细胞培养课件：第九章 细胞培养在实验研究中的应用

《细胞培养课件：第九章 细胞培养在实验研究中的应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞培养课件：第九章 细胞培养在实验研究中的应用（156页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、第九章第九章 细胞培养细胞培养在实验研究中的应在实验研究中的应用用1一、药物开发中的应用：一、药物开发中的应用：随细胞培养技术的发展，体外培养细胞已成随细胞培养技术的发展，体外培养细胞已成为测试药物效应的常用对象，尤其适用于药物高为测试药物效应的常用对象，尤其适用于药物高通量筛选。通量筛选。优点：优点：1直接应用人体细胞作为实验对象（用动物进行检测存在直接应用人体细胞作为实验对象（用动物进行检测存在着物种上的差别，不同种动物对同一种药物的耐药性有很大着物种上的差别，不同种动物对同一种药物的耐药性有很大差别）。差别）。2如检测的药物具有组织特异性时，可选用相应的细胞，如检测的药物具有组织特异性时

2、，可选用相应的细胞，如治疗肝病的药物应选肝细胞，抗癌药物应选用癌细胞。如治疗肝病的药物应选肝细胞，抗癌药物应选用癌细胞。3细胞生长在瓶皿中，加药后药物与细胞直接接触或直接细胞生长在瓶皿中，加药后药物与细胞直接接触或直接注入细胞内，获得实验结果比较迅速，比动物经济。注入细胞内，获得实验结果比较迅速，比动物经济。4结合使用多种方法技术检测药物效应，多方面揭示药物结合使用多种方法技术检测药物效应，多方面揭示药物特性。特性。2注意：注意：体内外环境不同，体外实验时药物直接作体内外环境不同，体外实验时药物直接作用明显，在体内可能由于肝、肾等脏器对用明显，在体内可能由于肝、肾等脏器对药物的修饰作用，使其作

3、用增强或减弱。药物的修饰作用，使其作用增强或减弱。有的药物在体外实验时无致癌性，进入体有的药物在体外实验时无致癌性，进入体内后在某些酶的激活下可产生致癌作用，内后在某些酶的激活下可产生致癌作用，因此动物试验有必要性。因此动物试验有必要性。癌细胞的耐药性。癌细胞的耐药性。适用于单质药物测试，实验结果易于分析，但复适用于单质药物测试，实验结果易于分析，但复方药或中药进行实验时，分析和评估实验结果应方药或中药进行实验时，分析和评估实验结果应持谨慎态度。持谨慎态度。被检药物需具有水溶性，若非水溶性药物测试时被检药物需具有水溶性，若非水溶性药物测试时应有溶剂对照组，以排除溶剂作用。应有溶剂对照组，以排除

4、溶剂作用。尽量选取多种细胞类型，扩大检测范围。尽量选取多种细胞类型，扩大检测范围。总之，培养细胞比较适用于抗癌药的总之，培养细胞比较适用于抗癌药的检测，常用于检测，常用于检测检测抗癌药抗癌药和和三致（致畸、三致（致畸、致癌、致突变）致癌、致突变）等有害物。等有害物。（一一）细胞选择细胞选择细胞选择不当，会影响实验结果的可细胞选择不当，会影响实验结果的可信性和参考价值。信性和参考价值。1.1.实验细胞选择原则实验细胞选择原则药效不明时，对细胞的选择可不必药效不明时，对细胞的选择可不必十分严格，但为了解药物可能的作用，最十分严格，但为了解药物可能的作用，最好多选用几种类型的细胞进行。好多选用几种类

5、型的细胞进行。已知药物有特殊效应或欲求得对某已知药物有特殊效应或欲求得对某一类细胞产生特定作用时，应尽量选用相一类细胞产生特定作用时，应尽量选用相应的细胞，如神经系统药物选用神经细胞，应的细胞，如神经系统药物选用神经细胞，抗癌药用癌细胞。抗癌药用癌细胞。检测抗癌药物应根据药物抗癌谱选用细胞。检测抗癌药物应根据药物抗癌谱选用细胞。药物无瘤种特异性时，可应用如药物无瘤种特异性时，可应用如HeLa、KB、BGC-823等各种细胞系或株。如有瘤种特等各种细胞系或株。如有瘤种特异性时，则应根据抗癌作用要求选用上皮异性时，则应根据抗癌作用要求选用上皮细胞起源的癌或中胚层起源的肉瘤细胞等。细胞起源的癌或中胚

6、层起源的肉瘤细胞等。总的原则是总的原则是：药物与细胞种类的一致：药物与细胞种类的一致性或符合性越大越好，结果更具有参考价性或符合性越大越好，结果更具有参考价值。值。2 2对照细胞的选择对照细胞的选择一般药物（非抗癌药）作用对象为正常细胞一般药物（非抗癌药）作用对象为正常细胞实验组加药；实验组加药；对照组不用药物，仅用药物溶剂处理对照组不用药物，仅用药物溶剂处理遗传缺陷调整药遗传缺陷调整药作用对象为突变细胞作用对象为突变细胞对照为相同类型的野生型细胞对照为相同类型的野生型细胞抗癌药：理论上应采用相应正常的二倍体细胞作抗癌药：理论上应采用相应正常的二倍体细胞作为对照，但正常细胞只有成纤维细胞易于培

7、养为对照，但正常细胞只有成纤维细胞易于培养（适于检测肉瘤），而与癌相符的正常上皮细胞（适于检测肉瘤），而与癌相符的正常上皮细胞较难获得，不要说组织类型完全一致的（如胃癌较难获得，不要说组织类型完全一致的（如胃癌与正常胃上皮细胞），即便是一般上皮细胞至今与正常胃上皮细胞），即便是一般上皮细胞至今也极为缺少，可采用：也极为缺少，可采用：原代培养细胞：刚离体培养，性状与体内原代培养细胞：刚离体培养，性状与体内细胞近似性大。细胞近似性大。动物细胞培养：对细胞类型要求严格，且动物细胞培养：对细胞类型要求严格，且不能用人成纤维细胞时。不能用人成纤维细胞时。注意注意 抗癌药物测试实验分组应注意：抗癌药物测试

8、实验分组应注意：实验组：加药的癌细胞；实验组：加药的癌细胞；对照组：不加药的癌细胞和对照组：不加药的癌细胞和加药的正常细胞加药的正常细胞。（二）检测药物（二）检测药物1.药物的溶解和保存药物的溶解和保存l水溶性水溶性药药物，用不完全培养基或物，用不完全培养基或HankS液配制液配制100母液，用时按所需浓度进行稀释。母液，用时按所需浓度进行稀释。l非水溶性药物，可以用非水溶性药物，可以用DMSO或无水乙醇进行配制，或无水乙醇进行配制，要求在药物工作浓度下，要求在药物工作浓度下，DMSO和无水乙醇的浓度和无水乙醇的浓度要小于要小于0.2%（V/V），这时不会对细胞产生毒性。），这时不会对细胞产生

9、毒性。l进行实验时，对照组要加入同等量的溶剂。进行实验时，对照组要加入同等量的溶剂。l所配制的母液一般在所配制的母液一般在20保存，一些光敏药物还保存，一些光敏药物还需避光保存。需避光保存。92.2.药物活化药物活化 l采用培养细胞进行药物检测，有时不能反应体内采用培养细胞进行药物检测，有时不能反应体内情况，有些药物经过肝脏后，会发生生物转化作情况，有些药物经过肝脏后，会发生生物转化作用，可能会使原来没有毒性的药物产生毒性。用，可能会使原来没有毒性的药物产生毒性。l为弥补这一缺陷，可进行与体内环境比较相似的为弥补这一缺陷，可进行与体内环境比较相似的药物活化实验药物活化实验。采用大鼠或人的肝细胞

10、活检材料采用大鼠或人的肝细胞活检材料和和S9混合液在体外将药物活化。混合液在体外将药物活化。l受试药物和受试药物和S9混合液与细胞接触时间一般为混合液与细胞接触时间一般为6h。10S9混合液的配制：混合液的配制：每每10mL由以下成分组成，临用时配制。由以下成分组成，临用时配制。磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH7.4）6.0mL氯化钾溶液（氯化钾溶液（1.65mol/L）0.2mL氯化镁溶液（氯化镁溶液（0.4mo1/L）0.2mL葡萄糖葡萄糖-6磷酸盐溶液（磷酸盐溶液（0.05mol/L）1.0mL辅酶辅酶-溶液（溶液（0.025mol/L）1.6mL肝肝S-9液多氰联苯（

11、液多氰联苯（PcB）诱导的大鼠肝匀浆（）诱导的大鼠肝匀浆（S-9）1.0mL3 3.药物剂量的确定药物剂量的确定抗癌药的抗癌药的最适剂量最适剂量应是：应是：对正常细胞无影响或伤害最小（能恢复）对正常细胞无影响或伤害最小（能恢复）对肿瘤细胞杀伤最大（即选择性杀伤效应）对肿瘤细胞杀伤最大（即选择性杀伤效应）应先测出半效应量（应先测出半效应量（MedianInfectiveDose，ID50）。抗癌药和三致物（致癌、致畸、致突变）。抗癌药和三致物（致癌、致畸、致突变）对细胞系大多具有杀伤性作用，故对细胞系大多具有杀伤性作用，故ID50与与LD50相当。相当。找到合适的用药剂量：在一定范围内递增药物找

12、到合适的用药剂量：在一定范围内递增药物量的方法（经验测试法）确定粗量的方法（经验测试法）确定粗ID50值，值，TrypanBlue染色进行细胞计数，取染色进行细胞计数，取50%死亡细胞组的药物死亡细胞组的药物浓度作为粗浓度作为粗ID50值（近似值）。值（近似值）。以以ID50/10为主要为主要测试剂量。测试剂量。4.4.细胞形态和增殖生长反应细胞形态和增殖生长反应细胞受杀伤性药物作用后，可能出现多方面反应：细胞受杀伤性药物作用后，可能出现多方面反应：对细胞代谢和基因表达的影响（对细胞代谢和基因表达的影响（Pr、酶）、酶）难以迅速测知。难以迅速测知。引起的细胞形态和增殖生长的变化，易于引起的细胞

13、形态和增殖生长的变化，易于呈现。呈现。TrypanBlue染色检查活细胞存量的同时可观染色检查活细胞存量的同时可观察细胞形态。通常分察细胞形态。通常分04度度5个等级，根据个等级，根据04度度变化来测定药物的效应剂量。变化来测定药物的效应剂量。细胞形态和生长改变与药物效应经验等级：细胞形态和生长改变与药物效应经验等级：0度度：细细胞胞在在一一定定剂剂量量和和一一定定时时间间的的药药物物作作用用下下，无无任任何何反应，细胞形态正常、增殖生长能力无改变。反应，细胞形态正常、增殖生长能力无改变。1度度：细细胞胞增增殖殖速速度度减减缓缓，分分裂裂指指数数下下降降，镜镜下下观观察察细细胞胞轮廓微增强，反

14、差增大，但细胞仍能增殖生长。轮廓微增强，反差增大，但细胞仍能增殖生长。2度度：细细胞胞增增殖殖生生长长非非常常缓缓慢慢，细细胞胞分分裂裂指指数数显显著著下下降降或或近于消失，细胞轮廓增强，胞质粗糙，内有颗粒堆积。近于消失，细胞轮廓增强，胞质粗糙，内有颗粒堆积。3度度：细细胞胞增增殖殖生生长长完完全全停停止止，分分裂裂相相消消失失，细细胞胞体体回回缩缩，细细胞胞相相互互间间隙隙加加大大，细细胞胞轮轮廓廓非非常常明明显显，胞胞质质极极度度粗粗糙糙，内充满多量堆积物。内充满多量堆积物。4度：大部细胞脱落死亡，残余细胞亦濒死或崩溃溶解。度：大部细胞脱落死亡，残余细胞亦濒死或崩溃溶解。14抗癌药效应剂量

15、：抗癌药效应剂量：在在一一定定剂剂量量下下，对对正正常常细细胞胞的的影影响响为为01度度，但但能能明明显显抑抑制制癌癌细细胞胞生生长长增增殖殖或或破破坏坏其其形形态态结结构构的的药药物物和和剂剂量量是是有有效效的的，即即药药物物对对正正常细胞和癌细胞的作用差别越大，效果越好。常细胞和癌细胞的作用差别越大，效果越好。15（三（三)测试程序（以抗癌药为例）：测试程序（以抗癌药为例）：细胞：根据已知药物的特点细胞：根据已知药物的特点，选用适当的细胞。，选用适当的细胞。实验细胞：实验细胞：药效特点不明时，可用药效特点不明时，可用HeLa、KB、Detroit等通用细胞。等通用细胞。对照细胞对照细胞：原

16、则是越近似越好。：原则是越近似越好。例如被检药物为抗人胃癌药，对照细胞应：人正常胃上例如被检药物为抗人胃癌药，对照细胞应：人正常胃上皮细胞皮细胞其他上皮细胞其他上皮细胞人成纤维细胞人成纤维细胞动物的胃上皮动物的胃上皮细胞细胞动物初代肝细胞动物初代肝细胞。16加药：加药：加药时间：加药时间：接种前接种前：细胞悬液细胞悬液+一定量待测药物一定量待测药物（作用一定时间）（作用一定时间）再培养；再培养；生长中生长中：先接种细胞，贴壁生长至对数生长期先接种细胞，贴壁生长至对数生长期加药。先测出加药。先测出ID50，取，取ID50/10为实验剂量。加为实验剂量。加药时间宜在接种细胞后第药时间宜在接种细胞后

17、第48小时。小时。17药物作用持续时间：药物作用持续时间：冲击性测试法：通常药物与细胞接触时间不应少于冲击性测试法：通常药物与细胞接触时间不应少于8h，一，一般般1224h或更长，然后换液继续培养。或更长，然后换液继续培养。持续作用法持续作用法：从实验开始到实验结束，持续让药物：从实验开始到实验结束，持续让药物接触细胞，通常接触细胞，通常7d。必要时中间可换。必要时中间可换液液（仍仍含含有有与与原原来来相相同同剂剂量量的的药药物物）。对照组做同样处理，加等量的对照组做同样处理，加等量的BSSBSS或助溶剂。或助溶剂。18 观察：观察：从实验开始，每天或间隔一定时间取从实验开始，每天或间隔一定时

18、间取一组细胞观察。观察指标：一组细胞观察。观察指标：形态结构：形态结构：形态易改变，不可靠，以超微结构为形态易改变，不可靠，以超微结构为依据。依据。生长和增殖生长和增殖：生长生长指细胞体积增大、增粗或增长；指细胞体积增大、增粗或增长；增殖增殖是细胞通过分裂使数量增多。计算细胞分裂是细胞通过分裂使数量增多。计算细胞分裂指数是测知细胞增殖旺盛与否的常用方法。指数是测知细胞增殖旺盛与否的常用方法。化学成分：化学成分：有些药物可抑制细胞某些成分的合成，有些药物可抑制细胞某些成分的合成，测其含量即可知药效，如免疫组化、测其含量即可知药效，如免疫组化、ELISAELISA法等。法等。19分子细胞学检测分子

19、细胞学检测：根据药物作用特点，可进行特：根据药物作用特点，可进行特定基因表达或变异的检测。定基因表达或变异的检测。细胞死亡：细胞死亡：致死效应是药物检测中特别是抗肿瘤致死效应是药物检测中特别是抗肿瘤药的重要指标。凡能引起细胞内相互制约系统中药的重要指标。凡能引起细胞内相互制约系统中一个或多个环节的紊乱，最终导致细胞机能障碍、一个或多个环节的紊乱，最终导致细胞机能障碍、进而缓慢死亡的现象，也应视为进而缓慢死亡的现象，也应视为细胞死亡细胞死亡的范畴。的范畴。因此确定细胞死亡必须有一个时间范围。因此确定细胞死亡必须有一个时间范围。药物遗传毒性测试：药物遗传毒性测试：反应化学药物的遗传毒性的反应化学药

20、物的遗传毒性的检测可以分为检测可以分为4类：类：DNA损伤、基因突变、细胞损伤、基因突变、细胞遗传学改变（染色体畸变和姐妹染色单体互换）、遗传学改变（染色体畸变和姐妹染色单体互换）、细胞转化。细胞转化。20注意：注意：用培养癌细胞检测抗癌药物所得用培养癌细胞检测抗癌药物所得结果，仅作参考，不能作为临床应用的结果，仅作参考，不能作为临床应用的直接依据；确证药物抗癌效应，尚需动直接依据；确证药物抗癌效应，尚需动物试验，体外培养细胞不能代替动物实物试验，体外培养细胞不能代替动物实验，不能代表体内作用验，不能代表体内作用。21二、细胞培养在二、细胞培养在杂交瘤技术杂交瘤技术中的应用中的应用杂交瘤细胞杂

21、交瘤细胞：肿瘤细胞和体细胞融合形成：肿瘤细胞和体细胞融合形成的杂交细胞。的杂交细胞。杂交瘤技术杂交瘤技术：建立杂交瘤细胞系的技术。：建立杂交瘤细胞系的技术。通常指通常指B淋巴细胞杂交瘤技术。淋巴细胞杂交瘤技术。221975年年Milstein和和Kouler首先在细胞融合技术的基首先在细胞融合技术的基础上创建了础上创建了B淋巴细胞杂交瘤技术。淋巴细胞杂交瘤技术。小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞无限传代无限传代SRBC免疫的同系小鼠脾细胞免疫的同系小鼠脾细胞分泌分泌Ab目前广泛应用于目前广泛应用于McAb的制备。杂交瘤细胞系建立的制备。杂交瘤细胞系建立后，将永远存活且获得的产物是无限的。后，将永远存

22、活且获得的产物是无限的。融合融合（一）原理：（一）原理：杂交瘤技术主要由细胞融合、抗体筛选杂交瘤技术主要由细胞融合、抗体筛选和克隆化培养三部分组成，这三部分紧和克隆化培养三部分组成，这三部分紧密相连，组成一套完整的技术体系。密相连，组成一套完整的技术体系。24细胞融合细胞融合：两个细胞或两个以上细胞合并形成一个：两个细胞或两个以上细胞合并形成一个细胞的过程。细胞的过程。免疫动物脾细胞免疫动物脾细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞同系动物骨髓瘤细胞同系动物骨髓瘤细胞杂交瘤细胞具有两个亲代细胞的特性。杂交瘤细胞具有两个亲代细胞的特性。PEG筛选杂交瘤细胞：筛选杂交瘤细胞：细胞融合过程中，除能产生骨细胞融合过程

23、中，除能产生骨髓瘤细胞和浆细胞融合细胞（目的细胞），还存髓瘤细胞和浆细胞融合细胞（目的细胞），还存在没有发生融合的细胞和自身发生融合细胞，因在没有发生融合的细胞和自身发生融合细胞，因此要选择性地杀死这些细胞，只保留所需的杂交此要选择性地杀死这些细胞，只保留所需的杂交瘤细胞。瘤细胞。没有发生融合的脾细胞以及自身融合物缺没有发生融合的脾细胞以及自身融合物缺乏体外生长能力，两周内相继死亡。乏体外生长能力，两周内相继死亡。选择性地杀死骨髓瘤细胞及自身融合物选择性地杀死骨髓瘤细胞及自身融合物（具有无限生存能力），是细胞融合是否成功的（具有无限生存能力），是细胞融合是否成功的关键：关键：HAT选择培养系统

24、。选择培养系统。26抗体筛选：抗体筛选：融合成功的细胞中还杂有非分泌的细融合成功的细胞中还杂有非分泌的细胞，如何筛选分泌特异性抗体的细胞是至关重胞，如何筛选分泌特异性抗体的细胞是至关重要的，是随后进行分泌抗体细胞克隆化培养的要的，是随后进行分泌抗体细胞克隆化培养的前提。应选择建立灵敏度高、简便快速和特异前提。应选择建立灵敏度高、简便快速和特异性强的抗体检测方法。性强的抗体检测方法。克隆化培养：克隆化培养：在于保证最后所获得的杂交瘤细胞在于保证最后所获得的杂交瘤细胞系是来自单个细胞，因而也就保证可以获得针系是来自单个细胞，因而也就保证可以获得针对单一抗原决定簇的抗体，即所谓单克隆抗体对单一抗原决

25、定簇的抗体，即所谓单克隆抗体（MonoclonalAntihody，McAb）。）。27杂交瘤技术和单克隆抗杂交瘤技术和单克隆抗体生产的实验流程图体生产的实验流程图28（二）杂交瘤细胞的制备（二）杂交瘤细胞的制备1骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞培养 用于细胞融合的骨髓瘤细胞系是经过毒性药物用于细胞融合的骨髓瘤细胞系是经过毒性药物8-杂氮鸟嘌呤杂氮鸟嘌呤（8-AG）或）或6-巯基嘌呤（次黄嘌呤拟似物）或巯基嘌呤（次黄嘌呤拟似物）或5-溴脱氧尿嘧溴脱氧尿嘧啶核苷（啶核苷（BUdR，胸腺嘧啶核苷类似物）等诱导而选择产生，胸腺嘧啶核苷类似物）等诱导而选择产生的的HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶）或（

26、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶）或TK（胸腺（胸腺嘧啶脱氧核苷激酶）基因缺陷型细胞嘧啶脱氧核苷激酶）基因缺陷型细胞。它们。它们对对8-杂氮鸟嘌呤杂氮鸟嘌呤（8-AG）或）或6-巯基嘌呤或巯基嘌呤或5-溴脱氧尿嘧啶核苷有抵抗性溴脱氧尿嘧啶核苷有抵抗性，这，这是它们生物学特性的标志，同时也是它们生物学特性的标志，同时也失去了利用外源性次黄失去了利用外源性次黄嘌呤（嘌呤（H)或胸腺嘧啶核苷（或胸腺嘧啶核苷（T）的能力。的能力。29BALB/c小鼠骨髓瘤细胞，稳定，易培养，不分泌免疫球蛋白。我国常用SP2/0和NS-1细胞株。为了排除任何返祖和维持其已形成的基因缺陷，需每36个月，把已突变的细胞培养在含

27、有8-杂氮嘌呤或6-巯基嘌呤或5-溴脱氧尿苷的培养液中，培养23周。用于融合的骨髓瘤细胞应处于对数生长期，一般融合前一天，传代一次，显微镜下所见应是形态规则、轮廓清晰的细胞。尽量减少培养传代次数，及时冻存。30312、免疫、免疫B淋巴细胞制备淋巴细胞制备可溶性抗原、颗粒抗原免疫小鼠。可溶性抗原、颗粒抗原免疫小鼠。免疫程序是取免疫程序是取68周龄周龄BALB/c雌鼠，基础免雌鼠，基础免疫疫2-4周，融合前周，融合前35天再加强免疫一次。天再加强免疫一次。收集小鼠脾细胞，计数测定活力细胞用于融收集小鼠脾细胞，计数测定活力细胞用于融合。合。免疫成功的标志：融合时脾脏能够提供大量免疫成功的标志：融合时

28、脾脏能够提供大量处于增殖状态的特异性处于增殖状态的特异性B淋巴细胞。淋巴细胞。3饲细胞的制备饲细胞的制备饲养层培养法可利于融合后杂交瘤细胞的增饲养层培养法可利于融合后杂交瘤细胞的增殖生长和增加杂交克隆的数量。殖生长和增加杂交克隆的数量。小鼠胸腺细胞小鼠胸腺细胞小鼠的腹腔细胞：更常用小鼠的腹腔细胞：更常用 32一般在融合细胞前一天制备饲养细胞，置一般在融合细胞前一天制备饲养细胞，置CO2孵箱，融合时取出使用。孵箱，融合时取出使用。4细胞融合细胞融合常用诱导物为常用诱导物为：仙台病毒（仙台病毒（RNA病毒）病毒）聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）：易得、方法简）：易得、方法简便、便、效果稳定，为常用方法

29、，已取代仙台病效果稳定，为常用方法，已取代仙台病毒。分子量大于毒。分子量大于200小于小于6000者均可作为细者均可作为细胞融合剂，通常用分子量胞融合剂，通常用分子量1000的的PEG作融合作融合剂最好，剂最好，50%PEG溶液能产生最多的杂交细溶液能产生最多的杂交细胞。胞。PEG溶液在溶液在pH6.0时细胞融合率最高。时细胞融合率最高。1:5或或1:10混合骨髓瘤细胞和混合骨髓瘤细胞和脾细胞脾细胞离心去上清离心去上清加加1ml50%PEG溶液，溶液，与细胞混合均匀（与细胞混合均匀（1min内逐滴加入）内逐滴加入）5min内缓慢滴加内缓慢滴加20ml无血清无血清培养液终止反应，离心去上清培养液

30、终止反应，离心去上清加加10ml完全培养液完全培养液37,5%CO2培养培养624h换成选择培养基换成选择培养基筛选杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞接种接种96孔培养板，孔培养板，每孔每孔0.1ml34355、融合后选择性培养：、融合后选择性培养：HAT培养系统培养系统原理原理：uHAT系统系统为次黄嘌呤为次黄嘌呤(H)、氨基喋呤、氨基喋呤(A)和胸腺嘧和胸腺嘧啶核苷啶核苷(T)的缩写。是根据嘌呤和嘧啶生物合成途的缩写。是根据嘌呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂交瘤细胞的特殊培养基。径设计的分离杂交瘤细胞的特殊培养基。u一般细胞一般细胞DNA的主要生物合成途径（由叶酸介导的主要生物合成途径（由叶酸介导合

31、成合成DNA）被氨基蝶呤阻断后，细胞仍可经过应）被氨基蝶呤阻断后，细胞仍可经过应急途径合成急途径合成DNA。应急途径通过次黄嘌呤鸟嘌呤。应急途径通过次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（磷酸核苷转移酶（HGPRT）利用次黄嘌呤以及胸）利用次黄嘌呤以及胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（腺嘧啶脱氧核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶脱氧核）利用胸腺嘧啶脱氧核苷合成苷合成DNA。u因此正常细胞即使主要生物合成途径被阻断，若有因此正常细胞即使主要生物合成途径被阻断，若有足够的次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷，可利用足够的次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷，可利用HGPRT和和TK合成合成DNA，但若缺少其中一种酶，但若缺少其中一种酶，DNA合

32、成就不能进行。合成就不能进行。uHAT培养系统中，氨基喋呤阻断了核苷酸的主要合培养系统中，氨基喋呤阻断了核苷酸的主要合成途径，诱变的成途径，诱变的HGPRT或或TK缺陷骨髓瘤细胞失去了缺陷骨髓瘤细胞失去了利用外源性次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷的能力，无法利用外源性次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷的能力，无法合成核苷酸，因此在合成核苷酸，因此在HAT培养基中不能生存。而杂培养基中不能生存。而杂交瘤细胞含有从亲代脾细胞来的正常基因而得以存交瘤细胞含有从亲代脾细胞来的正常基因而得以存活。活。36骨髓瘤细胞HGPRT或TK()无限增殖小鼠脾细胞SRBC免疫HGPRT或TK()杂交瘤细胞PEG产生Ab无继续生长能力HA

33、T培养液培养培养液培养37死亡死亡存活存活选择性培养过程：选择性培养过程：（1）融合后）融合后710天用天用HAT培养液半量换液（留一培养液半量换液（留一半旧的加一半新的），以后每隔半旧的加一半新的），以后每隔23天半量换液天半量换液一次。一次。（2）两周后可改用）两周后可改用HT培养液半量换液，或仍用培养液半量换液，或仍用HAT培养液。培养液。（3）23周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且透明。且透明。（4）待集落增殖生长至）待集落增殖生长至1/3孔时，应进行抗体检孔时，应进行抗体检测。对抗体检测阳性孔及时进行单克隆化培养。测。对抗体检测阳性孔及时进行单克隆

34、化培养。386.抗体筛选抗体筛选是获得所需特异性抗体的杂交瘤细胞的是获得所需特异性抗体的杂交瘤细胞的重要一步。重要一步。尽快发现，尽早筛选尽快发现，尽早筛选，重复筛选。重复筛选。由于待测培养上清的量很少，样品数量多、抗由于待测培养上清的量很少，样品数量多、抗体含量低等原因，从而检测方法必须非常灵敏、体含量低等原因，从而检测方法必须非常灵敏、快速、可靠，并且能在短时间中完成大量样品快速、可靠，并且能在短时间中完成大量样品的测定。以的测定。以ELISA常用。常用。397、克隆化培养、克隆化培养：（1）大多数情况下，能产生特异抗体的杂交瘤）大多数情况下，能产生特异抗体的杂交瘤细胞集落不是来自单个细胞

35、，可能混有不分泌细胞集落不是来自单个细胞，可能混有不分泌抗体的克隆，它常比分泌抗体的克隆增殖生长抗体的克隆，它常比分泌抗体的克隆增殖生长快。快。（2）及时进行抗体检测和克隆化，以避免在同）及时进行抗体检测和克隆化，以避免在同一培养物中，抗体细胞被不分泌抗体的细胞过一培养物中，抗体细胞被不分泌抗体的细胞过度增殖所排挤。度增殖所排挤。（3）克隆化培养：软琼脂培养和有限稀释法）克隆化培养：软琼脂培养和有限稀释法 40有限稀释法有限稀释法（1）制备有饲养细胞底层的细胞培养板（此步有）制备有饲养细胞底层的细胞培养板（此步有时可免除）。时可免除）。（2）收集细胞，计数阳性培养细胞。）收集细胞，计数阳性培养

36、细胞。（3）细胞悬液调至）细胞悬液调至510个细胞个细胞/ml.（4）96孔板中每孔加孔板中每孔加0.1ml.（5）CO2温箱培养一周后，半量换液，继续培养。温箱培养一周后，半量换液，继续培养。（6）适时）适时(细胞集落在细胞集落在1-2mm大小时）检测每孔培大小时）检测每孔培养上清，挑选呈阳性培养孔的细胞继续进行有限养上清，挑选呈阳性培养孔的细胞继续进行有限稀释，直至确信孔中细胞为单克隆（阳性孔率达稀释，直至确信孔中细胞为单克隆（阳性孔率达100%）为止。）为止。（7）进行扩大培养。）进行扩大培养。41（三）（三）McAbMcAb的大量制备的大量制备：l加大培养容器，大量收集上清，并浓缩抗体

37、。加大培养容器，大量收集上清，并浓缩抗体。l体内移植法体内移植法克隆化的细胞克隆化的细胞注入动物腹腔繁殖注入动物腹腔繁殖产生腹产生腹水水腹水中抗体可达腹水中抗体可达mg水平水平纯化抗体。纯化抗体。4243三三.体外恶性肿瘤化疗药物敏感试体外恶性肿瘤化疗药物敏感试验（抗癌药物耐药性检测）验（抗癌药物耐药性检测）抗癌药物有效的前提是药物能进入细胞抗癌药物有效的前提是药物能进入细胞中有效地积累。如抗癌药物不能有效地在癌中有效地积累。如抗癌药物不能有效地在癌细胞中积累，达不到预想的浓度，癌细胞便细胞中积累，达不到预想的浓度，癌细胞便能逃脱抗癌药物的杀伤。能逃脱抗癌药物的杀伤。研究表明药物在细胞内的积累

38、量下降是研究表明药物在细胞内的积累量下降是肿瘤细胞耐药的共性原因。肿瘤细胞耐药的共性原因。44(一一)耐药性的产生：耐药性的产生：癌细胞的耐药性即癌细胞对抗癌药物的抵抗能力癌细胞的耐药性即癌细胞对抗癌药物的抵抗能力,包括包括固有耐药性固有耐药性和和抗癌药物诱导产生。抗癌药物诱导产生。通常通常,肿瘤细肿瘤细胞对药物产生耐受性主要有两种途径胞对药物产生耐受性主要有两种途径:一种是细胞自身的遗传特性发生改变一种是细胞自身的遗传特性发生改变,通过抑制凋通过抑制凋亡和减少亡和减少DNA损伤使肿瘤细胞存活损伤使肿瘤细胞存活;另一种是细胞传递药物的功能另一种是细胞传递药物的功能(包括增加药物外排、包括增加药

39、物外排、降低药物摄取、脱毒作用等降低药物摄取、脱毒作用等)受损。受损。这两种途径均可以造成药物的吸收减少以及药物这两种途径均可以造成药物的吸收减少以及药物代谢及排泄速度加快代谢及排泄速度加快.45多多药药耐耐药药性性(multipledrugresistance,MDR)：肿肿瘤瘤细细胞胞对对某某种种药药物物产产生生耐耐药药性性时时,也也会会对对一一系系列列作作用用机机制制相相似似的的药药物物产产生生耐耐药药性性,继继而而对对其其他他结结构构、细细胞胞靶靶点点和和机机制制迥迥然然不不同同的的化化疗疗药药物物产生交叉耐药性产生交叉耐药性,称之。称之。肿肿瘤瘤耐耐药药分分为为原原发发性性耐耐药药(

40、intrinsicresistance)和和继继发发性性耐耐药药(acquiredresistance)两两大大类类。而而继继发发性性耐耐药药又又可可分分为为原原药药耐耐药药(primarydrugresistance,PDR)和多药耐药和多药耐药(MDR)。临床用药导致的肿瘤耐药最常见的是多药耐药。临床用药导致的肿瘤耐药最常见的是多药耐药。肿瘤细胞肿瘤细胞MDR产生机制产生机制药物外排增加：癌细胞内药物外排增加：癌细胞内MDR基因产物基因产物(P-170)将药物泵出将药物泵出细胞外。细胞外。药物摄入下调：由转运蛋白和分子伴侣组成的自稳态调节药物摄入下调：由转运蛋白和分子伴侣组成的自稳态调节系

41、统，影响药物摄入。系统，影响药物摄入。耐药相关基因表达的改变：与细胞凋亡密切相关的信号分耐药相关基因表达的改变：与细胞凋亡密切相关的信号分子也在肿瘤耐药过程中发挥着重要的作用。子也在肿瘤耐药过程中发挥着重要的作用。与耐药蛋白相关酶类的改变：抗癌药物的靶蛋白与耐药蛋白相关酶类的改变：抗癌药物的靶蛋白DNATop酶酶的活性的活性，酶量，酶量癌细胞的解毒机制增强。癌细胞的解毒机制增强。代谢机制使药物代谢活化降低。代谢机制使药物代谢活化降低。(二二)多药耐药性检测方法多药耐药性检测方法多药耐药性的产生一般是由于多药耐药性的产生一般是由于MDRMDR基因过度表达所致，基因过度表达所致，P-170P-17

42、0具有具有ATPATP酶活性，利用酶活性，利用ATPATP的能量可将带正电荷的能量可将带正电荷的抗癌药物通过膜通道排出细胞外的抗癌药物通过膜通道排出细胞外细胞内抗癌药细胞内抗癌药物累积量物累积量药物对细胞的毒性下降。药物对细胞的毒性下降。此机制适用于天然或半天然抗癌药物；其靶对此机制适用于天然或半天然抗癌药物；其靶对象药有三类：象药有三类：具有芳香杂环的抗癌药具有芳香杂环的抗癌药具有疏水性的抗癌药具有疏水性的抗癌药带有正电荷的氮残基抗癌药带有正电荷的氮残基抗癌药48uMTT检测化疗药物敏感性即癌细胞耐药性检测化疗药物敏感性即癌细胞耐药性1、细胞浓度：一般、细胞浓度：一般1000-10000个个

43、细胞细胞/孔（孔（96孔孔培养板），多用培养板），多用5103个个，依细胞系生长速度而定。，依细胞系生长速度而定。最好通过预实验测其倍增时间以及不同接种细胞最好通过预实验测其倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。胞数和培养时间。2、药物浓度：一系列浓度，以最高浓度下多数细、药物浓度：一系列浓度，以最高浓度下多数细胞被杀死、最低浓度下不会杀死细胞为标准。可胞被杀死、最低浓度下不会杀死细胞为标准。可通过参考文献，设置浓度范围。通过参考文献，设置浓度范围。493、实验分组、实验分组空白对照组空白对照组：加培养液、：

44、加培养液、MTT、二甲基亚砜、二甲基亚砜细胞对照组细胞对照组：细胞、培养液、：细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜、二甲基亚砜、溶解药物的介质溶解药物的介质实验组实验组：细胞、培养液、：细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜、不、二甲基亚砜、不同浓度药物同浓度药物每种药物浓度至少每种药物浓度至少3个复孔。每种药物每次做个复孔。每种药物每次做3个个平行试验，争取一次测准，求出平均值和标准误平行试验，争取一次测准，求出平均值和标准误差。差。504、加药及测定时间：、加药及测定时间：一般一般细胞贴壁后细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天即可加药，或两小时，或半天时间，或前一天下午铺板，次日上午加药。也可在时间

45、，或前一天下午铺板，次日上午加药。也可在铺板同时加药。铺板同时加药。药物作用时间：一般为药物作用时间：一般为48h，要根据不同药物，要根据不同药物作用效果和性质来确定，可查阅文献，或通过预实作用效果和性质来确定，可查阅文献，或通过预实验选择最佳作用时间（绘制不同时间点抑制率曲线，验选择最佳作用时间（绘制不同时间点抑制率曲线，曲线到了平台期的时间点即最佳时间点，因为此时曲线到了平台期的时间点即最佳时间点，因为此时的细胞增殖抑制表现最明显）。实验中也可选则不的细胞增殖抑制表现最明显）。实验中也可选则不同时间点进行测定，如同时间点进行测定，如48h、72h等。等。51 5、常用常用操作流程：每孔加单

46、细胞悬液每孔加单细胞悬液100-200l37，5%CO2，overnight去除培养液，加含一定浓度抗癌药物培养液去除培养液，加含一定浓度抗癌药物培养液每孔每孔200l,5%CO2，48h5mg/ml,MTT20l,5%CO2,4h200lDMSO,混匀混匀570nm吸光值吸光值操作中的注意事项96孔板边缘孔水分蒸发较快，使培养基中各种成孔板边缘孔水分蒸发较快，使培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。因此实验分浓度变化增大，导致细胞状态不同。因此实验时时尽量不用边缘孔尽量不用边缘孔。铺板时边缘孔用无菌水或。铺板时边缘孔用无菌水或PBS填充，并要保证培养箱中的湿度，减少开关培养填充，并

47、要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。箱的次数和时间。细胞悬液浓度一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，细胞悬液浓度一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每加几个孔就导致每孔中的细胞数量不等，可以每加几个孔就要再混匀一下。要再混匀一下。药物如作用时间长，注意及时换液。药物如作用时间长，注意及时换液。呈色后尽量吸尽孔内残余液体，再加呈色后尽量吸尽孔内残余液体，再加DMSO。6、结果分析、结果分析抑制率抑制率(inhibitrate,IR)计算：抑制率计算：抑制率=(对照组对照组OD值均数值均数-实验组实验组OD值均数值均数)/对照组对照组OD值均数或值均数或抑制率抑

48、制率=1-实验组实验组OD值均数值均数/对照组对照组OD值均数值均数所有数值以均数所有数值以均数标准差表示，应用方差分析比较标准差表示，应用方差分析比较不同药物浓度间或不同时间之间的差异。不同药物浓度间或不同时间之间的差异。IC50IC50（半数抑制浓度）计算：以药物浓度为横坐（半数抑制浓度）计算：以药物浓度为横坐（半数抑制浓度）计算：以药物浓度为横坐（半数抑制浓度）计算：以药物浓度为横坐标（标（标（标（X X轴）、吸光值为纵坐标（轴）、吸光值为纵坐标（轴）、吸光值为纵坐标（轴）、吸光值为纵坐标（Y Y轴）绘制曲线图，轴）绘制曲线图，轴）绘制曲线图，轴）绘制曲线图，比对照组吸光值减少一半时所需

49、药物浓度即比对照组吸光值减少一半时所需药物浓度即比对照组吸光值减少一半时所需药物浓度即比对照组吸光值减少一半时所需药物浓度即IC50IC50浓度。浓度。浓度。浓度。或用公示法、软件等计算。或用公示法、软件等计算。改良寇式法:lgIC50=Xm-IP-(3-Pm-Pn)/4 Xm:lg最大剂量最大剂量I:lg（最大剂量（最大剂量/相临剂量）相临剂量）P:阳性反应率（即抑制率）之和阳性反应率（即抑制率）之和Pm:最大阳性反应率（最大抑制率）最大阳性反应率（最大抑制率）Pn:最小阳性反应率（最小抑制率）最小阳性反应率（最小抑制率）各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT

50、值及抑制率如下值及抑制率如下代入计算公式：代入计算公式：Pm=0.869Pn=0.135P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142Xm=lg100=2lgI=lg100/50=0.301lgIC50=2-0.3013.142-(3-0.869-0.135)/4=1.655IC50=45.186该药物的该药物的IC50值为值为45.186ug/mlu流式细胞仪测定药物在细胞中的积流式细胞仪测定药物在细胞中的积累检测法累检测法用用罗罗丹丹明明荧荧光光染染料料作作为为被被测测抗抗癌癌药药物物的的代代表表。它它能能有有效效地地被被p-170糖糖蛋蛋白白排排出

51、出细细胞胞外外，并并且且具具有有强强荧荧光光性性,容易测定，且即使浓度很高也不致杀死细胞。容易测定，且即使浓度很高也不致杀死细胞。流流式式细细胞胞仪仪可可将将细细胞胞按按荧荧光光强强度度分分开开：亲亲本本细细胞胞由由于于没没有有或或很很少少p-170糖糖蛋蛋白白，不不能能将将进进入入细细胞胞的的罗罗丹丹明明排出，在细胞中积累大量罗丹明，荧光强度很大；排出，在细胞中积累大量罗丹明，荧光强度很大；而而耐耐药药细细胞胞有有p-170糖糖蛋蛋白白的的过过表表达达，使使进进入入细细胞胞的的罗罗丹丹明明可可有有效效地地被被泵泵出出细细胞胞，细细胞胞内内的的罗罗丹丹明明少少，荧荧光强度非常低。光强度非常低。

52、57uDNATop酶检测：酶检测：是许多天然或半天然抗癌药物的靶蛋白，抗癌是许多天然或半天然抗癌药物的靶蛋白，抗癌药通过此酶的作用，能和药通过此酶的作用，能和DNA形成复合物，成为导形成复合物，成为导致细胞死亡的原因。如致细胞死亡的原因。如DNA拓扑异构酶量减少或活拓扑异构酶量减少或活性降低，都将使进入细胞中的抗癌药物失去作用，性降低，都将使进入细胞中的抗癌药物失去作用，从而细胞得以在药物存在下仍能生存（即获得耐药从而细胞得以在药物存在下仍能生存（即获得耐药性）。性）。u免疫组化法测免疫组化法测P-170糖糖蛋白，蛋白，RT-PCR检测相关基因表达检测相关基因表达58四、体外受精技术四、体外受

53、精技术体外受精体外受精-胚胎移植（胚胎移植（Invitrofertilizationandembryotransfer,IVF-ET)又称试管婴儿技又称试管婴儿技术，术，就是用人工方法取出精子与卵子，在体外就是用人工方法取出精子与卵子，在体外环境中受精和发育，待胚胎发育到一定阶段后环境中受精和发育，待胚胎发育到一定阶段后将其移植到母体子宫进一步发育成胎儿直至分将其移植到母体子宫进一步发育成胎儿直至分娩的过程。娩的过程。59自自1978年世界上第一例试管婴儿在英国诞生以年世界上第一例试管婴儿在英国诞生以来，来，IVF-ET经历了三个主要发展阶段：经历了三个主要发展阶段：u经经典典的的IVF-ET

54、IVF-ET技技术术：包包括括诱诱发发超超排排卵卵，腹腹腔腔镜镜或或经经阴阴道道B超超获获取取卵卵子子，卵卵子子在在体体外外与与精精子子进进行行受受精精，受受精精卵卵发发育育到到48细细胞胞阶阶段段移移植植入入母母体体子子宫宫并并发发育育成胎儿。成胎儿。为为女女性性输输卵卵管管阻阻塞塞等等原原因因所所致致不不孕孕提提供供了了一一个个新的治疗方法。新的治疗方法。60u第二代试管婴儿技术：第二代试管婴儿技术：1992年年Palermo等采用显等采用显微操作技术将单个精子直接注入卵细胞浆内辅助受微操作技术将单个精子直接注入卵细胞浆内辅助受精并成功分娩一活女婴。将精子直接注入卵细胞浆精并成功分娩一活女

55、婴。将精子直接注入卵细胞浆内的技术称为卵浆内单精子注射（内的技术称为卵浆内单精子注射（intracy-toplasmicsperminjection,ICSI）。）。此技术的建立使得少精症或无精症等男性不育此技术的建立使得少精症或无精症等男性不育的治疗成为可能。的治疗成为可能。61u第三代试管婴儿技术：第三代试管婴儿技术：近年来随者胚胎学和分子近年来随者胚胎学和分子遗传学技术的发展，辅助生育技术正逐步向优生方遗传学技术的发展，辅助生育技术正逐步向优生方向演进。在胚胎发育到向演进。在胚胎发育到610细胞阶段取出细胞阶段取出12个个卵裂球或对极体进行遗传学分析，经遗传检测为正卵裂球或对极体进行遗传

56、学分析，经遗传检测为正常的胚胎时才移植入子宫内。常的胚胎时才移植入子宫内。它使一些遗传病的产前诊断提前到胚胎种植前它使一些遗传病的产前诊断提前到胚胎种植前进行。进行。62罗伯特爱德华兹剑剑桥桥大大学学教教授授，英英国国生生理理学学家家，被被誉誉为为“试试管管婴婴儿儿之之父父”。1948年年毕毕业业于于北北威威尔尔士士大大学学农农业业和和动动物物学学专专业业；1955年年获获得得爱爱丁丁堡堡大大学学动动物物基基因因研研究究生生学学位位；1956年年至至1978年年从从事事生生殖殖生生理理学学研研究究，并并成成功功使使世世界界第第一一例例试试管管婴婴儿儿诞诞生生；1983年年至至1984年年创创立

57、立欧欧洲洲人人类类生生殖殖和和胚胚胎胎学学研研究究会会，并并创创办办人人类类生生殖殖杂杂志志；2001年年，由由于于在在人人类类不不育育症症治治疗疗领领域域的的突突出出成成就就，获获得得美美国国阿阿尔尔伯伯特特拉拉斯斯克克医医学学研研究究奖奖。因因创创立立了了体体外外受受精精技技术术独独享享2010年年诺诺贝贝尔尔生生理理学学或或医医学学奖。奖。在在罗罗伯伯特特爱爱德德华华兹兹的的引引领领下下，对对IVF疗疗法法的的研研究究获获得得了了许许多多重重要要发发现现，一一门门新新医医学学领领域域也也由由此此诞诞生生。他他的的贡贡献献代代表表着着现现代代医医学学史史上上的的又一座里程碑。又一座里程碑。

58、到到目目前前为为止止，因因为为IVF而而得得以以出出生生的的人人大大约有四百万。约有四百万。(RobertG.Edwards)63世界第一个试管婴儿路易斯世界第一个试管婴儿路易斯布布朗（朗（1978年年7月月25日出生）和日出生）和自己的孩子卡梅自己的孩子卡梅伦64基本方法和技术基本方法和技术（一）体外受精的基本实验条件（一）体外受精的基本实验条件CO2培养箱：培养箱：CO2浓度、温度及相对湿度是评价培养浓度、温度及相对湿度是评价培养条件好坏的三个重要指标。浓度应为条件好坏的三个重要指标。浓度应为5%6%；最适温；最适温度为度为37，最大波动幅度不应超过，最大波动幅度不应超过0.5；相对湿度应

59、；相对湿度应保持保持95%以上。要对培养箱进行常规监测。以上。要对培养箱进行常规监测。恒温控制台：胚胎操作过程中必须保持工作台的温度恒温控制台：胚胎操作过程中必须保持工作台的温度在在3537：卵子暴露在：卵子暴露在2010min即可导致其纺锤即可导致其纺锤体发生异常。体发生异常。65胚胎培养液：胚胎培养液：需需要要一一定定浓浓度度的的无无机机盐盐来来代代替替输输卵卵管管中中的的无无机机成成分分，以以保保持持相相对对的的pH值值及及渗渗透透压压。一一般般以以碳碳酸酸盐盐/碳碳酸酸氢氢盐盐作作为为缓缓冲冲系系统统，使使用用前前需需置置CO2培培养养箱箱中中过过夜夜，以以保保持持pH值值稳定在稳定在

60、7.37.5.需需要要有有糖糖类类（碳碳水水化化合合物物）作作为为胚胚胎胎发发育育的的能能量量来来源源。在在配配制制和和选选用用胚胚胎胎培培养养液液时时要要根根据据胚胚胎胎发发育育本本身身的的特特点点和和输卵管液与子宫腔液糖类浓度的变化使用不同成分培养液。输卵管液与子宫腔液糖类浓度的变化使用不同成分培养液。需需要要有有蛋蛋白白质质来来源源。目目前前多多数数IVF中中心心以以母母血血血血清清或或脐脐血血血血清清作作为为胚胚胎胎培培养养的的蛋蛋白白质质来来源源，近近年年来来人人血血清清白白蛋蛋白白及及BSA的应用日趋增多。的应用日趋增多。加加入入一一定定量量的的抗抗生生素素，防防止止发发生生细细菌

61、菌感感染染，常常用用青青霉霉素素、链霉素及庆大霉素等。链霉素及庆大霉素等。66（二）胚胎的体外培养（二）胚胎的体外培养卵母细胞的收集：卵母细胞的收集：卵子对外环境的变化比较敏感，卵子对外环境的变化比较敏感，拾卵时动作应尽量做到快速准确，一般取出的卵子在体拾卵时动作应尽量做到快速准确，一般取出的卵子在体外培养外培养4 46h6h后加入精子进行体外受精，如未成熟卵子后加入精子进行体外受精，如未成熟卵子可相应延长孵育时间。可相应延长孵育时间。精子的体外获能：精子的体外获能：精液处理的主要目的是为了去除精液处理的主要目的是为了去除精液中的精浆（抑制精子的体外获能和受精）及其他细精液中的精浆（抑制精子的

62、体外获能和受精）及其他细胞碎片（白细胞和死精子产生的活性氧能诱发精子质膜胞碎片（白细胞和死精子产生的活性氧能诱发精子质膜的过氧化反应，降低膜的流动性，抑制受精过程中精子的过氧化反应，降低膜的流动性，抑制受精过程中精子的融合而影响受精）和污染物，以获得浓缩的获能后精的融合而影响受精）和污染物，以获得浓缩的获能后精子。子。67体体外外受受精精：一一个个卵卵子子与与10万万条条运运动动精精子子在在受受精精皿皿微微液液滴滴中中结结合合，置置CO2培培养养箱箱14-18h后后去去颗颗粒粒细细胞胞观观察察受受精精情情况况。正正常常受受精精卵卵透透明明带带完完整整，胞胞质质均均质质清晰，可见两个原核和两个极

63、体。清晰，可见两个原核和两个极体。卵卵裂裂观观察察：约30h左右，受精卵完全分裂为两个细胞，即两个卵裂球的胚胎，大卵裂球演变为胚体，小卵裂球演化为绒毛膜和胎盘的一部分。受受精精卵卵逐逐渐渐由由二二细细胞胞、四四细细胞胞发发育育成成多多细细胞胞实实心心球球形形的的桑桑葚葚胚胚，最最后后在在第第五五天天形形成成中中空空的的囊囊胚胚。正正常常而而有有规规律律的的卵卵裂裂是是胚胚胎胎发发育育和和妊妊娠娠的的重重要要前前提提。一般一般90%以上的受精卵会发生卵裂。以上的受精卵会发生卵裂。68（三）胚胎移植：（三）胚胎移植：挑选高质量的胚胎（胚胎发育正常，卵裂球大小挑选高质量的胚胎（胚胎发育正常，卵裂球大

64、小均匀，没有核碎片）用于移植。剩余胚胎用于冷冻均匀，没有核碎片）用于移植。剩余胚胎用于冷冻保存。保存。胚胎从体外培养环境移植到体内并发生妊娠必胚胎从体外培养环境移植到体内并发生妊娠必须具备两个基本条件：一是要有高质量的胚胎，二须具备两个基本条件：一是要有高质量的胚胎，二是子宫内膜要与胚胎的发育相同步。是子宫内膜要与胚胎的发育相同步。一般认为妊娠率与移植高质量胚胎数目成正相一般认为妊娠率与移植高质量胚胎数目成正相关，但当移植胚胎数目超过关，但当移植胚胎数目超过6个时反而下降。个时反而下降。69五、细胞培养在细胞凋亡研究五、细胞培养在细胞凋亡研究 中的应用中的应用细胞凋亡细胞凋亡（apoptosi

65、s）：）：是指由体内外因素触发细是指由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。细胞凋胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。细胞凋亡作为生理性、主动性过程，能够确保正常发育、生亡作为生理性、主动性过程，能够确保正常发育、生长，维持内环境稳定，发挥积极的防御功能。长，维持内环境稳定，发挥积极的防御功能。坏死（坏死（Necrosis）：各种致病因子，干扰和中和各种致病因子，干扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成细胞的意外死亡。了细胞的正常代谢活动，造成细胞的意外死亡。70 细胞凋亡细胞凋亡细胞坏死细胞坏死 单细胞丢失单细胞丢失细胞成群丢失细胞成群丢失外形皱缩变圆，细胞浆失水浓缩外形皱

66、缩变圆，细胞浆失水浓缩 肿胀，外形不规则变化肿胀，外形不规则变化细细胞胞膜膜保保持持完完整整，形形成成泡泡状状，凋凋亡亡后后期期内内陷陷包包裹裹核核物物质质和和细细胞胞器器形形成成凋亡小体凋亡小体破裂破裂核膜完整，核皱缩，染色质固缩，核膜完整，核皱缩，染色质固缩，聚集在核膜下，最后核裂成碎片聚集在核膜下，最后核裂成碎片核核肿肿胀胀破破裂裂，染染色色质质不不规则外移规则外移细细胞胞器器大大多多数数保保持持完完整整，线线粒粒体体肿肿胀，通透性增加，释放细胞色素胀，通透性增加，释放细胞色素多多受受损损，溶溶酶酶体体破破裂裂，线粒体肿胀破裂线粒体肿胀破裂不不发发生生炎炎症症反反应应；被被临临近近正正常常细细胞胞或吞噬细胞吞噬或吞噬细胞吞噬发发生生严严重重炎炎症症反反应应；被被巨噬细胞吞噬巨噬细胞吞噬细胞凋亡与细胞坏死在形态学上的差别细胞凋亡与细胞坏死在形态学上的差别细胞凋亡与细胞坏死在生物化学上的区别细胞凋亡与细胞坏死在生物化学上的区别 细胞凋亡细胞凋亡细胞坏死细胞坏死生理病理因素诱导生理病理因素诱导非生理因素造成的意非生理因素造成的意外损伤外损伤受大分子合成和激活过程的严受大分子合成和激活过