药物分析中的新技术新方法课件

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1、 药物分析中的新技术、药物分析中的新技术、新方法新方法第一节：第一节：手性药物的色谱分析法手性药物的色谱分析法一、手性药物的现状一、手性药物的现状手性药物手性药物（579）药物药物（1992）天然和半天然和半合成药物合成药物（556）合成药物合成药物（1436）非手性药物非手性药物（857）单一异构体单一异构体（73）外消旋体外消旋体（506）手性药物手性药物（547）非手性药物非手性药物（9）单一异构体单一异构体（537）外消旋体外消旋体 （10）二、手性药物对映体的药效学差异二、手性药物对映体的药效学差异1.治疗作用完全依赖一种异构体。治疗作用完全依赖一种异构体。2.药理作用差别不大。药理

2、作用差别不大。如：异丙嗪如：异丙嗪3.药理作用类似，但反应强度有差别。药理作用类似，但反应强度有差别。4.药理与毒理作用存在药理与毒理作用存在“质质”的区别。的区别。三、手性药物对映体的药动学差异：三、手性药物对映体的药动学差异：1.吸收。吸收。2.蛋白结合。蛋白结合。3.代谢。代谢。四、手性衍生化特点：四、手性衍生化特点：l需要高光学纯度的手性衍生化试剂；需要高光学纯度的手性衍生化试剂；l反应繁琐费时；反应繁琐费时；l衍生化反应速率重现性较差；衍生化反应速率重现性较差；l使用价格便宜、柱效较高的非手性柱；使用价格便宜、柱效较高的非手性柱；l衍生化过程可同时纯化样品。衍生化过程可同时纯化样品。

3、1.间接法拆分对映异构体即衍生化试间接法拆分对映异构体即衍生化试 剂法（剂法（CDR）。）。2.直接法拆分对映异构体。直接法拆分对映异构体。手性固定相法（手性固定相法（CSP）手性流动相添加剂法（手性流动相添加剂法（CMP）五、手性药物拆分的高效液相色谱五、手性药物拆分的高效液相色谱 法分类：法分类：采用非手性固定相采用非手性固定相如如:柱前衍生化柱前衍生化-反相高效液相色谱法反相高效液相色谱法 拆分酮洛芬对映异构体拆分酮洛芬对映异构体S-()-酮洛芬酮洛芬 R-(-)-酮洛酮洛芬芬 酮洛芬对映体的柱前衍生化示意图酮洛芬对映体的柱前衍生化示意图酮洛芬对映体的柱前衍生化方法：酮洛芬对映体的柱前衍

4、生化方法：酮洛芬对照品酮洛芬对照品溶液溶液(1 mg/mL)0.1 mL加入正己烷加入正己烷0.6 mL二氯亚砜溶液二氯亚砜溶液0.2 mL751 h冷却至冷却至室温室温吹干后加入吹干后加入S-NEA溶液溶液0.2 mL5 min振摇振摇加入加入2.0 mol/L H2SO4 0.5 mL混匀混匀吹干后溶解进样吹干后溶解进样二氯甲烷二氯甲烷:乙醚乙醚2:1色谱条件色谱条件色谱柱：色谱柱：Hypersil C18,5 m,150 5.0mm ID，流动相：乙腈流动相：乙腈 水水-乙酸乙酸-三乙胺三乙胺 (55:45:0.1:0.02，v/v)，流速：流速：1 ml/min,检测波长：检测波长：2

5、54 nm酮洛芬对映体衍生化物色谱图：酮洛芬对映体衍生化物色谱图：RS酮洛芬对映体衍生化物的保留时间为酮洛芬对映体衍生化物的保留时间为tRs=7.3 min，tRr=8.5 min，分离度为，分离度为1.9常用的手性固定相：常用的手性固定相：1）Pirkle型相型相.2）合成多聚相合成多聚相.3）环糊精键合相环糊精键合相.特点特点:1）适用范围广）适用范围广2）制备分离方便）制备分离方便3）定量分析的可靠性高）定量分析的可靠性高4）价格昂贵）价格昂贵奈基乙脲键合硅胶柱拆分苏氨酸（奈基乙脲键合硅胶柱拆分苏氨酸（A）和苯丙氨酸（和苯丙氨酸（B）的）的p-溴代苯甲酰胺衍生溴代苯甲酰胺衍生物对映体色谱

6、图物对映体色谱图3.手性流动相添加剂法手性流动相添加剂法-CMP 将将手手性性试试剂剂添添加加到到流流动动相相中中，利利用用手手性性试试剂剂与与药药物物消消旋旋物物中中各各对对映映体体结结合合的的稳稳定定常常数数不不同同，以以及及药药物物与与结结合合物物在在固固定定相相上上分分配配的的差差异异，实现对映体的分离。实现对映体的分离。常用的手性添加剂：常用的手性添加剂：1）配基交换型手性添加剂配基交换型手性添加剂2）手性离子对络合剂）手性离子对络合剂3）环糊精添加剂）环糊精添加剂(CD)17特点：特点：1）可采用普通的非手性固定相）可采用普通的非手性固定相2）不需对样品进行衍生化）不需对样品进行衍

7、生化3）手性添加物的可变范围较宽）手性添加物的可变范围较宽第二节：第二节：高效毛细管电泳高效毛细管电泳（HPCE）毛毛细细管管电电泳泳（Capillary electrophoresis,CE）也也称称高高效效毛毛细细管管电电泳泳（HPCE）或或毛毛细细管管电电分分离离法法（CESM），是是一一种种以以毛毛细细管管为为分分离离通通道道，以以高高压压直直流流电电场场为为驱驱动动力力的的新新型型液液相相分分离离分分析析技技术术。由由于于CE可可以以分分离离从从离离子子到到中中性性分分子子；从从小小分分子子到到生生物物大大分分子子的的一一系系列列化化合合物物，尤尤其其是是以以生生物物工工程程为为代代

8、表表的的生生命命科科学学领领域域中中的的多多肽肽、蛋蛋白白质质、DNA的的分分离离。因因此此，CE被被认认为是当代分析科学中最具活力的前沿研究领域。为是当代分析科学中最具活力的前沿研究领域。高压电源高压电源毛细管恒温系统毛细管恒温系统检测器检测器数数据据处处理理系系统统毛毛细细管管缓冲液缓冲液/样品样品缓冲液缓冲液（+）()毛细管电泳装置示意图毛细管电泳装置示意图 在柱检测器在柱检测器 HPCE是是经经典典电电泳泳技技术术与与现现代代微微柱柱分分离离相相结结合合的一种快速、高效的液相分离技术。具有以下特点：的一种快速、高效的液相分离技术。具有以下特点：1.高效率：柱子长，故理论塔板数大。高效率

9、：柱子长，故理论塔板数大。2.高高灵灵敏敏度度：CE分分离离后后一一般般用用激激光光诱诱导导荧荧光光检检测测法法（LIF）或或安安培培电电化化学学检检测测法法（EC），可可检检测测到到10-19mol/L，甚至到单细胞检测。，甚至到单细胞检测。2.高速：做一个样只需几十秒到几十分钟。高速：做一个样只需几十秒到几十分钟。3.微量：进样微量：进样1 L即可。即可。4.低成本：低成本：5.易于自动化：易于自动化：（一）基本原理：（一）基本原理：v=veo+vep=(eo+ep)E veo:电渗流速度；电渗流速度；eo:电渗流淌度电渗流淌度 vep:电泳流速度；电泳流速度；ep:电泳流淌度电泳流淌度E

10、：电场强度；：电场强度；v:迁移速度迁移速度+()(+)电渗产生示意图：电渗产生示意图：()+-毛细电泳中不同组分的迁移示意图：毛细电泳中不同组分的迁移示意图：(+)27 （二）主要分离模式：（二）主要分离模式：1.毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（CZE）；）；2.胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱 （MECC）；）；3.毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGE）；）；4.毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳 （CIEF）；）；1.毛细管区带电泳：毛细管区带电泳：（capillary zone eletrophoresis,CZE）是最基本、最常用的分离模式。是最基本、最常用的分离模式。适用于

11、所有具有不同淌度的荷适用于所有具有不同淌度的荷电粒子的分离，但不能分离中性电粒子的分离，但不能分离中性物质及质荷比相同的组分。物质及质荷比相同的组分。2.胶束电动毛细管色谱：胶束电动毛细管色谱：（micellar eletrokinetic capillary chromatography,MECC）用离子胶束溶液代替简单的缓冲溶用离子胶束溶液代替简单的缓冲溶液，使中性组分可按其疏水性的不液，使中性组分可按其疏水性的不同及在两相间的分配系数的不同而同及在两相间的分配系数的不同而分离。采用手性分配相，可用于手分离。采用手性分配相，可用于手性化合物的分离。性化合物的分离。3.毛细管凝胶电泳：毛细管

12、凝胶电泳：（capillary gel eletrophoresis,CZE）凝胶的网络结构对溶质具有分子筛凝胶的网络结构对溶质具有分子筛的作用，可分离质荷比相同但分子的作用，可分离质荷比相同但分子大小不同的组分。大小不同的组分。在分子生物学和蛋白质化学上有着在分子生物学和蛋白质化学上有着十分广泛的应用。十分广泛的应用。4.毛细管等电聚焦电泳：毛细管等电聚焦电泳：（capillary isoelectric focusing,CIEF）根据蛋白质的等电点不同而进行分离。根据蛋白质的等电点不同而进行分离。AAAAAABBBBBBCCCCDDDDDEEEEEFFAAAABBBBCCCCDDDDEE

13、EEFFFFpH梯度梯度高高低低模式模式缓冲液体系缓冲液体系分离机理分离机理CZE自由缓冲液自由缓冲液离子淌度离子淌度MECC胶束缓冲溶胶束缓冲溶液液疏水性疏水性/离子性离子性相互作用相互作用CGE凝胶缓冲溶凝胶缓冲溶液液分子大小和分子大小和荷电数目荷电数目CIEF两性电解质两性电解质等电点等电点分离模式小结：分离模式小结：毛细管区带电泳毛细管区带电泳胶束动电毛细管色谱胶束动电毛细管色谱毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦应用：应用：1.监测药物生产过程监测药物生产过程 如：监测青霉素发酵液中有关如：监测青霉素发酵液中有关物质的量。物质的量。青霉素发酵液的高效毛细管电泳图：

14、青霉素发酵液的高效毛细管电泳图：1.青霉素青霉素G钠钠；2.6-APA；3.对羟基苯乙酸对羟基苯乙酸；4.邻羟基苯乙酸邻羟基苯乙酸；5.苯乙酸苯乙酸2.中药成分分析中药成分分析 如：黄酮及其甙类分析如：黄酮及其甙类分析黄黄芩中芩中6种黄酮类成分的胶束电动毛细管色谱分离图：种黄酮类成分的胶束电动毛细管色谱分离图：1.汉黄芩甙；汉黄芩甙；2.黄芩素；黄芩素；3.黄芩甙；黄芩甙；4.千层子素；千层子素；5.汉黄芩素；汉黄芩素；6.内标水杨酸；内标水杨酸；7.白杨素白杨素3.手性拆分手性拆分4.体内分析体内分析第三节：质谱法及其应用第三节：质谱法及其应用进样系统进样系统离子源离子源质量分析器质量分析器

15、检测器检测器控制和数据控制和数据处理系统处理系统真空系统真空系统一、离子源及离子化技术一、离子源及离子化技术 1、EI（电子轰击离子化）（电子轰击离子化）V加速电压试样蒸汽阴极阳极电子束离子xyz电子轰击质谱示意图：电子轰击质谱示意图：l 优点：优点：灵灵敏敏度度高高，有有丰丰富富的的碎碎片片离离子子信信息息和和成成熟熟的的离离子子开开裂裂理理论论，是是结结构构分分析析、鉴鉴定定的的有有力力手手段段；重重现现性性好好，有有标标准准图图谱谱，可可以以通过谱库检索对未知物进行结构鉴定。通过谱库检索对未知物进行结构鉴定。l 缺点：缺点：样品须汽化后才可离子化样品须汽化后才可离子化l 适用化合物：适用

16、化合物：易挥发、热稳定化合物。易挥发、热稳定化合物。2、CI（化学离子化）（化学离子化）软电离技术软电离技术l 优点：优点：可以得到较强的准分子离子峰，有利可以得到较强的准分子离子峰，有利于分子量的测定。于分子量的测定。l 缺点：缺点：样品须汽化后才可离子化。样品须汽化后才可离子化。l 适用化合物：适用化合物：易挥发、热稳定化合物易挥发、热稳定化合物 。+快原子枪快原子枪样品靶样品靶原子束原子束质量分析器质量分析器二次离子束二次离子束快原子轰击质谱示意图快原子轰击质谱示意图:3、FAB（快原子轰击离子化）（快原子轰击离子化）软电离技术：软电离技术：FAB的特点：的特点：l l 优点：优点：样品

17、不须汽化；既给出化合物的分子样品不须汽化；既给出化合物的分子量信息，又给出结构信息。量信息，又给出结构信息。适用范围广，仪适用范围广，仪器商品化较早，普及率高。器商品化较早，普及率高。l 缺点：缺点：重现性差，灵敏度较重现性差，灵敏度较EI低。低。l l 适用化合物：适用化合物：极性、高分子量、非挥发性及热不稳定化合物。极性、高分子量、非挥发性及热不稳定化合物。4、MALDI（基质辅助激光解吸离子化）（基质辅助激光解吸离子化）软电离技术软电离技术l 优点：优点：通常只给出分子离子峰（或准分子离子通常只给出分子离子峰（或准分子离子 峰）。峰）。l 适用化合物：适用化合物：蛋白质、多肽、寡核苷酸等

18、生物大分子。蛋白质、多肽、寡核苷酸等生物大分子。5、API（大气压离子化）（大气压离子化）软电离技术软电离技术 （1）ESI（电喷雾离子化）（电喷雾离子化）l 特点：特点：能够产生多电荷离子。能够产生多电荷离子。l 适用化合物：适用化合物：对生物大分子及其他分子量大的对生物大分子及其他分子量大的 化合物的分析较有利。化合物的分析较有利。+毛细管毛细管+4kV含离子的液滴含离子的液滴随液滴蒸发，随液滴蒸发，电场加强，离电场加强，离子向表面移动子向表面移动离子从表面蒸发离子从表面蒸发离子蒸发机理：离子蒸发机理：（2）APCI（大气压化学离子化）（大气压化学离子化）最软的电离方式之一最软的电离方式之

19、一l 特点：特点：一般只给出化合物的分子量信息，通过一般只给出化合物的分子量信息，通过源内源内 CID（碰撞诱导分解）可同时获得（碰撞诱导分解）可同时获得结构信息。结构信息。l 适用化合物：适用化合物：与与ESI比较，更适于分析极性及分子量比较，更适于分析极性及分子量 小（小（1000 amu）的化合物。）的化合物。反应气等离子体Corona放电电极真空样品+溶剂雾化气加热管APCI电离原理：电离原理：二、质量分析器及质量分离原理二、质量分析器及质量分离原理 1、扇型磁场质谱仪。、扇型磁场质谱仪。2、四极质谱仪。、四极质谱仪。3、飞行时间质谱仪。、飞行时间质谱仪。4、离子阱质谱仪。、离子阱质谱

20、仪。亲子鉴定亲子鉴定方法亲子鉴定方法 亲亲子子鉴鉴定定就就是是利利用用医医学学、生生物物学学和和遗遗传传学学的的理理论论和和技技术术，从从子子代代和和亲亲代代的的形形态态构构造造或或生生理理机机能能方方面面的的相相似似特特点点，分分析析遗遗传传特特征征，判判断断父父母母与与子子女女之之间间是是否否是是亲亲生生关系。关系。原始的亲子鉴定方法原始的亲子鉴定方法 外外貌貌对对比比法法：通通过过外外貌貌长长相相的的对对比比来来确确定定亲亲子子关关系系恐恐怕怕是是最最原原始始的的方方法法，但但这这样样方方法法只只是是一一种种猜猜测测、判断，作为一种参考。判断，作为一种参考。滴滴骨骨验验亲亲法法：滴滴骨骨

21、验验亲亲法法就就是是将将生生者者的的血血液液滴滴在在死死人人的的骨骨骸骸上上，若若血血液液能能渗渗透透入入骨骨则则断断定定生生者者与与死死者者有有血血源源关关系系，否否则则就就没没有有。这这种种方方法法并并不不科科学学，但但开创了用血型鉴别血源关系的先河。开创了用血型鉴别血源关系的先河。滴滴血血验验亲亲法法：滴滴血血验验亲亲法法又又称称合合血血验验亲亲法法，就就是是将将小小孩孩的的血血与与大大人人的的血血液液放放在在一一起起，如如果果能能融融在在一一起起，就就是是父父母母亲亲生生的的，否否则则就就不不是是亲亲生生的的。这这种种方方法法没没有有科科学学依依据据，亲亲子子关关系系的的血血液液不不一

22、一定定能能融融合合，而而非非亲子关系的血倒有可能融合。亲子关系的血倒有可能融合。现代的亲子鉴定方法现代的亲子鉴定方法血血型型测测试试：血血型型测测试试进进行行亲亲子子鉴鉴定定就就是是通通过过对对血血型型的的检检验验比比对对来来确确定定亲亲子子关关系系。依依据据19世世纪纪末末被被公公认认的的孟孟德德尔尔遗遗传传定定律律，人人们们认认识识到到人人类类的的血血型型是是按按照照遗遗传传基基因因传传给给下下一一代代，故故一一定定血血型型的的父父母母所所生生子子女女也也具具有相应的血型，这为血型鉴定亲子关系奠定了基础。有相应的血型，这为血型鉴定亲子关系奠定了基础。染染色色体体多多态态性性鉴鉴定定：20世

23、世纪纪80年年代代，医医学学家家们们又又开开创创了了使使用用染染色色体体多多态态性性鉴鉴定定亲亲子子关关系系的的技技术术，染染色色体体多多态态性性又又称称异异态态性性（heteromorphism)，是是指指正正常常人人群群中中常常见见的的各各种种染染色色体体形形态态的的微微小小变变异异（如如：随随体体增增大大、重重复复或或缺缺如如，着着比比粒粒区区的的荧荧光光强强度度变变异异等等），这这种种多多态态是是可可以以遗遗传传的的。这这项项技技术术就就是是利利用用其其形形态态来来鉴鉴定定亲亲子子关关系系，这这要要靠靠技技术术人人员员的的主主观观判判断断，其其准准确确率也不尽如人意。率也不尽如人意。D

24、NA鉴鉴定定：鉴鉴定定亲亲子子关关系系目目前前用用得得最最多多的的是是DNA分分型型鉴鉴定定。人人的的血血液液、毛毛发发、唾唾液液、口口腔腔细细胞胞及及骨骨头头等等都都可可以以用用于于亲亲子子鉴鉴定定。一一个个人人有有23对对（46条条）染染色色体体，同同一一对对染染色色体体同同一一位位置置上上的的一一对对基基因因称称为为等等位位基基因因，一一般般一一个个来来自自父父亲亲，一一个个来来自自母母亲亲。如如果果检检测测到到某某个个DNA位位点点的的等等位位基基因因，一一个个与与母母亲亲相相同同，另另一一个个就就应应与与父父亲亲相相同同，否否则则就就存存在在疑疑问问了了。利利用用DNA进进行行亲亲子

25、子鉴鉴定定，只只要要作作十十几几至至几几十十个个DNA位位点点作作检检测测，如如果果全全部部一一样样，就就可可以以确确定定亲亲子子关关系系，如如果果有有3个个以以上上的的位位点点不不同同，则则可可排排除除亲亲子子关关系系，有有一一两两个个位位点点不不同同，则则应应考考虑虑基基因因突突变变的的可可能能，加加做做一一些些位位点点的的检检测测进进行行辨辨别别。DNA亲亲子子鉴鉴定定，否否定定亲亲子子关关系系的的准准确确率率几几近近100%，肯定亲子关系的准确率可达到，肯定亲子关系的准确率可达到99.99%。从从专专业业角角度度来来讲讲，DNA亲亲子子鉴鉴定定是是根根据据遗遗传传学学原原理理，用用现现

26、代代生生物物技技术术，对对被被鉴鉴定定者者进进行行特特定定DNA片片段段的的提提取取和和检检测，并对结果进行相应的计算分析，得出鉴定结论的过程。测，并对结果进行相应的计算分析，得出鉴定结论的过程。DNA亲亲子子鉴鉴定定的的主主要要方方法法：DNA是是从从几几滴滴血血,腮腮细细胞胞或或培培养养的的组组织织纤纤内内提提取取而而来来，用用畴畴素素将将DNA样样本本切切成成小小段段,放放进进喱喱胶胶内内,用用电电泳泳槽槽推推动动DNA小小块块使使之之分分离离-最最细细的的在在最最远远,最最大大的的最最近近，之之後後,分分离离开开的的基基因因放放在在尼尼龙龙薄薄膜膜上上,使使用用特特别别的的DNA探探针

27、针去去寻寻找找基基因因,相相同同的的基基因因会会凝凝聚聚于于一一,然然后后,利利用用特特别别的的染染料料,在在X光光的的环环境境下下,便便显显示示由由DNA探探针针凝凝聚聚于于一一的的黑黑色色条条码码。这这种种肉肉眼眼可可见见的的条条码码很很特特别别-一一半半与与母母亲亲的的吻吻合合,一一半半与与父父亲亲的的吻吻合合.这这过过程程重重覆覆几几次次,每每一一种种探探针针用用于于寻寻找找DNA的的不不同同部部位位并并影影成成独独特特的的条条码码,用用几几组组不不同同的的探探针针,可得到超过可得到超过99,9%的父系或然率或分辨率的父系或然率或分辨率.DNA鉴定鉴定的具体步骤：的具体步骤：1.破碎细

28、胞，释放破碎细胞，释放DNA 血血中中的的DNA与与核核蛋蛋白白结结合合，位位于于血血细细胞胞的的细细胞胞核核中中，正正常常情情况况下下是是不不会会释释放放出出来来的的。为为了了使使DNA从从细细胞胞核核中中释释放放出出来来，需需要要向向血血细细胞胞液液中中加加入入蒸蒸馏馏水水，并并且且搅搅拌拌，从从而而使使血血细细胞胞膜膜和和核核膜膜胀胀破破。用用玻玻璃璃棒棒搅搅拌拌可可以以加加速速细细胞胞的的破破裂裂。一一般般510mL的的血血细细胞胞液液加加入入20mL蒸蒸馏馏水水搅搅拌拌5min。释释放放出出来来的的大大量量DNA和和RNA往往往往与与蛋蛋白白质质结结合合在在一一起起，应应用用34层层

29、纱纱布布进进行行过过滤滤，除除去一些颗粒较大的杂质。去一些颗粒较大的杂质。2溶解细胞核内的溶解细胞核内的DNA 在在浓浓度度较较高高的的NaCl溶溶液液中中核核蛋蛋白白容容易易解解聚聚，游游离离出出的的DNA溶溶解解在在溶溶液液中中。在在溶溶液液中中加加入入两两倍倍体体积积的的浓浓度度为为2mol/L的的NaCl溶溶液液，搅搅拌拌1min。注注意意应应沿沿一一个个方方向向搅搅拌，使拌，使DNA充分溶解。充分溶解。3DNA的析出的析出 将将溶溶液液中中的的DNA与与其其他他杂杂质质分分离离，这这一一步步是是关关键键。加加蒸蒸馏馏水水降降低低NaCl溶溶液液浓浓度度，使使DNA析析出出。注注意意加

30、加水水太多、溶液过稀，会使太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。分子又重新溶解。用用34层层纱纱布布对对DNA稀稀释释液液进进行行过过滤滤，滤滤去去蛋蛋白白质质，收收集集DNA的的黏黏稠稠物物。如如果果采采用用离离心心法法，效效果果更更好好。用用4 000 r/min转转速速的的离离心心机机，离离心心15min，除除去去上上清清液液(含含有有蛋蛋白白质质)，留留下下的的沉沉淀淀物物中中含含有有DNA。此此时时注注意意观观察察DNA黏稠物的颜色。黏稠物的颜色。4.DNA的初步纯化的初步纯化如如果果提提取取的的DNA量量不不够够多多且且其其中中含含有有较较多多杂杂质质，会会使使制制取取的的DN

31、A粗粗制制品品不不能能显显示示出出DNA的的本本色色白白色色。需需要要对对DNA粗粗制制品品进进行行简简单单的的提提纯纯，将将DNA黏黏稠稠物物再再溶溶解解，继继续续用用2mol/L的的NaCl溶溶液液20mL溶溶解解DNA黏黏稠稠物物，仍仍旧旧沿沿一一个个方方向向不不停停搅搅拌拌3min，使使DNA充充分分溶溶解解，以以免免损损失失。用用34层层纱纱布布进进行行过过滤滤（或或离离心心），滤滤去去杂杂质质，收收集集含含有有DNA的的滤滤液液。向向滤滤液液中中贴贴壁壁缓缓慢慢加加入入50mL预预冷冷的的体体积积分分数数为为95的的乙乙醇醇，并并用用玻玻璃璃棒棒朝朝一一个个方方向向缓缓慢慢、均均匀

32、匀地地搅搅拌拌，溶溶液液中中会会出出现现DNA丝丝状物。状物。DNA的的纯纯化化还还有有许许多多其其他他方方法法。例例如如，添添加加质质量量分分数数为为25的的十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠(SDS)溶溶液液，使使蛋蛋白白质质变变性性后后与与DNA分分开开。随随后后，加加入入氯氯仿仿异异丙丙醇醇混混合合液液（体体积积比比为为24 1），通通过过离离心心将将蛋蛋白白质质及及其其他他杂杂质质除除去去,取取上上清清液液。可可重重复复上上述述操操作作几几次次，直直至至上上清清液液变变成成透透明明的的黏黏稠稠液液体体。此此外外苯苯酚酚可可以以迅迅速速使使蛋蛋白白质质变变性性，抑抑制制核核酸酸酶酶的的活活性

33、性。利利用用苯苯酚酚处处理理后后，离离心心分分层层，DNA溶溶于于上上层层水水相相，蛋蛋白白质质变变性性存存在在于于酚酚层层中中，这这时时可可用用分分液液漏漏斗斗或或吸吸管管等仪器将二者分开。等仪器将二者分开。5DNA的鉴定的鉴定 二二苯苯胺胺法法：需需要要注注意意的的是是，二二苯苯胺胺试试剂剂在冰箱内可保存在冰箱内可保存6个月，使用前需摇匀。个月，使用前需摇匀。紫紫外外灯灯照照射射法法：用用蒸蒸馏馏水水配配制制质质量量分分数数为为0.05%的的溴溴化化乙乙锭锭(EB)溶溶液液，将将玻玻璃璃棒棒上上缠缠绕绕的的白白色色絮絮状状物物抹抹到到蜡蜡纸纸上上，再再滴滴1滴滴EB溶溶液液染染色色。将将蜡蜡纸纸放放在在紫紫外外灯灯(260nm)下下照照射射(暗暗室室中中)，可可呈呈现现橙橙红红色色的的萤萤光光(DNA的紫外吸收峰在的紫外吸收峰在260nm处处)。电电泳泳法法：此此方方法法适适合合鉴鉴定定纯纯度度较较高高的的DNA。