化学发光法检测传染病课件.pptx

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1、化 学 发 光 法 快 速 检 测 传染 病 更 灵 敏 、 更 特 异 、 更 准 确 放 免 酶 联 免 疫 化 学 发 光荧 光 免 疫60年 代 70年 代 80年 代 90年 代免 疫 标 记 技 术 发 展国 产 进 口 酶 促 化 学 发 光直 接 化 学 发 光 化 学 发 光 技 术 的 优 势 与 应 用 前 景.敏 感 度 高 ， (10-21mol/L)超 过 酶 免 ， 荧 光 免 疫 等 方法.精 密 度 ， 准 确 度 超 过 放 免 ， 酶 免 ， 荧 光 免 疫 等 方法.试 剂 稳 定 ， 无 放 射 性 ， 污 染 或 生 物 毒 性 ；.测 定 耗 时

2、短 ， 方 便 快 速 提 供 结 果 报 告 ；.测 定 项 目 齐 全 ； 已 发 展 成 全 自 动 的 测 定 系 统 。 包 被 微 粒 子包 被 磁 珠 包 被 微 孔包 被 试 管包 被 技 术 的 发 展 -磁 微 粒 子 包 被 磁 微 粒 标 记 异 鲁 米 诺 Eg:双 抗 夹 心 法 分 析 模 式 磁 微 粒 子 上 包 被 的 抗 体 与 待 检 测 抗 原 及异 鲁 米 诺 标 记 抗 体 结 合 提 升 检 测 功 能 灵 敏 度 增 加 检 测 线 性 范 围 比 吖 啶 酯 更 稳 定 延 长 试 剂 效 期 微 粒 包 被液 相 反 应 磁微粒、直接化学发

3、光反应反 应 充 分速 度 更 快 酶 标 板 ， 板 式 磁 微 粒 ， 纳 米 级 ， 均 相 CLIA 板 式 载 量微 粒 子 化 学 发 光 法 抗 体 载 量 优 势 分 配 样 品 ,磁 颗 粒和 试 剂 孵 育使 反 应 物结 合 在 磁 场 中清 洗 去 除未 结 合 物 质 加 入激 发 液产 生信 号 信 号检 测微 粒 子 化 学 发 光 原 理 磁 性 微 粒 子 及 其 分 离 技 术磁 性 微 粒 子 技 术 的 优 点 ： 快 速 分 离 结 合 相 与 游 离 相 提 高 与 Ag或 Ab包 被 亲 和 力 提 高 接 触 表 面 积 /反 应 容 量 比 例

4、 ， 实 现 微 量 分 析 不 需 要 抗 体 分 离 步 骤 ， 杜 绝 干 扰 与 交 叉 反 应 允 许 共 价 耦 合 反 应 ， 因 此 可 以 检 测 大 /小 分 子 的 各 种 物 质 成 分 能 应 用 各 种 分 析 设 计 与 反 应 模 式 ， 扩 大 应 用 范 围 如 ： 夹 心 法 ， 竟 争 法 ， 抗 体 检 测 法 等 利 于 检 测 自 动 化 与 微 量 分 析 v磁 微 粒 子 直 接 化 学 发 光 是 最 新 一 代 免 疫 检 测 新 技 术v具 有 液 相 、 快 速 、 灵 敏 、 准 确 的 特 点v通 过 多 中 心 的 临 床 评 估

5、 ， 基 本 上 验 证 了 LICA在 乙 肝 、 丙 肝、 梅 毒 、 艾 滋 、 肿 瘤 标 志 物 、 甲 状 腺 功 能 等 项 目 的 临 床 可用 性v多 家 临 床 试 验 显 示 产 品 的 质 量 不 亚 于 进 口 的 雅 培 、 罗 氏 和西 门 子 等 厂 家 的 产 品 媲 美 。 v 1） 磁 性 微 粒 子 技 术 ： 便 于 分 离 ， 反 应 均 匀 ， 提 高 灵 敏 度v 2） 泉 涌 内 外 壁 清 洗 技 术 ： 最 小 的 交 叉 污 染 率v 3） 试 剂 盒 盖 设 计 ： 减 少 人 工 操 作 误 差 和 交 叉 污 染 ， 避 免 试 剂

6、 挥 发 影 响 结 果 准 确 性v 4） 试 剂 冷 藏 系 统 ： 保 证 在 仪 器 操 作 的 过 程 中 试 剂 能 够 一 直 保 持 稳 定v 5） 磁 性 分 离 技 术 ： 保 证 了 清 洗 效 率 ， 对 于 灵 敏 度 要 求 极 高 的 标 记 免 疫 分 析 是 十 分关 键 的 技 术 雅 培 免 疫 项 目甲 状 腺 功 能甲 状 腺 素三 碘 甲 状 腺 原 氨 酸游 离 甲 状 腺 素游 离 三 碘 甲 状 腺 原 氨 酸促 甲 状 腺 素性 腺 激 素人 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 催 乳 素雌 二 醇卵 泡 刺 激 素黄 体 生 成 素孕 酮睾 酮

7、 肿 瘤 标 志 物甲 胎 蛋 白癌 胚 抗 原前 列 腺 特 异 性 抗 原游 离 前 列 腺 特 异 性 抗 原糖 类 抗 原 125糖 类 抗 原 15-3糖 类 抗 原 19-92微 球 蛋 白铁 蛋 白神 经 元 特 异 性 烯 醇 化 酶人 钙 结 合 蛋 白肿 瘤 相 关 抗 原 72-4鳞 状 上 皮 癌 相 关 抗 原细 胞 角 蛋 白 CYFRA 21-1 心 血 管 及 心 肌 标 志 物N末 端 脑 钠 肽肌 钙 蛋 白 肌 酸 激 酶 同 工 酶C反 应 蛋 白心 肌 脂 肪 酸 结 合 蛋 白脂 蛋 白 相 关 磷 脂 酶A2髓 过 氧 化 物 酶肌 红 蛋 白肝

8、纤 维 化 四 项透 明 质 酸 型 前 胶 原 N端 肽 型 胶 原 蛋 白层 粘 连 带 白传 染 病乙 型 肝 炎 病 毒 前 S1抗 原乙 型 肝 炎 病 毒 e抗 体乙 型 肝 炎 病 毒 e抗 原乙 型 肝 炎 病 毒 核 心 抗 体乙 型 肝 炎 病 毒 表 面 抗 体乙 型 肝 炎 病 毒 表 面 抗 原丙 型 肝 炎 抗 体 （ HCV）梅 毒 抗 体 （ TP）人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 抗 体糖 代 谢 类胰 岛 素C-肽 全 自 动 、 管 式 、 直 接 化 学 发 光 法 -特 异 性 强 、 性 能 稳 定 超 长 时 间 无 人 值 守 （ 1） 试 剂 区

9、 15个 试 剂 位 ， （ 2） 样 本 区 12 12 = 144 个 样 本 位 （ 3） 码 垛 区 一 次 性 装 载 720个 反 应 杯 测 试 中 可 随 时 添 加 ， 随 时 替 换 真 正 的 急 诊 功 能 ， 急 诊 样 本 ， 随 到 随 测 。 测 试 速 度 高 达 220测 试 /小 时 原 试 管 上 样 ， 无 需 倒 管 。 全 封 闭 反 应 舱 ， 有 效 减 少 外 界 环 境 干 扰 和 污 染 全 中 文 软 件 ， 图 标 式 界 面 ， 操 作 更 简 便 综 合 测 试 成 本 低 管 式 、 微 粒 子 包 被 技 术 ， 反 应 速

10、度 更 快 ， 结 果 更 准 确 。v ELISA法 检 测 乙 肝 表 面 抗 原 、 梅 毒 、 艾 滋 、 丙 肝 按 照 2010年 药典 规 定 反 应 时 间 至 少 要 2小 时 30分 钟 ； 而 全 自 动 微 粒 子 化 学 发 光试 剂 则 不 到 30分 钟 即 可 完 成 。v 稳 定 性 更 好v 特 异 性 更 好 大 部 分 国 际 一 流 厂 家 也 都 采 用 直 接 发 光 法 ： 罗 氏西 门 子雅 培. 传 染 病 试 剂 传 统 酶 免 法 和 微 粒 子 化 学 发 光 法 对 比方 法 学项 目 传 统 酶 免 法 微 粒 子 发 光 法分 析

11、 敏 感 度 特 异 性 精 密 度 分 析 敏 感 度 特 异 性 精 密 度HBsAg adr 0.1IU/mLadw 0.1IU/mLay 0.2IU/mL (-/-)20/20(+/+)3/3 13.21% adr 0.1IU/mLadw 0.1IU/mLay 0.2IU/mL (-/-)20/20(+/+)3/3 8.03%HBsAb 10 mIU/mL (-/-)20/20 12.05% 10 mIU/mL (-/-)20/20 7.45%HBeAg 1 # 1:642# 1:1283# 1:32 (-/-)15/15(+/+)9/10 12.04% 1# 1:642# 1:128

12、3# 1:32 (-/-)15/15(+/+)10/10 8.03%HBeAb 1# 1:322# 1:643# 1:64 (-/-)15/15(+/+)9/10 12.31% 1# 1:322# 1:643# 1:64 (-/-)15/15(+/+)10/10 8.20%HBcAb 1# 1:1282 # 1:1283# 1:256 (-/-)15/15(+/+)14/15 14.03% 1# 1:1282# 1:1283# 1:256 (-/-)15/15(+/+)15/15 10.34%HCV L1、 L2阳 性 ，L3阴 性 ， L4阴 性 (-/-)29/30(+/+)29/30 1

13、0.05% L1、 L2阳 性L3阳 性 ， L4阴 性 (-/-)30/30(+/+)30/30 7%HIV S1, S2阴 性 ,S3,S4,S5,S6阳 性 (-/-)18/20(+/+)20/20 14.34% S1阴 性 , S2,S3,S4,S5,S6阳 性 (-/-)20/20(+/+)20/20 10%TP L1、 L2阳 性 ，L3阴 性 ， L4阴 性 (-/-)20/20(+/+)10/10 11.26% L1、 L2阳 性L3阳 性 ， L4阴 性 (-/-)20/20(+/+)10/10 7.98% 参 比 试 剂 ： 雅 培 I2000乙 肝 灵 敏 度 特 异 性

14、 符 合 率HBsAg 97.92% 100% 99.78%Anti-HBs 95.98% 97.38% 96.69%hiv 95.24% 100% 99.59%Anti-HBe 90.77% 97.21% 95.36%Anti-HBc 91.54% 98.9% 94.48%试 剂 性 能 多 中 心 临 床 评 估 （ 乙 肝 ） 免疫测定试剂的关键点v作为免疫反应，抗原抗体的选择是整个免疫分析特异性和总体表现的关键如何选择好一个抗体(单克隆或多克隆)去检测一个被检物质，而不与非常相似结构的其它代谢产物有交叉反应,或着是一些没有临床意义的分解产物等，这是分析设计的重点中之重点。批内、批间的分

15、析重现性。 AFP HBsAg4.50%1.79% 4.91%2.14% HCV 1 2 3 4 5 Mean SD CV批 内 86.11 86.36 88.40 87.90 86.43 86.27 1.55 1.79%批 间 74.59 73.63 69.64 71.90 71.96 71.01 3.20 4.50%HBsAg 1 2 3 4 5 Mean SD CV批 内 72.59 71.25 76.50 75.05 78.03 76.61 1.64 2.14%批 间 0.22 0.22 0.23 0.22 0.23 0.23 0.01 4.91%批 内批 间微 粒 子 化 学 发 光

16、 试 剂 的 精 密 度 相 关 性 相 关 系 数 线 性 系 数HIV 显 著 相 关 0.99 0.98HCV 显 著 相 关 0.93 0.99参 比 试 剂 ： 雅 培 试 剂 性 能 多 中 心 临 床 评 估 相 关 性 相 关 系 数 线 性 系 数HIV 显 著 相 关 0.97 0.92HBsAg 显 著 相 关 0.96 0.95N=500，参 比 试 剂 ： 雅 培 I2000 试 剂 性 能 多 中 心 临 床 评 估 丙 型 肝 炎 抗 体 诊 断 试 剂丙 肝 病 毒 复 杂 的 基 因 结 构 ： 决 定 了 抗 体 谱 的 差 异 ， 从 而 为 丙 肝 抗

17、体 检 测 敏 感 度 的 提 高 带 来 了 困 难 。 丙 肝 诊 断 试 剂 目 前 存 在 的 问 题v1、 灰 区 标 本 的 困 惑v2、 阳 性 标 本 的 漏 检 问 题 形 成 的 技 术 原 因 -灰 区 的 形 成1、 重 组 抗 原 的 原 因 （ 1） 融 合 蛋 白 （ 2） 大 肠 杆 菌 杂 蛋 白2、 第 二 抗 体 的 非 特 异 反 应 （ 1） 酶 标 抗 体 对 固 相 载 体 的 直 接 吸 附 酶 标 二 抗 对 于 丙 肝 抗 体 是 非 特 异 的 ， 和 各 种 人 IgG均 能 反 应结 合 。 （ 2） 个 别 标 本 中 IgG浓 度

18、过 高 多 聚 体 的 混 合 ： E-E、 E-Ab、 E-Ab-E、 E-Ab-E-Ab ， 既引 起 本 底 背 景 ， 又 阻 遏 抗 原 抗 体 反 应 问 题 形 成 的 技 术 原 因 -阳 性 标 本 的 漏 检1、 关 于 灵 敏 度 的 两 个 概 念 （ 1） 分 析 灵 敏 度 决 定 因 素 ： a.单 个 抗 原 决 定 族 的 抗 原 性 强 弱 。 b.试 剂 盒 的 信 号 放 大 能 力 （ 2） 流 行 病 学 敏 感 度 决 定 因 素 ： a.抗 原 片 段 的 种 类 是 否 齐 全 。 b.是 否 含 构 像 抗 原 。 c.分 析 灵 敏 度 的

19、 高 低 。 C E1E2/NS1 NS2 NS3 NS4a NS4b NS5a NS5b丙型肝炎病毒的基因结构ELISA-1st RIBA-1stELISA-2stRIBA-2stELISA-3stRIBA-3 st C22-3C22-3 NS5NS5C100C100 5-1-1C33C C100C33C C100 5-1-1C33CC33C C100C100 5-1-1 2、 抗 原 片 段 种 类 不 全 3、 包 涵 体 抗 原 ， 抗 原 性 弱4、 缺 乏 构 像 表 位5、 原 核 表 达 分 子 量 小 ， 抗 原 表 位 有 限6、 抗 原 非 糖 基 化 ， 稳 定 性 差

20、7、 信 号 放 大 能 力 有 限8、 固 相 载 体 形 成 的 空 间 位 阻问 题 形 成 的 技 术 原 因 -阳 性 标 本 的 漏 检 新 型 丙 肝 化 学 发 光 试 剂 的 关 键 技 术1、 包 被 和 标 记 实 现 双 特 异 ， 以 降 低 假 阳 性率 ， 并 提 高 分 析 敏 感 度 。2、 通 过 整 体 系 统 优 化 ， 进 一 步 扩 大 阴 阳 反差 ， 使 结 果 判 读 泾 渭 分 明 。 新 型 丙 肝 化 学 发 光 试 剂 技 术 策 略 -灰 区 的 解 决1、 酵 母 真 核 表 达 抗 原 ， 高 效 减 少 灰 区 标 本 eg:

21、E.coli与 Pichia pastoris 检 测国 标 国 标 品表 达 载 体 N2 N4 N24 P1 P5 P21大 肠 杆 菌（ 原 核 表 达 ） 0.260 0.149 0.235 0.742 2.659 0.706毕 赫 酵 母 （ 真 核 表 达 ） 0.060 0.014 0.017 1.736 2.833 1.619 Anti HCV重 组 NS3 抗 原v NS3 HCV病 毒 的 最 重 要 的 抗 原v 通 过 酵 母 真 核 系 统 成 功 的 表 达 NS3抗 原 , 多 重 折 叠 以 达 到 高 度 的 免 疫 活 性 v 高 纯 度 ; 易 于 直 接

22、 标 记 2、 针 对 Fab端 的 单 特 异 性 抗 体 标 记 物一 般 二 抗 和 单 特 异 抗 体 的 对 比 国 标二 抗 类 型 P27 L3 N2 N4 N18 N24 L4一 般 单 抗 0.560 0.160 0.230 0.162 0.071 0.214 0.065单 特 异 抗 体 0.892 0.321 0.065 0.043 0.014 0.102 0.009 3、 板 式 固 相 载 体 升 级 为 管 式 磁 微 粒 子 包 被 包 被 量 更 富 足 管 式 液 相 反 应 更 充 分 更 有 效 的 解 决 空 间 位 阻 效 应 4、 光 信 号 检 测

23、 ， 提 高 信 噪 比 信 号 放 大 代 替 靶 标 放 大 ， 减 少 靶 标 放 大 带 来 的 非 特 异 性反 应 ， 远 远 大 于 ELISA的 信 噪 比 。 新 型 丙 肝 化 学 发 光 试 剂 -降 低 漏 检 率1、 在 CORE、 NS3、 NS4、 NS5的 基 础 上 增 加 了 E1区， 保 证 抗 原 片 段 的 齐 全2、 pichia pastoris表 达 系 统 带 来 以 下 优 势 （ 1） 非 包 涵 体 而 可 溶 性 表 达 ， 抗 原 性 强 （ 2） 因 糖 基 化 而 提 高 稳 定 性 （ 3） 分 子 量 大 ， 抗 原 表 位

24、丰 富 （ 4） 具 有 构 像 抗 原 表 位 ， 而 提 高 检 出 率3、 磁 微 粒 子 标 记 抗 原 增 加 抗 原 抗 体 的 反 应 强 度 新 型 丙 肝 化 学 发 光 试 剂检 测 国 家 参 考 品 符 合 率 对 比方 法 学 阳 性 符 合 率 阴 性 符 合 率 最 低 减 出 限ELISA 30/30 29/30 3/4CLIA 30/30 30/30 3/4 新 型 双 特 异 丙 肝 化 学 发 光 诊 断 试 剂临 床 验 证 报 告方 法 学 真 阳 性 检 出 率 假 阳 性 率酶 免 试 剂 146/150 19/2000新 型 双 特 异 150/

25、150 3/2000 丙 肝 化 学 发 光 试 剂 临 床 对 比 试 验 报 告对 照 试 剂 ： 雅 培 I2000SR试 验 单 位 ： 包 头 市 中 心 医 院雅 培 总 计阳 性 阴 性威高 阳性 4 0 4阴 性 1 13 14总 计 5 13 18 NO。 雅 培CUTOFF = 18000 威 高CUTOFF = 5040RLU s co RLU s co1 720 0.04 1597 0.3172 2520 0.14 2072 0.4113 1800 0.1 1749 0.3474 1260 0.07 1723 0.3425 1440 0.08 1875 0.3726 1

26、800 0.10 1879 0.3737 2160 0.12 2313 0.4598 540 0.03 1512 0.3009 900 0.05 1617 0.32110 720 0.04 1602 0.31811 1080 0.06 1839 0.36512 540 0.03 1522 0.30213 720 0.04 1617 0.32114 34020 1.89 3941 0.78215 226440 12.58 222006 44.04916 34020 1.89 226548 44.9517 226440 12.58 54886 10.8918 138240 7.68 118238

27、23.46RIBA试 验 结 果 ： 阴 性 。 定 性 检 测 项 目 结 果 判 读 -有 反 应 性 和 无 反 应 性v 定 性 项 目 一 般 以 阴 阳 性 作 为 结 果 判 断 的 基 础 。v 阴 阳 性 判 读 基 于 量 化 的 结 果 ， 主 观 进 行 阴 阳 性 的 定 义 。v 真 正 的 确 认 的 阴 阳 性 需 要 通 过 金 标 准 测 量 方 法 才 能 确 证 。v HCV的 确 证 实 验 RIBA（ 重 组 免 疫 印 迹 法 ）v HIV的 确 证 实 验 Western-Blot（ 蛋 白 质 印 迹 法 ）v 感 染 初 期 ， 可 能 使

28、用 确 证 实 验 也 无 法 得 出 准 确 的 阴 阳 性 结 论 。v 检 验 方 法 的 局 限 性 ， 使 用 有 反 应 性 和 无 反 应 性 来 评 估 该 样 本 针 对 该 检测 方 法 的 检 测 结 果 。v 半 定 量 检 测 ， 通 过 病 员 的 动 态 随 访 ， 相 隔 一 定 时 间 再 行 检 测 ， 可 通 过S/CO值 的 变 化 程 度 来 进 行 确 证 。 高 特 异u 经 典 免 疫 学 原 理 ， 单 克 隆 抗 体 技 术u 大 分 子 采 用 夹 心 法 分 析u 小 分 子 采 用 竞 争 法 分 析u 专 利 的 磁 性 分 离 技

29、术 高 灵 敏u 采 用 最 灵 敏 、 最 稳 定 的 直 接 发 光 级 联 放 大 系 统u 采 用 最 持 久 最 稳 定 的 发 光 剂 ABEI u 采 用 磁 性 微 粒 子 技 术 ， 扩 大 包 被 面 积 高 稳 定u 发 光 信 号 稳 定 ， 持 续u 高 质 量 试 剂 , 无 需 预 处 理u 稳 定 ， 持 久 的 标 准 曲 线 ， 有 效 期 长u 机 上 试 剂 冷 藏 系 统 ， 试 剂 有 效 期 长u 胶 膜 试 剂 盒 ， 确 保 试 剂 稳 定 高 准 确u 超 灵 敏 光 电 倍 增 管 检 测 发 光 信 号u 发 光 3秒 内 完 成 ， 原 位 检 测u 泉 涌 式 内 外 壁 清 洗 系 统 ， 严 格 防 止 交 叉 污 染 (1ppm) v降 低 诊 断 成 本 ， 惠 及 民 生v全 自 动 操 作 ， 重 复 性 好 ， 易 于 标 准 化v高 特 异 性 、 高 灵 敏 度 ， 避 免 漏 检 误 诊小 结全 自 动 微 粒 子 化 学 发 光 检 测 优 势 谢 谢