 析 、 热 力 学 分 析 定 量 测 定 方 法 ： 相 对 含 量 测 定 ； 绝 对 含 量测 定 。 一 、 概 述二 、 抗 原三 、 抗 体 与 免 疫 反 应四 、 免 疫 分 析 方 法 及 应 用主要内容 免 疫 分 析

12、 实 际 上 是 一 种 特 殊 的 试 剂 分 析 ，特 点 是 抗 体 成 为 分 析 试 剂 。 1、抗体的结构与功能抗 体 泛 指 与 待 测 分 子 特 异 性 结 合 的 蛋白 质 分 子 ， 包 括 免 疫 球 蛋 白 （immunoglobulin） , 受 体 （ receptor）和 其 他 结 合 蛋 白 质 ， 主 要 是 免 疫 球 蛋白 ， 常 用 的 是 IgG分 子 . 免 疫 球 蛋 白 的 基 本 结 构 IgG分子基本结构是由四个肽链组成的，二条较小的轻链和二条较大的重链，轻链与重链是由二硫键连接形成，分为氨基端（N端），羧基端（C端）。 抗 体 的 基

13、本 结 构 IgG分 子 由 四 条 多 肽 链 构 成 ， 以 二 硫 键 相 连 ， 有 三 个 功 能 区 。 抗 体 在 Fab区 结 合 抗 原 分 子 ， 同 时 通 过 hi区 的 转 动 以 适 应 不 同 距 离 的抗 原 决 定 簇 。 与 抗 原 结 合 后 ， IgG分 子 构 象 改 变 ， 暴 露 出 Fc上 的 活 性 位 点 ， 从 而 表现 出 固 定 和 激 活 补 体 以 及 粘 结 单 核 细 胞 等 亲 细 胞 反 应 的 功 能 。Fab： 抗 原 结 合 片 段Fc： 可 结 晶 片 段 胃 蛋 白 酶 （ pepsin） 水 解 片 段 裂解部位

14、，铰链区H链间二硫键（C端）裂解片段，F（ab）2，无Fc片段与抗原结合可发生凝集反应 木 瓜 蛋 白 酶 （ papain） 水 解 片 段 裂解部位，铰链区H链间二硫键（N端）裂解片段，2个Fab（54KD），一个Fc（50KD）,Fab与抗原结合，不发生凝集反应。 2抗体作为分析试剂的评价 抗 体 的 特 异 性 是 无 与 伦 比 的 ， 不 需 或 只 需要 简 单 的 预 处 理 。 有 较 高 的 稳 定 性 。 这 两 点 奠 定 了 分 析 免 疫 高 度 灵 敏 和 高 度 专一 的 基 础 。 此 外 ， 抗 体 还 有 一 个 独 特 的 性 质 ： 每 个 抗体 分

15、子 有 两 个 抗 原 的 结 合 点 ， 即 多 价 性 。然 而 抗 体 缺 乏 高 灵 敏 试 剂 应 具 备 的 分 析 信号 反 差 。 3、抗体的制备 （ 1） 常 规 抗 血 清 （ 多 克 隆 抗 体 ） ： 指 人工 被 动 免 疫 后 制 成 的 多 克 隆 抗 体 ， 是 免 疫分 析 中 的 重 要 工 具 。 免 疫 原 的 制 备 、 动 物 免 疫 、 放 血 、 抗 血 清分 离 及 抗 血 清 的 分 析 鉴 定 。 免疫原的制备 免 疫 原 由 质 量 好 的 抗 原 与 佐 剂 制 成 。 通 常有 免 疫 原 水 剂 、 福 氏 完 全 佐 剂 和 福

16、氏 不 完全 佐 剂 。 水 剂 由 无 菌 生 理 盐 水 将 抗 原 制 成 一 定 浓 度的 免 疫 原 。 弗 氏 佐 剂 是 由 一 定 量 的 羊 毛 脂 和 石 蜡 油 ，以 及 一 定 浓 度 的 分 支 杆 菌 混 合 而 成 ， 经 研磨 达 到 油 包 水 的 程 度 。 不 完 全 福 氏 佐 剂 即 不 含 有 分 支 杆 菌 。 动物免疫 通 常 的 免 疫 动 物 为 家 兔 和 羊 。 免 疫 的 部 位 多 采 用 脚 掌 、 腹 股 沟 淋 巴 结 、大 腿 肌 肉 、 皮 下 多 点 、 静 脉 。 免 疫 抗 原 量 通 常 为 110mg或 50100

17、mg。 试血及效价测定 家 兔 的 试 血 通 常 可 由 耳 缘 静 脉 取 血 ， 取 血量 0.5ml。 不 同 稀 释 度 的 抗 血 清 和 1%的 血 细 胞 悬 液按 1:1混 合 ， 37 保 温 2h后 观 测 血 细 胞 的 凝聚 情 况 ， 即 可 测 得 免 疫 血 清 的 效 价 。 （2）单克隆抗体 单 克 隆 抗 体 是 建 立 在 经 细 胞 融 合 而 获 得 的杂 交 瘤 细 胞 基 础 上 的 。 所 获 得 的 抗 体 具 有均 一 的 特 异 性 。 高 度 均 质 性 的 特 异 性 抗 体 ， 由 一 个 识 别 单一 抗 原 表 位 的 B细 胞

18、 克 隆 所 分 泌 。 一 般 来自 杂 交 瘤 细 胞 细 胞 培 养 法 & 接 种 动 物 体 内 生 产 法 制备步骤 2、抗体的纯化 利 用 化 学 方 法 提 纯 或 浓 缩 某 一 类 的 免 疫 球蛋 白 。 利 用 免 疫 吸 附 剂 和 亲 和 色 谱 得 到 免 疫 学 上专 一 性 的 抗 体 。 3、特异性抗体的筛选与效价测定 抗 体 的 效 价 又 称 滴 度 ， 指 某 一 物 质 与 一 定容 量 的 另 一 物 质 产 生 反 应 所 需 要 的 量 。 免 疫 分 析 中 ， 免 疫 血 清 中 抗 体 的 效 价 指 将血 清 稀 释 ， 测 定 与 一

19、 定 的 抗 原 能 发 生 反 应的 最 大 稀 释 度 ， 此 最 大 稀 释 度 即 为 血 清 的效 价 。 常 用 的 效 价 测 定 方 法 有 免 疫 扩 散 法 、 间 接血 凝 法 和 ELISA法 等 。 一 、 概 述二 、 抗 原三 、 抗 体 与 免 疫 反 应四 、 免 疫 分 析 方 法 及 应 用主要内容 四、免疫分析方法及其应用 放 射 免 疫 分 析 法 （ RIA） 荧 光 免 疫 分 析 法 （ FIA） 克 隆 酶 给 予 体 免 疫 分 析 法 （ CEDIA） 酶 联 免 疫 吸 附 分 析 法 （ ELISA） 放 射 免 疫 分 析 法 （ r

20、adioimmunoassay, RIA） 1968年 Miles和 Hales建 立 了 免 疫 放 射 分 析 方 法 ， 利 用 标 记 抗 体 作示 踪 剂 ， 在 反 应 系 统 中 加 入 过 量 的 抗 体 ， 故 其 灵 敏 度 比 放 射 免 疫分 析 法 明 显 提 高 ， 而 且 标 准 曲 线 的 测 量 范 围 也 明 显 扩 大 。 由 于 特 异 性 单 克 隆 抗 体 用 于 免 疫 放 射 分 析 ， 使 本 法 得 到 了 更 快 的发 展 。 近 年 来 ， 基 因 工 程 抗 体 和 抗 原 应 用 于 本 技 术 ， 使 得 免 疫 放射 分 析 法

21、更 加 完 善 。 放 射 免 疫 分 析 （ radioimmunoassay， RIA） 是 体 外 放 射 分 析 技 术中 建 立 最 早 、 应 用 最 广 的 一 类 竞 争 性 体 外 放 射 分 析 技 术 . 基 本 原 理 基 本 原 理 ： 放 射 性 标 记 抗 原 与 非 标 记 抗 原 （ 包 括 标 准 抗原 或 待 测 抗 原 ） 与 有 限 量 的 特 异 性 抗 体 发 生 可 逆 性 竞 争结 合 ,这 种 竞 争 可 用 以 下 反 应 式 来 表 示 ： Ag + Ab AgAb + Ag+* Ag *Ag + *AgAb 抗 原 抗 体 常 用 的

22、标 记 物 ： 125 I和 氚 标 记 物放 射 性 活 度 （ 贝 克 ， Bp）1Bp： 每 秒 一 次 核 衰 变比 活 度 （ Bp/g） ：每 单 位 质 量 所 含 的 放 射 性 比 活 度游 离 状 态结 合 状 态 具 体 步 骤 抗 原 抗 体 反 应结 合 的 和 游 离 的放 射 性 物 质 的 分 离放 射 性 活 度 的 测 定 柱 色 谱 法吸 附 法沉 淀 法抗 抗 体 发微 孔 滤 膜 法固 相 法 求 出 结 合 率 ， 绘 制 标 准 曲 线 （ 剂 量 反 应 曲 线 ） 荧 光 免 疫 分 析 法 （ Fluorescence immunoassay

23、, FIA）免 疫 荧 光 技 术 是 将 抗 原 抗 体 反 应 的 特 异 性 和 敏 感 性 与 显 微 示 踪 的 精 确 性 相 结 合 的 一 项 技 术以 荧 光 素 作 为 标 记 物 ， 与 已 知 的 抗 体 或 抗 原 结 合、 但 不 影 响 其 免 疫 学 特 性 。 然 后 将 荧 光 素 标 记 的抗 体 作 为 标 准 试 剂 ， 用 于 检 测 和 鉴 定 未 知 的 抗 原 荧 光 免 疫 分 析 法 （ Fluorescence immunoassay, FIA）在 荧 光 显 微 镜 下 ， 可 以 直 接 观 察 呈 现 特 异 性 荧 光的 抗 原

24、抗 体 复 合 物 及 其 存 在 的 部 位在 实 际 工 作 中 ， 由 于 荧 光 素 标 记 抗 体 检 查 抗 原 的方 法 较 为 常 用 ， 所 以 一 般 通 称 为 荧 光 抗 体 技 术 根 据 实 验 方 法 分 类 直 接 法 间 接 法 补 体 法 其 他 直 接 法 将 荧 光 标 记 的 特 异 性抗 体 （ 抗 原 ） 直 接 加在 抗 原 （ 抗 体 ） 上 ，经 一 定 的 温 度 和 时 间染 色 ， 水 洗 -干 燥 -封片 -镜 检 操 作 简 便 、 特 异 性 高、 非 特 异 性 染 色 少 敏 感 性 低抗 原 标 记 抗 体 荧 光 间 接

25、法 先 用 已 知 未 标 记 的特 异 抗 体 （ 一 抗 ）与 抗 原 反 应 ， 再 用标 记 的 抗 体 （ 二 抗） 与 其 反 应 ， 形 成抗 原 -抗 体 -抗 体 复合 物 ， 水 洗 -干 燥 -封 镜 -镜 检未 知 抗 原 未 标 记抗 体 标 记 抗体 荧 光 补 体 法 利 用 补 体 反 应 ， 通 过形 成 抗 原 -抗 体 -补 体复 合 物 发 射 荧 光补 体 标 记 抗补 体 抗体 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 测 定 利 用 具 有 双 功 能 基 团 结 构 的 螯 合剂 ， 将 镧 系 元 素 标 记 到 抗 体 （ 或 抗 原） 上 ， 经 免

26、 疫 反 应 形 成 复 合 物 ， 由 于镧 系 元 素 能 发 出 荧 光 ， 故 分 离 除 去 未结 合 的 成 分 后 ， 利 用 时 间 分 辨 荧 光 仪即 可 测 定 荧 光 强 度 ， 从 而 推 测 待 测 物含 量 。 基 本 原 理 它 采 用 抗 原 与 抗 体 的 特 异 反 应 将 待 测 物与 酶 连 接 ， 然 后 通 过 酶 与 底 物 产 生 颜 色 反 应 ，用 于 定 量 测 定 。 测 定 的 对 象 可 以 是 抗 体 也 可 以 是 抗 原 。在 这 种 测 定 方 法 中 有 3种 必 要 的 试 剂 ： 固 相 的 抗 原 或 抗 体 （ 免

27、 疫 吸 附 剂 ） 酶 标 记 的 抗 原 或 抗 体 （ 标 记 物 ） 酶 作 用 的 底 物 （ 显 色 剂 ）酶 联 免 疫 吸 附 分 析 法 （ ELISA） 双 抗 体 夹 心 法 ， 属 于 非 竞 争 结 合 测 定 。 它 是 检 测 抗 原 最 常 用 ELISA， 适 用 于 检 测 分 子 中 具 有至 少 两 个 抗 原 决 定 簇 的 多 价 抗 原 。其 基 本 工 作 原 理 是 ： 利 用 连 接 于 固 相 载 体 上 的 抗 体和 酶 标 抗 体 分 别 与 样 品 中 被 检 测 抗 原 分 子 上 两 个 抗原 决 定 簇 结 合 ， 形 成 固

28、相 抗 体 -抗 原 -酶 标 抗 体 免 疫 复合 物 。 复 合 物 的 形 成 量 与 待 测 抗 原 的 含 量 成 正 比 。测 定 复 合 物 中 的 酶 作 用 于 加 入 的 底 物 后 生 成 的 有 色物 质 量 (OD值 )， 即 可 确 定 待 测 抗 原 含 量 。 实验原理 双抗体夹心法 酶 结 合 物 是 酶 与 抗 体 或 抗 原 联 结 的 产 物 。具 有 酶 促 反 应 ， 显 示 出 生 物 放 大 作 用 。在 ELISA中 ， 常 用 的 酶 为 辣 根 过 氧 化 物 酶 (horseradish peroxidase, HRP)和 碱 性 磷 酸

29、 酶 (alkaline phosohatase, AP)。1、 HRP催 化 过 氧 化 物 的 氧 化 反 应 。供 氢 体 ： 邻 苯 二 胺 (OPD)、 四 甲 基 联 苯 胺 (TMB) OPD氧 化 后 的 产 物 呈 橙 红 色 ， 用 酸 终 止 酶 反 应 后 ， 最 适 吸 收 波 长为 492nmTMB经 HRP作 用 后 共 产 物 显 蓝 色 ， 用 HCL或 H2SO4终 止 后 ， 由 蓝色 呈 黄 色 ， 最 适 吸 收 波 长 为 405nm 2、 AP为 磷 酸 酯 酶 一 般 采 用 对 硝 基 苯 磷 酸 酯 (p-NPP)作 为 底 物 。 产 物 为 黄 色 的 对 硝基 酚 ， 在 405nm波 长 处 有 吸 收 峰 。 用 NaOH终 止 酶 反 应 DNM-9602G酶 标 分 析 仪DNM-9602 标 配 酶 标 分 析 仪 DNM-9602A酶 标 分 析 仪酶 标 分 析 仪 思考题1. 论述免疫分析法的定义，主要包括哪些方法？2. 半抗原、全抗原、合成抗原、抗体、单克隆抗体的定义？3. 什么是抗体的效价？ 4. 常用的抗体包括哪两类？并比较它们的特性。5. 论述放射免疫测定法（RIA）与酶联免疫分析法（ELISA）的基本原理与方法步骤