罗格列酮对髂动脉球囊损伤兔血管内皮的保护作用

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1、罗格列酮对髂动脉球囊损伤兔罗格列酮对髂动脉球囊损伤兔血管内皮的保护作用血管内皮的保护作用广州军区武汉总医院心内科广州军区武汉总医院心内科丁世芳丁世芳 曹选超曹选超 卢青卢青 研究背景研究背景经皮冠状动脉腔内成形术经皮冠状动脉腔内成形术经皮冠状动脉腔内成形术经皮冠状动脉腔内成形术（percutaneouspercutaneous transluminaltransluminal coronary angioplasty coronary angioplasty，PTCAPTCA）SMCSMC过度增殖迁移过度增殖迁移血管内皮损伤血管内皮损伤血管负性重塑血管负性重塑炎症细胞激活炎症细胞激活血管弹性回

2、缩血管弹性回缩血栓形成、机化血栓形成、机化再狭窄再狭窄 影响影响PTCAPTCA术后再狭窄术后再狭窄重要因素重要因素n n血管内皮损伤血管内皮损伤n n平滑肌细胞的过度增殖、迁移平滑肌细胞的过度增殖、迁移脂肪组织：内分泌器官？脂肪组织：内分泌器官？n n分泌多种物质，如纤溶酶原激活物抑制物分泌多种物质，如纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)1(PAI-1)、瘦素、肿瘤坏死因子、瘦素、肿瘤坏死因子-a-a、抵抗、抵抗素及脂联素素及脂联素(adiponectinadiponectin，APN)APN)等等n n改善胰岛素抵抗改善胰岛素抵抗、调节脂肪代谢调节脂肪代谢、防止动脉防止动脉粥样硬化等方面

3、有着重要作用粥样硬化等方面有着重要作用n n脂联素也被称为脂联素也被称为apM1apM1、Acrp30Acrp30或或AdipoQAdipoQ，是一种脂肪细胞特异的细胞因子是一种脂肪细胞特异的细胞因子脂联素脂联素(adiponectinadiponectinadiponectinadiponectin APN)APN)APN)APN)生物学作用生物学作用抗抗抗抗ASAS抗炎抗炎抗炎抗炎抗氧化抗氧化抗氧化抗氧化胰岛素增敏胰岛素增敏胰岛素增敏胰岛素增敏n n噻唑烷二酮类噻唑烷二酮类(TZDsTZDs)药物是高选择性过药物是高选择性过氧化物酶体增殖物激活受体（氧化物酶体增殖物激活受体（PPARPPA

4、R）激动剂，是治疗激动剂，是治疗2 2型糖尿病的一类新药型糖尿病的一类新药n n该类药物与体内受体结合后激活，从而该类药物与体内受体结合后激活，从而改善改善2 2型糖尿病患者的胰岛素抵抗、高型糖尿病患者的胰岛素抵抗、高胰岛素血症和高糖血症代谢紊乱胰岛素血症和高糖血症代谢紊乱 n n罗格列酮就是其中有代表性的一种罗格列酮就是其中有代表性的一种n n改善改善2 2型糖尿病患者的胰岛素抵抗型糖尿病患者的胰岛素抵抗、改善改善高胰岛素血症和高糖血症代谢紊乱高胰岛素血症和高糖血症代谢紊乱n n调节脂质代谢紊乱调节脂质代谢紊乱n n抑制过度的炎症反应抑制过度的炎症反应n n抗动脉粥样硬化抗动脉粥样硬化 n

5、n肾脏保护作用肾脏保护作用研究目的研究目的 罗格列酮罗格列酮 (ROS)脂联素脂联素 (APN)内膜增殖内膜增殖 再狭窄再狭窄（RS）实验设计罗格列酮对髂动脉球囊损伤兔罗格列酮对髂动脉球囊损伤兔罗格列酮对髂动脉球囊损伤兔罗格列酮对髂动脉球囊损伤兔血管内皮的保护作用血管内皮的保护作用血管内皮的保护作用血管内皮的保护作用随随机机分分组组模模型型制制备备血血清清学学指指标标病病理理形形态态学学研究内容研究内容1.1.实验动物及分组实验动物及分组手术对照组手术对照组1仅行右侧股动仅行右侧股动脉结扎术，普脉结扎术，普通饮食喂养通饮食喂养2高脂饮食喂养高脂饮食喂养8 8周后，行右周后，行右侧髂动脉球囊侧髂

6、动脉球囊内膜剥脱术内膜剥脱术模型组模型组3高脂饮食高脂饮食8 8周周+右侧髂动脉右侧髂动脉球囊内膜剥脱球囊内膜剥脱术术+术前术前3 3天罗天罗格列酮（格列酮（2mg 2mg 1/1/日）日）罗格列酮组罗格列酮组2.2.兔腹兔腹-髂动脉血管内膜损伤模型制作髂动脉血管内膜损伤模型制作 麻醉麻醉麻醉麻醉速麻安肌肉注射速麻安肌肉注射速麻安肌肉注射速麻安肌肉注射 右侧膝上大腿内侧股右侧膝上大腿内侧股右侧膝上大腿内侧股右侧膝上大腿内侧股动脉搏动最明显处纵行切动脉搏动最明显处纵行切动脉搏动最明显处纵行切动脉搏动最明显处纵行切开皮肤，钝性分离皮下组开皮肤，钝性分离皮下组开皮肤，钝性分离皮下组开皮肤，钝性分离皮

7、下组织及肌肉织及肌肉织及肌肉织及肌肉 股动脉、股静脉、股神经游离完毕股动脉、股静脉、股神经游离完毕股动脉远端股动脉远端股动脉远端股动脉远端结扎结扎结扎结扎，近端用无创血管，近端用无创血管，近端用无创血管，近端用无创血管夹暂时夹闭阻断血流夹暂时夹闭阻断血流夹暂时夹闭阻断血流夹暂时夹闭阻断血流n n用眼科剪在结扎动脉上方作一个用眼科剪在结扎动脉上方作一个用眼科剪在结扎动脉上方作一个用眼科剪在结扎动脉上方作一个45454545度切口，直接度切口，直接度切口，直接度切口，直接插入冠脉球囊导管，深度约插入冠脉球囊导管，深度约插入冠脉球囊导管，深度约插入冠脉球囊导管，深度约12-15cm12-15cm12

8、-15cm12-15cm，达髂动脉分，达髂动脉分，达髂动脉分，达髂动脉分叉水平叉水平叉水平叉水平n n以以以以6 6 6 68 8 8 8个大气压充盈动脉球囊，将充气球囊沿髂个大气压充盈动脉球囊，将充气球囊沿髂个大气压充盈动脉球囊，将充气球囊沿髂个大气压充盈动脉球囊，将充气球囊沿髂动脉上下牵拉动脉上下牵拉动脉上下牵拉动脉上下牵拉5-8cm5-8cm5-8cm5-8cm至股动脉近端，反复至股动脉近端，反复至股动脉近端，反复至股动脉近端，反复3 3 3 3次，充次，充次，充次，充分剥离髂动脉内膜分剥离髂动脉内膜分剥离髂动脉内膜分剥离髂动脉内膜n n术后以医用活力碘消毒手术伤口，肌注青霉素术后以医用

9、活力碘消毒手术伤口，肌注青霉素术后以医用活力碘消毒手术伤口，肌注青霉素术后以医用活力碘消毒手术伤口，肌注青霉素80808080万单位抗感染，连续万单位抗感染，连续万单位抗感染，连续万单位抗感染，连续3 3 3 3天天天天模型制备所用的球囊和压力泵模型制备所用的球囊和压力泵 3.3.血生化标本的采集和测定血生化标本的采集和测定 于实验初和术后于实验初和术后于实验初和术后于实验初和术后1 1 1 1、4 4 4 4周末采测血糖（周末采测血糖（周末采测血糖（周末采测血糖（FPGFPGFPGFPG）、）、）、）、总胆固醇总胆固醇总胆固醇总胆固醇(TC)(TC)(TC)(TC)、甘油三酯、甘油三酯、甘油

10、三酯、甘油三酯 (TG)(TG)(TG)(TG)、高密度脂蛋白胆、高密度脂蛋白胆、高密度脂蛋白胆、高密度脂蛋白胆固醇固醇固醇固醇 (HDL-C)(HDL-C)(HDL-C)(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇低密度脂蛋白胆固醇低密度脂蛋白胆固醇低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)(LDL-C)(LDL-C)(LDL-C)和和和和超敏超敏超敏超敏C C C C反应蛋白（反应蛋白（反应蛋白（反应蛋白（hshshshs-CRP-CRP-CRP-CRP）的含量）的含量）的含量）的含量 ELISAELISAELISAELISA法测定血浆中脂联素的表达水平法测定血浆中脂联素的表达水平法测定血浆中脂联素的表达水

11、平法测定血浆中脂联素的表达水平4.4.病理形态学观察病理形态学观察 术后术后术后术后1 1 1 1、4 4 4 4周末处死各组动物，游离腹主动脉并周末处死各组动物，游离腹主动脉并周末处死各组动物，游离腹主动脉并周末处死各组动物，游离腹主动脉并逆行分离至髂总动脉和股动脉，以左、右髂动脉逆行分离至髂总动脉和股动脉，以左、右髂动脉逆行分离至髂总动脉和股动脉，以左、右髂动脉逆行分离至髂总动脉和股动脉，以左、右髂动脉分叉点为参照，依次留取病理标本各分叉点为参照，依次留取病理标本各分叉点为参照，依次留取病理标本各分叉点为参照，依次留取病理标本各1 1 1 12 cm2 cm2 cm2 cm，固，固，固，固

12、定切片，分组编号定切片，分组编号定切片，分组编号定切片，分组编号 HEHEHEHE染色及弹力纤维染色观察受损血管组织形态染色及弹力纤维染色观察受损血管组织形态染色及弹力纤维染色观察受损血管组织形态染色及弹力纤维染色观察受损血管组织形态学改变，利用图像分析软件，进行新生内膜面积、学改变，利用图像分析软件，进行新生内膜面积、学改变，利用图像分析软件，进行新生内膜面积、学改变，利用图像分析软件，进行新生内膜面积、中膜面积及内膜增殖指数等分析中膜面积及内膜增殖指数等分析中膜面积及内膜增殖指数等分析中膜面积及内膜增殖指数等分析5.5.免疫组化及细胞凋亡检测免疫组化及细胞凋亡检测免疫组化（免疫组化（免疫组

13、化（免疫组化（SABCSABCSABCSABC法）法）法）法）烤片，脱蜡，水化烤片，脱蜡，水化烤片，脱蜡，水化烤片，脱蜡，水化 封闭内源性过氧化物酶封闭内源性过氧化物酶封闭内源性过氧化物酶封闭内源性过氧化物酶 热修复抗原热修复抗原热修复抗原热修复抗原 BSABSA封闭封闭封闭封闭 滴加一抗滴加一抗滴加一抗滴加一抗 滴加二抗滴加二抗滴加二抗滴加二抗 滴加滴加滴加滴加SABC SABC DABDAB显色显色显色显色 苏木素复苏木素复苏木素复苏木素复染染染染脱水，透明，封固脱水，透明，封固脱水，透明，封固脱水，透明，封固阳性表达分析：每份标本分别选取阳性表达分析：每份标本分别选取阳性表达分析：每份标

14、本分别选取阳性表达分析：每份标本分别选取5 5个高倍视野（个高倍视野（个高倍视野（个高倍视野（400400倍），染色完倍），染色完倍），染色完倍），染色完成后在光镜下观察结果，以细胞浆内棕黄色粗大颗粒为阳性。成后在光镜下观察结果，以细胞浆内棕黄色粗大颗粒为阳性。成后在光镜下观察结果，以细胞浆内棕黄色粗大颗粒为阳性。成后在光镜下观察结果，以细胞浆内棕黄色粗大颗粒为阳性。HPAIS 1000HPAIS 1000高清晰度彩色病理图像分析系统采集图像，高清晰度彩色病理图像分析系统采集图像，高清晰度彩色病理图像分析系统采集图像，高清晰度彩色病理图像分析系统采集图像，Image-Pro Plus vers

15、ion 6.0Image-Pro Plus version 6.0软件对图像进行分析。软件对图像进行分析。软件对图像进行分析。软件对图像进行分析。细胞凋亡检测（细胞凋亡检测（TUNELTUNEL法）法）19烤片，脱蜡，水化烤片，脱蜡，水化烤片，脱蜡，水化烤片，脱蜡，水化 封闭内源性过氧化物酶封闭内源性过氧化物酶封闭内源性过氧化物酶封闭内源性过氧化物酶 蛋白酶消化蛋白酶消化蛋白酶消化蛋白酶消化 标记标记标记标记缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 滴加生物素化地高辛抗体滴加生物素化地高辛抗体滴加生物素化地高辛抗体滴加生物素化地高辛抗体 滴加滴加滴加滴加SABC SABC DABDAB显色显色显色显色 苏苏苏

16、苏木素复染木素复染木素复染木素复染脱水，透明，封固脱水，透明，封固脱水，透明，封固脱水，透明，封固阳性表达分析：每份标本分别选取阳性表达分析：每份标本分别选取阳性表达分析：每份标本分别选取阳性表达分析：每份标本分别选取5 5个高倍视野（个高倍视野（个高倍视野（个高倍视野（400400倍），染色完倍），染色完倍），染色完倍），染色完成后在光镜下观察结果，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。成后在光镜下观察结果，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。成后在光镜下观察结果，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。成后在光镜下观察结果，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。计算细胞凋亡的阳性率计算细胞凋亡的阳性率计算

17、细胞凋亡的阳性率计算细胞凋亡的阳性率=（阳性细胞数（阳性细胞数（阳性细胞数（阳性细胞数/观察细胞总数）观察细胞总数）观察细胞总数）观察细胞总数）100%100%6.6.统计分析统计分析 以以以以SPSS 13.0SPSS 13.0SPSS 13.0SPSS 13.0统计软件包进行分析，计量资料统计软件包进行分析，计量资料统计软件包进行分析，计量资料统计软件包进行分析，计量资料用均数用均数用均数用均数标准差表示，两组资料间的比较采用标准差表示，两组资料间的比较采用标准差表示，两组资料间的比较采用标准差表示，两组资料间的比较采用t t t t检检检检验，多组间差异的显著性比较用方差分析，验，多组间

18、差异的显著性比较用方差分析，验，多组间差异的显著性比较用方差分析，验，多组间差异的显著性比较用方差分析，P0.05P0.05P0.05P0.05有统计学意义有统计学意义有统计学意义有统计学意义 制表、摄片描述实验结果制表、摄片描述实验结果制表、摄片描述实验结果制表、摄片描述实验结果组别组别组别组别时间时间时间时间FPGFPGTCTCTGTG HDL-CHDL-CLDL-CLDL-C正常正常对对照照组组08.440.401.430.090.090.730.130.130.910.140.140.710.080.0818.290.340.341.370.630.630.690.130.130.86

19、0.160.160.680.340.3448.260.450.451.410.290.290.740.140.140.880.130.130.740.090.09模型模型组组08.410.460.461.380.070.070.810.200.200.920.150.150.690.090.0918.330.420.4228.711.721.72b b1.080.250.25b b0.870.140.1418.320.920.92b b48.310.190.1927.624.834.83b b1.210.170.17b b0.900.140.1419.271.261.26b b罗罗格列格列酮组

20、酮组08.560.430.431.420.100.100.780.110.110.850.120.120.730.100.1018.410.170.1719.751.661.66bdbd0.890.140.14acac0.830.090.098.340.580.58bdbd48.370.260.2618.522.132.13bdbd0.840.060.06d d0.870.120.127.580.710.71bdbd1.1.罗格列酮对血脂、血糖及罗格列酮对血脂、血糖及APNAPN表达的影响表达的影响实验结果实验结果 各组不同时间点各组不同时间点各组不同时间点各组不同时间点APNAPN水平的比较

21、水平的比较水平的比较水平的比较 （ugug/ml/ml）手术对照组手术对照组模型组模型组罗格列酮组罗格列酮组2.292.322.352.371.441.622.351.171.85 各组不同时间点各组不同时间点各组不同时间点各组不同时间点hshs-CRP-CRP水平的比较水平的比较水平的比较水平的比较 (mg/l)(mg/l)手术对照组手术对照组模型组模型组罗格列酮组罗格列酮组1.72 1.691.741.754.874.321.676.393.272.2.病理形态学改变病理形态学改变HEHE染色结果（术后染色结果（术后染色结果（术后染色结果（术后4 4周末）周末）周末）周末）对照组对照组对照

22、组对照组 100100模型组模型组模型组模型组 100100罗格列酮罗格列酮罗格列酮罗格列酮 100100弹力纤维染色结果（术后弹力纤维染色结果（术后弹力纤维染色结果（术后弹力纤维染色结果（术后4 4周末）周末）周末）周末）3.3.免疫组化染色结果免疫组化染色结果 对照组对照组对照组对照组400400 模型组模型组模型组模型组400 400 罗格列酮罗格列酮罗格列酮罗格列酮400400 PCNAPCNA免疫组化结果（术后免疫组化结果（术后免疫组化结果（术后免疫组化结果（术后1 1周末）周末）周末）周末）手术对照组手术对照组模型组模型组罗格列酮组罗格列酮组各组髂动脉标本细胞凋亡检测结果各组髂动脉

23、标本细胞凋亡检测结果各组髂动脉标本细胞凋亡检测结果各组髂动脉标本细胞凋亡检测结果1.3621.8436.251.4018.6424.79结论结论1.1.高胆固醇饮食加髂动脉球囊内膜损伤的方法可以较高胆固醇饮食加髂动脉球囊内膜损伤的方法可以较高胆固醇饮食加髂动脉球囊内膜损伤的方法可以较高胆固醇饮食加髂动脉球囊内膜损伤的方法可以较好的模拟血管再狭窄的病理生理过程好的模拟血管再狭窄的病理生理过程好的模拟血管再狭窄的病理生理过程好的模拟血管再狭窄的病理生理过程2.2.高脂饮食加球囊损伤后血浆高脂饮食加球囊损伤后血浆高脂饮食加球囊损伤后血浆高脂饮食加球囊损伤后血浆APNAPN水平明显减低，水平明显减低，

24、水平明显减低，水平明显减低，且与内膜增殖程度呈明显负相关；罗格列酮干预后且与内膜增殖程度呈明显负相关；罗格列酮干预后且与内膜增殖程度呈明显负相关；罗格列酮干预后且与内膜增殖程度呈明显负相关；罗格列酮干预后APNAPN水平明显升高，血管管腔狭窄程度亦相应减轻水平明显升高，血管管腔狭窄程度亦相应减轻水平明显升高，血管管腔狭窄程度亦相应减轻水平明显升高，血管管腔狭窄程度亦相应减轻3.3.罗格列酮可有效抑制血管损伤后内膜平滑肌细胞的罗格列酮可有效抑制血管损伤后内膜平滑肌细胞的罗格列酮可有效抑制血管损伤后内膜平滑肌细胞的罗格列酮可有效抑制血管损伤后内膜平滑肌细胞的增殖并促进其凋亡，调节血脂代谢紊乱，其机

25、制可增殖并促进其凋亡，调节血脂代谢紊乱，其机制可增殖并促进其凋亡，调节血脂代谢紊乱，其机制可增殖并促进其凋亡，调节血脂代谢紊乱，其机制可能与通过能与通过能与通过能与通过PPARPPAR途径增加途径增加途径增加途径增加APNAPN的表达水平有关的表达水平有关的表达水平有关的表达水平有关实验的不足实验的不足 本研究的不足之处：本研究的不足之处：n n 每组动物例数有限每组动物例数有限每组动物例数有限每组动物例数有限n n 未从分子层面进行未从分子层面进行未从分子层面进行未从分子层面进行APNAPN作用机理的深入研究作用机理的深入研究作用机理的深入研究作用机理的深入研究n n 某些指标不够新某些指标不够新某些指标不够新某些指标不够新n n如果能行二次球囊损伤并通过造影剂显影则效果如果能行二次球囊损伤并通过造影剂显影则效果如果能行二次球囊损伤并通过造影剂显影则效果如果能行二次球囊损伤并通过造影剂显影则效果更好更好更好更好