药物定量分析与分析方法验证

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1、药物的含量测定方法与验证 定 量 分 析 方 法 的 分 类 与 特 点 1 样 品 分 析 的 前 处 理 方 法 2 药 品 质 量 标 准 分 析 方 法 验 证 3 第 一 节定 量 分 析 方 法 的 分 类 与 特 点 一 、 容 量 分 析 法二 、 光 谱 分 析 法 三 、 色 谱 分 析 法 一 、 容 量 分 析 法(一 ) 特 点 与 适 用 范 围 (1) 方 法 简 便 易 行 (2) 方 法 耐 用 性 高 (3) 测 定 结 果 准 确 (4) 方 法 专 属 性 差 适 用 于 原 料 药 含 量 测 定 (二 ) 有 关 计 算 :1. 滴 定 度 与 滴

2、定 度 计 算2. 含 量 计 算 (1) 直 接 滴 定 法 (2) 间 接 滴 定 法 生 成 物 滴 定 法 剩 余 量 滴 定 法 将 已 知 浓 度 滴 定 液 滴 加 至 被 测 药 物 溶 液 中 ,至 滴 定 终 点 ,根 据 滴 定 液 的 浓 度 ,体 积 和 滴 定度 ,计 算 含 量 . 结 果 计 算1、 滴 定 度 的 计 算aA+bB=cC+dD; cC+eE=fF+gG; 滴 定 反 应 fF+hH=iI+lL aA hH MhamT m:滴 定 剂 摩 尔 浓 度 ； M被 测 物 摩 尔 质 量 ；a/h:反 应 摩 尔 比 2. 含 量 测 定 直 接 滴

3、 定 法 生 成 物 滴 定 法 剩 余 量 滴 定 法 (1)(2)(3) (1) 直 接 滴 定 法 % 100(%) WTV含 量 规 定 摩 尔 浓 度实 际 摩 尔 浓 度F %100%100100%(%) W FTVWTVWTV含 量注 意 掌 握 滴 定 反 应 的 原 理 , 药 物 与 滴 定 剂 在 反 应 中 的 摩 尔 比正 确 计 算 滴 定 度 和 百 分 含 量 (2) 生 成 物 滴 定 法 %100%100100%(%) W FTVWTVWTV含 量注 意 摩 尔 比 的 替 换药 物 与 A作 用 生 成 B, 用 滴 定 液 滴 定 B百 分 含 量 计

4、算 方 法 与 直 接 滴 定 法 相 同 （ 3） 回 滴 定 （ 剩 余 滴 定 ） （ a） 不 做 空 白 试 验 时 百 分 含 量 计 算 （ b） 做 空 白 试 验 时 百 分 含 量 计 算 %100)V% A W TFVF BBA（含 量 %100)V% 0 W FTVB（含 量 司 可 巴 比 妥 钠 含 量 测 定 : 本 品 约 0.1g, 加 水 10ml溶解 , 精 密 加 溴 滴 定 液 (0.05mol/L)25ml, 再 加 盐 酸 5ml, 放 置 15分 钟 , 加 碘 化 钾 试 液 10ml, 用 硫 代 硫 酸 钠 滴 定液 (0.1mol/L)滴

5、 定 , 滴 定 的 结 果 用 空 白 试 验 校 正 W=0.1022g; 硫 代 硫 酸 钠 滴 定 液 F=1.038; 供 试 品 消 耗 硫 代 硫 酸 钠 滴 定 液 15.73ml;空 白 23.21ml 滴 定 度 (mg/ml) 01.1327.260111.0 MbamT司 可 巴 比 妥 钠 M=260.27, 与 溴 摩 尔 比 为 1:1 %8.98%10010001022.0 01.13038.1)73.1521.23( %100)(%) 2322322 BrOSNaOSNaS0 W TFVV司 可 巴 比 妥 含 量 二 、 光 谱 分 析 法定 义 分 类 利

6、 用 物 质 的光 谱 进 行 定 性 、定 量 和 结 构 分析 的 方 法 光 谱 分 析 法 (flame photometry) 三 、 色 谱 分 析 法特 点 与 应 用 分 类 ：(1) 高 灵 敏 度 :ng-g/ml(2) 高 专 属 性 :选 择 性 检 测(3) 高 效 能 与 高 速 度 复 方 制 剂 含 量 测 定的 首 选 方 法 ： 第 二 节 样 品 分 析 的 前 处 理 方 法一 、 不 经 有 机 破 坏 的 前 处 理 方 法 二 、 经 有 机 破 坏 的 前 处 理 方 法(一 ) 水 解 法 ; (二 ) 还 原 法(一 ) 干 法 破 坏 ;

7、(二 ) 湿 法 破 坏 进行药物定量分析之前，一般都需要对样品进行前处理。 根据待测元素在药物分子中结合的牢固程度，前处理方法各异。 在分析含金属或含卤素、氮、硫、磷等元素的有机药物前，需进行适当的样品前处理。 含 卤 素 有 机 药 物 系 指 药 物 分 子 结 构中 所 含 卤 素 直 接 与 芳 环 或 脂 肪 链 相 连 者 ，而 不 包 括 某 些 有 机 药 物 的 卤 酸 盐 或 氢 卤酸 盐 。 一 、 不 经 有 机 破 坏 的 方 法 1.酸 水 解 法水 难 溶 性 含 金 属有 机 药 物 与 矿 酸(盐 酸 )共 热 : 回 流有 机 结 合 的 待测 元 素 原

8、 子 离解 , 转 化 为 无 机盐 (离 子 ) 2. 碱 水 解 法含 卤 素 有 机 药 物(脂 肪 碳 链 )与 氢 氧化 钠 溶 液 回 流 :适 用 于 : 结 合 不 牢 固 的 含 金 属 或 含 卤 素 有 机 药 物(一 )水 解 法 碘 他 拉 酸 测定 :氢 氧 化 钠试 液 与 锌 粉回 流 后 , 用 硝酸 银 滴 定 回 流碱 性 溶 液 中 加锌 粉 回 流 , 使 碳 -碘 键 还 原 转 化为 无 机 碘 化 物 碘 番 酸胆 影 酸胆 影 葡 胺 注 射 液泛 影 酸泛 影 酸 钠泛 影 葡 胺 注 射 液 适 用 于 : 结 合 牢 固 的 含 碘 有

9、机 药 物 (直 接 与 芳 环 连 接 ) (二 )还 原 法 常见的含卤素有机药物CCH3 OHCH3CCl3三氯叔丁醇CCl3Cl3C六氯对二甲苯 COOHI II NHCOCH3CH3CONH泛影酸 COOHI II NH C (CH2)4O C NHO COOHIII胆影酸 COOHI II CONHCH3CH3CONH碘他拉酸 IH2N II CH2CHCOOHC2H5碘番酸 CHCH3 (CH2)8 COOCH2CH3I碘苯酯 O CH2CH2CH2CH3CO OCH2CH2N(C2H5)2II HCl盐酸胺碘酮 HN NF NC2H5O COOH诺氟沙星 O FFCH3 HHO

10、 HCH3CCH2OCOCH3O OO C CH3CH3醋酸氟轻松 Br BrBrBr CC OOHO SO 3Na SO3NaOH磺溴酞钠 含卤素有机药物的分析 XXC 适 当 的 处 理直接回流后测定法碱性或酸性还原后测定法氧瓶燃烧分解后测定法 有机金属药物：金属原子直接与碳原子以共价键相连，结合比较牢固 如卡巴胂、醋酸苯汞、汞撒利 C CHO CHO O O CO OSbSb OOCOOO CHO CHC 2K+ 3H2O酒石酸锑钾 Mg(C17H35COO)2硬脂酸镁CCH CC OO O Fe O富马酸亚铁 CH2OHCHOHCHOCHOCHOCOO- SbOH O SbO- OCH

11、CHCHCCHOOCH2 -OOHO HO Na39H 2O葡萄糖酸锑钠 NHCONH2AsO OHHO卡巴胂HgOCOCH3醋酸苯汞 OCH2COONaCONHCH2CHCH2HgOHOCH3汞撒利 二 、 经 有 机 破 坏 的 方 法(一 ) 湿 法 破 坏p 适 用 于 含 氮 有 机 药 物 分析 的 前 处 理p 硫 酸 作 为 分 解 剂 , 氧 化 剂(硝 酸 ,高 氯 酸 )辅 助 分 解 剂 p 凯 氏 定 氮 法 (二 ) 干 法 破 坏 高 温 炽 灼 法 用 于 含 卤 素 药 物 的 鉴 别 无 水 碳 酸 钠 ,硝 酸 镁 ,氢 氧化 钙 ,氧 化 锌 等 辅 助

12、 灰 化 2. 氧 瓶 燃 烧 法适 用 于 : 含 金 属 , 卤 素 , 氮 , 硫 , 磷 等 有 机 药 物 (待 测 原 子 与 碳 原 子 结 合 牢 固 者 ) 1. 高 温 炽 灼 法 高 温 灼 烧 灰 化 用 于 含 卤 素 药 物 的 鉴 别2. 氧 瓶 燃 烧 法 （ 1） 氧 瓶 燃 烧 法 原 理 氧瓶燃烧法：将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定。 NaCl HClOClC NaOH 2 溶 液 点 燃 适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析。

13、 本法特点是简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析。 （ 2） 仪 器 与 材 料 仪器装置 燃烧瓶为500、1000或2000ml无色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶；瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状 称 样 用 材 料 及 称 样A. 固 体 样 品 无 灰 滤 纸B. 液 体 样 品 纸 袋C. 软 膏 类 样 品 ： 将 适 量 样 品 置 不 含 被 测 成分 的 蜡 油 纸 中 包 裹 严 密 ， 外 层 再 用 无 灰 滤纸 包 裹 氧 气 吸 收 液A. 作 用 ： 吸 收 液 的 作 用 是 将 样 品 经 燃 烧 分解 所 产 生 的 各 种 价 态 的

14、卤 素 、 硫 、 氮 、 硒等 ， 定 量 地 吸 收 并 转 变 为 一 定 的 便 于 测 定的 价 态 B. 吸 收 液 的 选 择氟 水 氯 NaOH溶 液溴 H2O2-NaOH NaOH-硫 酸 肼 饱 和 溶 液碘 NaOH 硫 酸 肼 饱 和 溶 液硫 NaOH或 H2O2 硒 硝 酸 溶 液 （ 3） 操 作 方 法 燃 烧 瓶 燃 烧 前 的 准 备 用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，将瓶口用水湿润，小心急速地通入氧气1min，立即用表面皿覆盖瓶口。 样 品 的 准 备 取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。 样 品 的 燃 烧 点燃

15、包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，待燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液，同法另做空白试验。然后按各药品项下规定的方法进行鉴别、检查或含量测定。 根据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶。 ChP（2005）规定的燃烧瓶体积为500、1000或2000ml三种，采用常量或半微量分析注 意 事 项 ： 待 分 解 样 品 量 燃 烧 瓶 的 体 积 35mg（ 微 量 分 析 ） 150250ml 2030mg（ 半 微 量 分 析 ） 300500ml 5060mg 100

16、0ml 0.60.7g或 更 多 2000ml或 特 殊 结 构的 燃 烧 瓶 正确选用燃烧瓶的目的在于：样品能在足够的氧气中燃烧分解完全；有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。 测定含氟有机药物时，用石英制燃烧瓶铂丝燃烧时起催化作用应同时做空白试验燃烧时要注意防爆燃烧要完全燃烧产生的烟雾完全被吸收 应 用例 磺溴酞钠的含量测定 ChP (2005)Br BrBrBr CC OO HO SO3Na SO3NaOH Br BrBr Br O SOHHO S ONaOO ONa OO O 燃 烧 分 解O2 HBr + S2- + SO4 + HBr + S2- NaBr +

17、 Na2SO4 + H2O NaOH, H2O2 含金属的有机药物：金属原子不与碳原子直接相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物 如酒石酸锑钾、葡萄糖酸锑钠、富马酸亚铁 需 验 证 的 项 目 验 证 的 内 容准 确 度防 腐 剂溶 出 度 ,释 放 度鉴 别 试 验杂 质 检 查含 量 测 定第 三 节 药 品 质 量 标 准 分 析 方 法 验 证 精 密 度 专 属 性 检 测 限 重 复 性中 间 精 密 度重 现 性 一 、 准 确 度 （ accuracy） ： 测 量 值 与 真 实 值 接 近 的 程 度 表 示 : 回 收 率 测 定 方 法 ： 回 收 试 验 加 样

18、 回 收 试 验 （ 一 ） 含 量 测 定 方 法 的 准 确 度 1、 原 料 药 回 收 试 验 ： 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M 100%MR A 加 样 回 收 试 验 ：已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。100%M PR A 原 料 药 （ 1） 可 用 已 知 纯 度 的 对 照 品 或 样 品 进 行 测 定（ 2） 用 本 法 所 得 结 果 与 已 建 立 准 确 度 的 另 一 方 法测 定 的 结 果 进 行 比 较 。 100% 加 入 量测 得 量回 收 率 2、 制 剂（ 1） 用 含 己 知 量

19、被 测 物 的 各 组 分 混 合 物 进行 测 定 ， 即 采 用 在 空 白 辅 料 中 加 入 原 料药 对 照 品 的 方 法 。（ 2） 如 不 能 得 到 制 剂 的 全 部 组 分 ， 可 向制 剂 中 加 入 已 知 量 的 被 测 物 进 行 测 定 。（ 3） 另 一 个 已 建 立 准 确 度 的 方 法 比 较 结果 。 100% 加 入 量本 底 量测 得 量回 收 率 中 药 分 析 的 准 确 度 一 般 用 加 样 回 收 试 验 衡 量 。 中 药 回 收 率 一 般 要 求 在 95 105%范 围内 ， 有 些 方 法 操 作 步 骤 繁 多 时 ， 可

20、要 求 在90 110%范 围 内 。 RSD一 般 在 3%以 内 。 （二）杂质定量测定的准确度 （ 1） 可 向 原 料 药 或 制 剂 中 加 入 已 知量 杂 质 进 行 测 定 。 （ 2） 如 果 不 能 得 到 杂 质 或 降 解 产 物 ，可 用 本 法 测 定 结 果 与 另 一 成 熟 的 方 法 进 行比 较 。 （ 三 ） 数 据 要 求规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次。 二 、 精 密 度1.重 复 性p 同 一 分 析 人 员连 续 测 定 所 得 结果 的 精 密 度 ;p 也 称 批 内 精 密度 或 日 内 精 密 度 2

21、.中 间 精 密 度p 不 同 时 间 不 同分 析 人 员 用 不 同设 备 测 定 结 果 之间 的 精 密 度p 批 /日 间 精 密 度 3.重 现 性 p 在 不 同 实 验 室不 同 人 员 测 定 结果 之 间 的 精 密 度p 法 定 标 准 采 用 的分 析 方 法 进 行 v同 一 均 匀 供 试 品 多 次 取 样 测 定 所 得 结 果 之 间 的 接 近 程 度 v标 准 偏 差 (s,SD);相 对 标 准 偏 差 (RSD)v数 据 要 求 同 “ 准 确 度 ”定 义 偏 差 （ d） ： 测 量 值 与 平 均 值 之 差id x x 标 准 （ 偏 ） 差

22、（ SD或 S） : 21 ix xS n 100%SRSD x 三 、 专 属 性 （ specificity） : 指 有 其 他 成 分 （ 杂 质 、 降 解 物 、辅 料 等 ） 可 能 存 在 情 况 下 采 用 的方 法 能 准 确 测 定 出 被 测 物 的 特 性 )。 (一 ) 鉴 别 反 应 空 白 , 结 构 相似 物 或 有 关 物 质 呈负 反 应 (二 ) 含 量 与 杂 质 测 定 含 杂 质 或 降 解 产物 的 试 样 中 各 峰 能获 得 分 离v 在 其 他 成 分 (杂 质 ,降 解 产 物 ,辅 料 等 )可 能 存 在 下 ,方 法 能 正 确 测

23、 定 出 被 测 物 的 特 性v 鉴 别 ,杂 质 检 查 和 含 量 测 定 方 法 定 义与 应 用 四 、 检 测 限 （ limit of detection， LOD） ： 药 物 能 被 检 出 的 最 低 浓 度 (g/ml) 测 定 : 信 噪 比 法 (S:N=3:1) 适 用 于 可 用 目 视 法 直 接 评 价 结 果 的 分 析 方 法 , 非 仪 器 分 析 法 鉴 别 的 显 色 法 ;杂 质 检 查 的 TLCl适 用 于 能 直 观 显 示 信 号 与 基 线 噪 声 水 平 的 分 析 方 法 , 如 HPLC法 l 信 噪 比 S/N=3(2)时 的 相

24、 应 浓 度 或 量p 适 用 于 不 能 直 观 比 较 信 噪 比 的 仪 器 分 析 方 法 , 如 UV-Vis法 常 用 方 法 1.目 视 法 2.信 噪 比 法 3.标 准 偏 差 法 空样样空 SACSfLOD 33 五 、 定 量 限杂 质 和 降 解 产 物 用 定 量 方 法 研 究 时 , 应 确 定 LOQ LOQ的 测 定 方 法 与 LOD相 同相 应 的 系 数 (倍 数 )不 同 , 如 信 噪 比 S/N=10定 量 限 (limit of quantitation, LOQ )是 指 试 样中 被 测 物 能 被 定 量 测 定 的 最 低 量 ; 六 、

25、 线 性 范 围 系 指 方 法 适 用 的 高 低 限 浓 度 或 量 的 区 间 在 试 验 研 究 开 始 前 确 定 验 证 的 范 围 和 方 法 在 范 围 内 应 能 达 到 一 定 精 密 度 ,准 确 度 和 线 性p 线 性 系 指 在 设 计 的 “ 范 围 ” 内 , 响 应 值 (y)与 被测 物 浓 度 (x)直 接 呈 正 比 关 系 的 程 度 y = ax + bp 系 列 (n5)供 试 样 品 测 定 ,以 响 应 信 号 作 为 被 测物 浓 度 的 函 数 作 图p 用 最 小 二 乘 法 进 行 线 性 回 归 ; 或 经 数 学 转 换 后再 进

26、行 线 性 回 归 七 、 范 围 原 料 药 /制 剂 含 量 测 定 : 80%120% 制 剂 含 量 均 匀 度 检 查 : 70%130% 溶 出 度 或 释 放 度 检 查 : 下 限 -20%上 限 +20% 特 殊 元 素 含 量 测 定 : 下 限 -20%上 限 +20% 杂 质 测 定 : 限 度 20%u 涉 及 定 量 测 定 的 项 目 均 需 对 范 围 进 行 验 证如 : 含 量 测 定 , 含 量 均 匀 度 , 溶 出 度 或 释 放 度 , 特 殊 元 素 或 特 殊 杂 质 的 定 量 检 查 八 、 耐 用 性 耐 用 性 系 指 在 测 定 条 件

27、 有 小 的 变 动 时 , 测 定结 果 不 受 影 响 的 承 受 程 度 ; 体 现 测 定 条 件 的允 许 变 动 范 围 HPLC法 典 型 因 素 有 : 流 动 相 的 组 成 和 pH值及 流 速 , 不 同 厂 牌 或 不 同 批 号 的 同 类 型 色 谱柱 , 柱 温 等 GC法 典 型 因 素 有 : 不 同 厂 牌 或 批 号 的 色 谱 柱 , 固 定 相 , 不 同 类 型 的 担 体 , 柱 温 , 进 样 口 和 检测 器 温 度 等 九 、 验 证 内 容 的 选 择 验 证 内 容 选 择 的 一 般 原 则 : 非 定 量 分 析 方 法 如 鉴 别

28、,杂 质 的 限 度 检 查 法 : 验证 “ 专 属 性 ” ,“ 检 测 限 ” 和 “ 耐 用 性 ” 定 量 分 析 方 法 如 原 料 药 或 制 剂 的 含 量 测 定 及 含量 均 匀 度 ,溶 出 度 或 释 放 度 的 测 定 方 法 : 除 “ 检 测限 ” 和 “ 定 量 限 ” 外 , 其 余 均 验 证 微 量 定 量 分 析 方 法 如 杂 质 的 定 量 测 定 方 法 : 除“ 检 测 限 ” 视 情 况 而 定 外 , 其 余 均 验 证 检 验 项 目 和 验 证 内 容 ： 项 目内 容 鉴 别 杂 质 测 定 含 量 测 定及 溶 出 量测 定定 量 限

29、 度准 确 度 精 密 度 重 复 性 中 间 精 密 度 专 属 性 检 测 限 定 量 限 线 性 范 围 耐 用 性 已 有 重 现性 验 证 ，不 需 验 证中 间 精 密度 如 一 种 方法 不 够 专属 ， 可 用其 他 分 析方 法 予 以补 充 视 具 体 情况 予 以 验证 各 种 含 量 测 定 方 法 对 效 能 指 标 的 要 求 1. 容 量 分 析 法 ：用原料药精制品(含量99.5)或对照品考察方法的精密度，相对标准差一般应不大于0.2；进行回收率试验。回 收 率 一 般 在 99.7 100.3 之 间 。 2. UV法 ：用 适 当 浓 度 的 精 制 品 进

30、 行 测 定 ， 其 RSD一般 不 大 于 1 。制 剂 的 测 定 ， 回 收 率 一 般 应 在 98 102之 间 。 线 性 ：吸光度A一般在0.20.7，浓度点n5。用浓度c对A作线性回归处理，得一直线方程，R应大于0.999(n5)，方程的截距应近于零。 3. HPLC法 ：要 求 RSD2 ， 回 收 率 98 102 之 间 。线 性 范 围 ：用精制品配制一系列标准溶液，浓度点n应为57，用浓度c对峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，建立回归方程，R应大于0.999，截距应趋于零。 专 属 性 ：要考查辅料、有关物质或降解产物对主药的色谱峰是否有干扰，如有干扰应设法排除。 生 物 样 品 分 析 时 ， 常 用 RSD表 示 精 密度 ， 并 可 细 分 为 批 内 （ 或 日 内 ） 精 密 度 及 批间 （ 或 日 间 ） 精 密 度 。 批 内 精 密 度 ： 是 同 一 次 测 定 的 精 密 度 。所 得 RSD应 争 取 达 到 5 以 内 ， 但 不 能 超 10 。 批 间 精 密 度 ： 是 不 同 次 测 定 的 精 密 度 。所 得 RSD应 控 制 在 15 以 内 。 附录药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则规定一般RSD应小于15%，在LOQ附近RSD应小于20%。