布鲁氏菌实验室检验

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1、布 鲁 氏 菌 病 原 学 、 血 清 学 诊 断 主 要 内 容 ：1、 布 鲁 氏 菌 病 原 学 ；2、 布 鲁 氏 菌 诊 断 标 准 ；3、 布 鲁 氏 菌 血 清 学 实 验 的 几 种 方 法 。 （ 一 ） 布 氏 菌 概 述 1887年 英 国 医 生 布 鲁 氏 首 先 从 死 于 “ 马 尔 他 热 ” 的 英国 士 兵 脾 脏 中 分 离 出 羊 种 布 氏 菌 后 ， 布 鲁 氏 菌 属（ Brucella)， 包 括 6个 种 19个 生 物 型 。 羊 种 布 氏 菌 （ Br melitensis) 牛 种 布 氏 菌 （ Br abortus) 猪 种 布 氏

2、 菌 （ Br suis) 沙 漠 森 林 野 鼠 种 布 氏 菌 （ Br neotomae) 绵 羊 附 睾 种 布 氏 菌 （ Br ovis) 犬 种 布 氏 菌 （ Br canis) 布 鲁 氏 菌 的 发 展 史年 份 菌 名 发 现 人 国 家 宿 主1887 羊 种 菌 Bruce 马 尔 他 羊1897 牛 种 菌 Bang 丹 麦 牛1914 猪 种 菌 Traun 美 国 猪1953 绵 羊 附 睾 种 菌 Buadle 新 西 兰 公 绵 羊 1956 沙 漠 森 林 鼠 种 菌 Stoennen 美 国 沙 漠 森 林 野 鼠1966 犬 种 菌 Carmichae

3、l 美 国 小 猎 犬 （ 一 ） 病 原 学 概 述布 鲁 氏 菌 属 （ Brucella) 包 括 6个 种 19个 生 物 型 。 牛 种 布 氏 菌 （ Br abortus) ： 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 9型 羊 种 布 氏 菌 （ Br melitensis) ： 1、 2、 3型 猪 种 布 氏 菌 （ Br suis) ： 1、 2、 3、 4、 5型 沙 漠 森 林 野 鼠 种 布 氏 菌 （ Br neotomae) 绵 羊 附 睾 种 布 氏 菌 （ Br ovis) 犬 种 布 氏 菌 （ Br canis) 1、 形 态n 布 鲁 氏 菌 是 一

4、组 微 小 的 球 状 、 球 杆 状 、 短杆 状 细 菌 ；n 宽 约 0.3 0.5微 米 、 长 0.6 1.5微 米 。 电镜 下 见 到 的 羊 种 菌 为 明 显 的 球 杆 状 、 牛 种菌 和 猪 种 菌 为 短 杆 状 ；n 6种 布 鲁 氏 菌 靠 形 态 很 难 区 分 ， 一 般 来 说 ，羊 种 菌 最 小 ， 牛 种 菌 产 次 之 ， 猪 种 菌 较 大 ；n 布 鲁 氏 菌 没 有 鞭 毛 ， 不 形 成 芽 胞 和 夹 膜 。 2、 染 色n 涂 片 染 色 检 查 多 为 单 个 排 列 ， 少 见 成 对短 链 排 列 。n 布 鲁 氏 菌 可 被 碱

5、性 染 料 着 色 ；n 革 兰 染 色 阴 性 ；n 柯 兹 罗 夫 斯 基 提 出 用 0.5%沙 黄 水 溶 液 染色 ， 加 热 出 现 气 泡 ， 水 洗 后 用 0.5%孔 雀绿 或 1%美 兰 复 染 ， 布 鲁 氏 菌 呈 红 色 ， 其它 细 菌 呈 绿 色 和 兰 色 。 布 鲁 氏 菌 ： 革 兰 阴 性 ， 长 约 0.6-1.5m, 宽 约 0.3-0.6m, 用 柯 氏 染 色 染 成 红色 ,无 鞭 毛 、 不 形 成芽 胞 和 荚 膜 。 3、 培 养 特 性1.布 鲁 氏 菌 培 养 营 养 要 求 高 ： 需 要 各 种 氨 基 酸 和 各 种 金 属 离

6、子 ， 有 的 菌 种 需要 血 清 才 能 生 长 。2.生 长 缓 慢 ： 一 般 需 经 4 6天 ， 有 的 甚 至 21 30天 才 能 长 出 菌 落 。3.生 长 所 需 温 度 ： 20 40 ， 最 适 为 37 ,超 过42 则 不 生 长 。4. C02: 绵 羊 附 睾 种 菌 和 牛 种 菌 的 某 些 生 物 型 菌 需 严 格的 C0 2(5 10 )。 （ 4） 细 菌 变 异n 布 氏 菌 在 各 种 理 化 因 素 作 用 下 易 发 生 变 异 ;n 即 从 光 滑 型 （ S） 变 为 非 光 滑 型 粗 糙 (R)或 粘 液 (M)状 。n 变 异 菌

7、 落 常 比 光 滑 型 稍 长 ， 表 面 有 颗 粒 。菌 落 颜 色 为 灰 白 色 或 褐 色 ， （ 5） 抵 抗 力 n 布 氏 菌 在 合 适 条 件 下 能 生 存 很 长 时 间 ， 有较 高 的 抗 灭 活 能 力 。n 对 湿 热 、 紫 外 线 和 各 种 射 线 以 及 常 用 的 消毒 剂 、 抗 生 素 、 化 学 药 物 比 较 敏 感 ；n 对 低 温 和 干 燥 有 较 强 的 抵 抗 力 ， 故 可 用 冷冻 真 空 干 燥 法 保 存 菌 种 。 布 氏 菌 在 自 然 条 件 下 的 生 存 能 力自 然 条 件 生 存 时 间 （ 天 ） 自 然 条

8、 件 生 存 时 间 （ 天 ）水 50120 奶 油 2565尘 4120 奶 酪 2190粪 2172 冻 肉 1447畜 舍 墙 棚 4150 腌 肉 2045地 面 4150 培 养 基 60318 衣 服 3080 干 燥 胎 膜 120皮 毛 45120 腐 败 脏 器 死 亡鲜 牛 乳 2550 人 工 胃 液 2050 (1)对 物 理 因 子 的 抵 抗 力 物 理 因 子 对 布 氏 菌 的 影 响物 理 因 子 生 存 时 间 物 理 因 子 生 存 时 间湿 热 56 60分 钟 以 上 干 热 80 60分 钟 以 上湿 热 63 60分 钟 以 上 干 热 90 6

9、0分 钟 以 上湿 热 80 30分 钟 以 上 干 热 100 7分 钟 以 上湿 热 90 10分 钟 以 上 直 射 阳 光 1 4小 时湿 热 100 半 分 钟 死 亡 散 射 阳 光 7 8天 (2)对 化 学 因 子 的 抵 抗 力 化 学 因 子 对 布 氏 菌 的 影 响 药 物 名 称 浓 度 (%) 生 存 时 间 药 物 名 称 浓 度 (%) 生 存 时 间 新 洁 尔 灭 0.1 30秒 钟 漂 白 粉 0.2 2.5 2分 钟 以 内 石 炭 酸 1 2 1 5分 钟 红 汞 2 7分 钟 来 苏 儿 2 1 3分 钟 过 锰 酸 钾 0.1 0.2 7 15分

10、钟 来 苏 儿 3 1分 钟 以 内 甲 醛 0.2 20分 钟 以 上 氯 亚 明 0.2 5 7分 钟 乳 酸 0.5 1分 钟 以 内 氯 亚 明 0.5 3 5分 钟 氢 氧 化 钾 2 3分 钟 升 汞 0.05 1分 钟 以 内 肥 皂 2 20分 钟 以 上 主 要 化 学 药 品 对 三 型 菌 的 影 响 浓 度 布 鲁 氏 菌 生 存 时 间 (分 钟 ) 化 学 药 品 名 称 (%) 羊 型 牛 型 猪 型 石 碳 酸 1 5 3 5 石 碳 酸 2 1 2 1 来 苏 儿 2 3 1 3 来 苏 儿 3 瞬 间 瞬 间 瞬 间 漂 白 粉 澄 清 液 0.2 1-2

11、瞬 间 瞬 间 漂 白 粉 乳 剂 2.5 1-2 瞬 间 瞬 间 肥 皂 水 2 20 20 20 （ 二 ） 布 鲁 氏 菌 分 离 培 养n 采 用 何 种 方 法 、n 取 何 种 材 料 、n 何 种 培 养 基 n 实 验 室 条 件 布 氏 菌 的 分 离 培 养n 一 、 从 可 疑 病 人 分 离 布 氏 菌 n 血 培 养 ： 30天 未 培 养 出 菌 ， 可 定 位 阴 性 。 n 骨 髓 培 养 ： 抽 取 骨 髓 （ 接 种 双 相 培 养 基 ）n 尿 培 养 ：n 其 他 病 原 材 料 培 养 :乳 、 脑 脊 液 、 关 节 液和 滑 囊 液 分 离 布 氏

12、 菌 ， 参 照 血 培 养 观 察结 果 ， 15天 不 长 菌 定 为 阴 性 二 、 从 牲 畜 材 料 中 分 离 布 氏 菌 n 从 牲 畜 流 产 羔 检 菌 ： n 从 胎 衣 检 菌 ： n 从 阴 道 分 泌 物 检 菌 ： n 尿 液 检 菌 ：n 乳 汁 检 菌 ：n 脓 汁 检 菌 ： n 血 液 培 养 ： n 脏 器 检 菌 ： 我 国 出 菌 宿 主 及 材 料n 我 国 从 人 、 羊 、 牛 、 猪 、 犬 、 鹿 、 马 、 骆 驼 等 家 畜 及 黄羊 、 岩 羊 、 黄 鼠 、 黄 胸 鼠 等 野 生 动 物 检 出 布 氏 菌 。 从 牧区 水 塘 水

13、 和 羊 毛 中 也 检 出 过 布 氏 菌 。n 出 菌 材 料 有 血 液 、 关 节 液 、 滑 囊 液 、 骨 髓 、 脑 髓 液 、 胸液 、 淋 巴 结 、 乳 汁 、 脓 汁 、 胆 汁 、 尿 、 阴 道 分 泌 物 、 等20余 种 。 n 由 于 取 材 难 易 等 原 因 ， 人 多 由 血 液 、 关 节 液 、 滑 囊 液 、骨 髓 出 菌 ； 羊 多 由 流 产 羔 、 胎 盘 、 死 羔 检 出 菌 ； 牛 多 由流 产 犊 、 乳 汁 检 出 菌 ； 猪 多 由 流 产 仔 猪 、 胎 盘 出 菌 。 布 氏 菌 的 鉴 定 及 分 型 (一 )常 规 确 定

14、布 氏 菌 属 细 菌 的 方 法 n 菌 落 生 长 时 间 和 形 态 ;n 菌 体 形 态 和 染 色 ;n 布 氏 菌 血 清 凝 集 试 验 ;(二 )特 殊 方 法 ：n 1 细 菌 DNA鸟 嘌 呤 十 胞 嘧 啶 克 分 子 百 分 比(C+CMOL )的 测 定 ; n 2 布 氏 菌 DNA与 可 疑 菌 DNA杂 交 试 验 ;n 3 应 用 色 谱 技 术 鉴 定 布 氏 菌 ; 布 氏 菌 属 的 种 、 型 鉴 定 方 法 初 代 分 离 培 养 对 二 氧 化 碳 的 需 要 硫 化 氢 产 生 试 验 染 料 抑 菌 试 验 单 项 特 异 性 血 清 A、 M

15、、 R凝 集 试 验 粗 糙 型 （ R型 ） 血 清 凝 集 试 验 （ 玻 片 、 试 管 法 ） 噬 菌 体 裂 解 试 验 尿 素 酶 活 性 试 验 布 鲁 氏 菌 分 离 用 培 养 基n 血 清 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基n 胰 酶 大 豆 培 养 基n 土 豆 琼 脂 培 养 基n 胰 示 琼 脂n Albimi琼 脂 培 养 基n 肝 琼 脂 培 养 基n 土 豆 +10%马 血 清 培 养 基 效 果 最 好 SAT滴 度 与 培 养 阳 性 的 符 合 率 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 20 40 80 160 320 640 12

16、80 符 合 率 BSL 2： 实 验 室 设 施 (二 级 屏 障 ) 人 间 布 病 诊 断 方 法 和 判 定 标 准 1、 流 行 病 学 接 触 史 ： 密 切 接 触 家 畜 、 野 生 动 物 、 畜 产 品 、 布 鲁 氏 菌 培 养 物 等 或 生 活 在 疫 区 内 的 居 民 。 2、 临 床 症 状 和 体 征 :应 排 除 其 他 疑 似 疾 病 。 3、 实 验 检 查 ： 病 原 分 离 试 管 凝 集 试 验 补 体 结 合 试 验 抗 人 球 蛋 白 试 验参 考 ： （ 皮 内 变 态 反 应 试 验 、 虎 红 平 板 凝 集 试 验 ） 人 间 布 病

17、血 清 学 阳 性 判 定 标 准病 原 分 离 :检 出 布 鲁 氏 菌 ；试 管 凝 集 试 验 :1:100(+)及 以 上 为 阳 性 ；补 体 结 合 试 验 :1:10 (+)及 以 上 为 阳 性 ；抗 人 球 蛋 白 试 :1:400(+)及 以 上 为 阳 性 ； 人 间 布 病 诊 断 方 法 和 判 定 标 准 凡 具 备 1、 2和 第 3项 中 的 任 何 一 项 检查 阳 性 即 可 确 定 为 布 病 病 人 。 对 已 确 诊 的 慢 性 布 病 病 人 和 接 种 过菌 苗 的 人 ， 应 以 临 床 症 状 为 主 要 依据 ， 血 清 学 试 验 效 价

18、高 低 ， 皮 变 反应 仅 供 参 考 。 (1） 布 氏 菌 素 皮 内 变 态 反 应 试 验原 理 ： 当 机 体 受 布 氏 菌 抗 原 作 用 之 后 ， 导 致 T细 胞过 敏 。 致 敏 T细 胞 再 遇 到 相 同 抗 原 后 进 行 分 化 ，衍 变 ， 产 生 能 释 放 各 种 淋 巴 因 子 的 效 应 细 胞 ， 局部 的 皮 肤 变 态 反 应 就 是 各 种 淋 巴 因 子 综 合 作 用 的结 果 ， 是 一 种 迟 发 型 变 态 反 应 。注 意 ： 布 氏 菌 素 注 射 后 ， 不 会 使 人 感 染 布 病 ； 也 不 会导 致 常 规 检 测 的

19、抗 体 增 加 。器 材 及 试 剂 ： 布 氏 菌 素 、 酒 精 棉 球 ， 1ml注 射 器 ， 测 量 尺 皮 内 变 态 反 应 操 作 方 法1.每 次 注 射 前 必 须 详 细 询 问 职 业 、 健 康 情 况 曾 否接 种 过 布 氏 菌 活 菌 苗 等 。2.前 臂 掌 侧 中 部 皮 肤 用 75%酒 精 棉 球 消 毒 ， 待 干后 ， 用 1ml注 射 器 皮 内 注 射 0.1ml。3.判 定 反 应 时 间 ： 注 射 后 24、 48h各 观 察 一 次（ 以 48H结 果 为 准 ） 。4.判 定 反 应 标 准 ： 阳 性 反 应 局 部 红 肿 达 2x

20、2cm或面 积 4cm2 皮 内 变 态 反 应 注 意 事 项 部 位 ： 要 皮 内 注 射 ， 切 勿 皮 下 注 射 剂 量 ： 为 0.1ml， 注 射 后 应 在 注 射 部 位 有 小白 泡 隆 起 ， 注 射 液 不 得 从 针 口 漏 出 。 消 毒 ： 用 酒 精 ， 切 勿 用 碘 酒 ， 以 免 引 起 假 阳性 反 应 。 面 积 计 算 ： 浸 润 、 伪 足 都 属 于 测 量 范 围 制 品 浑 浊 ， 有 摇 不 散 的 沉 淀 ， 有 异 物 ， 安 瓶有 裂 纹 ， 标 签 不 清 ， 过 期 失 效 者 不 可 使 用 。 保 存 ： 布 氏 菌 素 于

21、 4-10 冷 暗 处 . 皮 内 变 态 反 应 禁 忌既 往 有 各 种 过 敏 史 者 ，支 气 管 哮 喘 病 者不 可 使 用 评 价 ： 此 法 敏 感 性 较 好 ， 呈 阳 性 反 应 的 人 只表 示 受 过 布 氏 菌 感 染 ， 不 能 做 最 后 判 定 。 此 法 用 于 流 行 病 学 调 查 和 大 量 检 疫 ，所 以 布 病 监 测 时 为 初 诊 方 法 ， 若 皮 变 阳性 ， 应 采 血 进 一 步 做 特 异 性 抗 体 检 测 。 （ 2） 试 管 凝 集 试 验原 理 ： Ag+AbAg-AbNacl电 介 质布 氏 菌 侵 入 机 体 后 ， 就

22、 会 刺 激机 体 产 生 特 异 性 抗 体 ， 这 种 抗体 可 与 相 应 抗 原 （ 布 氏 菌 体 ）发 生 特 异 性 结 合 ， 在 电 介 质 作用 下 ， 就 会 形 成 肉 眼 可 见 的 凝集 反 应 ， 我 们 就 是 用 已 知 抗 原查 未 知 抗 体 。 试 管 凝 集 反 应 步 骤1、 加 入 倍 比 稀 释 受 检 血 清 0.5ml2、 加 入 1： 10稀 释 布 氏 菌 抗 原 0.5ml37度 24小 时 观 察 结 果同 时 配 置 比 浊 管 便 于 结 果 判 定 0.5 0.50.50.5试 管 凝 集 反 应 （ SAT） 示 意 图 (1

23、)0.50.5 0.5 0.5 0.5 0.5稀释血清 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 0.5弃 去稀 释 度 比 浊 管 的 制 备管 号 1:20稀 释 抗 原 生 理 盐水 清 亮 度 标 记1 0.00 1.00 100% +2 0.25 0.75 75% +3 0.50 0.50 50% +4 0.75 0.25 25% + 5 1.00 0.00 0% - 每 次 试 验 须 作 三 种 对 照 阴 性 血 清 对 照 阳 性 血 清 对 照 抗 原 对 照 结 果 判 定 ： 根 据 各 管 中 上 层 液 体 的 清 亮 度 记 录 凝 集 反应 程 度

24、 （ 滴 度 ） ， 特 别 是 50%清 亮 度 （ +） 对 判定 结 果 关 系 较 大 ， 一 定 要 与 比 浊 管 对 比 判 定 。+ 等 于 完 全 凝 集 ， 上 层 液 100%清 亮 。+ 等 于 几 乎 完 全 凝 集 ， 上 层 液 75%清 亮 。+ 等 于 显 著 凝 集 ， 上 层 液 50%清 亮 。+ 等 于 有 凝 集 出 现 ， 液 体 25%清 亮 。- 等 于 无 凝 集 ， 液 体 不 清 亮 。人 的 诊 断 标 准 ： 1:100+为 阳 性 ， 1:50+为 可 疑 。 评 价 ： 试 管 凝 集 试 验 是 Wright和 Sample于

25、1898年 首 先建 立 的 ， 是 布 病 诊 断 在 国 际 上 唯 一 的 全 标 化 方法 ， 使 用 广 泛 ， 经 久 不 衰 。 特 异 性 好 ， 也 较 敏感 ， 实 用 性 强 ， 诊 断 、 流 调 、 监 测 均 适 用 。缺 点 ： 有 前 带 现 象 。 不 能 区 别 人 工 免 疫 和 自 然 感 染 。 产 生 一 定 的 交 叉 反 应 。 慢 ， 需 要 两 天 。 （ 3） 、 虎 红 平 板 凝 集 试 验 (一 )器 材 及 试 剂 清 洁 脱 脂 玻 片 或 有 凹 型 孔 的 玻 片 ， 0.1毫 升吸 管 或 微 量 加 样 器 、 牙 签 或

26、 细 铁 丝 。 虎 红 平板 凝 集 抗 原 、 被 检 血 清 。 (二 )操 作 方 法 在 玻 片 上 加 0.03毫 升 被 检 血 清 ， 然 后 加 入 虎红 平 板 抗 原 0.03毫 升 ， 摇 匀 或 用 牙 签 混 匀 ，在 5分 钟 内 判 定 结 果 。 判 定 级 别 同 平 板 凝 集反 应 。 亦 可 只 分 为 (+)阳 性 ， (-)阴 性 两 类 。 评 价 简 便 、 快 速 易 行 ， 具 有 较 好 的 特 异 性 ， 有 一 定 的 敏 感 性 ， 检 查 牛 的 阳 性 率 稍 高 于 绵 山 羊 。 该 法 可 用 于 大 面 积 检 疫 。

27、（ 4） 、 补 体 结 合 试 验 (CFT) 原 理 受 检 系 统 指 示 系 统 溶 血 反 应 补 体 结 合 试 验1.仅 有 抗 体抗 体 补 体 红 细 胞溶 血 素 阳 性 阴 性2.仅 有 抗 原抗 原 红 细 胞溶 血 素 补 体 阳 性 阴 性3.抗 原 抗 体 反 应抗 原抗 体 补体 红 细 胞溶 血 素 阴 性 阳 性 补 体 结 合 试 验 （ CFT） 补 体 滴 定 须 做 对 照 结 果抗 原 对 照 （ 加 抗 原 不 加 补 体 ） 补 体 对 照 （ 加 补 体 不 加 抗 原 ） 溶 血 素 对 照 （ 加 溶 血 素 和 绵 羊 红 细 胞 ）

28、优 点 ： 补 体 结 合 试 验 是 一 种 传 统 的 免 疫 学 技 术 ，特 异 性 强 。 它 所 查 的 免 疫 蛋 白 主 要 是 IgG类 ， 此 法 不 仅 与 布 病 临 床 表 现 、 病 期 有较 好 一 致 性 ， 常 用 于 鉴 别 诊 断 。缺 点 ： 参 与 反 应 的 成 分 多 ， 影 响 因 素 复 杂 ， 操 作 烦 琐 ， 不 适 与 普 查 。 斑 点 金 标 免 疫 渗 滤 法 （ DIGFA）n 一 种 具 有 简 便 、 快 速 、 微 量 、 敏 感 、特 异 、 试 剂 稳 定 等 优 点 的 检 测 血 清 中抗 布 鲁 氏 菌 特 异 性 抗 体 的 方 法 谢谢