实验一微生物培养基的配制和灭菌.ppt

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1、微 生 物 学 实 验 进 入 微 生 物 实 验 室 的 注 意 事 项n 1.进 入 实 验 室 必 须 穿 白 大 褂n 2.实 验 室 内 不 准 吃 东 西n 3.在 实 验 室 内 不 要 趴 在 桌 子 上n 4.实 验 完 成 后 值 日 生 留 下 做 好 清 洁 工 作 （ 值 日 工 作 班 委 负责 制 ， 纳 入 实 验 成 绩 ） n 5.离 开 实 验 室 前 洗 手n 6.实 验 现 象 要 隔 天 观 察 的 实 验 ， 必 须 要 按 时 到 实 验 室 记 录实 验 现 象 前 三 次 实 验 安 排n 实 验 一 培 养 基 的 制 备 和 高 压 蒸

2、汽 灭 菌 （ 4学 时 ）n 实 验 二 微 生 物 的 纯 培 养 技 术 （ 4学 时 ）n 实 验 三 微 生 物 形 态 的 观 察 及 革 兰 氏 染 色 （ 4学 时 ） 实 验 报 告 要 求n 一 个 实 验 ， 一 份 实 验 报 告 ， 有 连 续 性 的 实 验 等 到 做完 后 再 写 实 验 报 告 。n 实 验 报 告 内 容 ：1.实 验 项 目 名 称 2.实 验 目 的3.实 验 原 理 4.实 验 材 料 与 器 材5. 实 验 步 骤6.实 验 结 果 与 分 析 （ 即 使 实 验 失 败 也 要 写 好 分 析 ）7.思 考 题 实 验 一培 养 基

3、 的 制 备 和高 压 蒸 汽 灭 菌 一 、 实 验 目 的n 了 解 培 养 基 的 配 制 原 理 和 方 法 ， 掌 握 其 配 制 过程 。n 掌 握 加 压 蒸 汽 灭 菌 法 的 原 理 及 其 使 用 方 法 。n 熟 悉 常 用 培 养 基 的 种 类 及 用 途（ 一 ） 培 养 基 的 制 备 二 .实 验 原 理1. 培 养 基 是 供 微 生 物 生 长 、 繁 殖 、 代 谢 的 混 合 养 料 。 不同 微 生 物 对 营 养 物 质 的 要 求 各 不 相 同 ， 加 之 实 验 和 研究 的 目 的 不 同 ， 所 以 培 养 基 的 种 类 很 多 ， 使

4、用 的 原 料也 各 有 差 异 ， 但 从 营 养 角 度 分 析 ， 培 养 基 中 一 般 含 有微 生 物 所 必 需 的 因 营 养 ： 碳 源 、 氮 源 、 无 机 盐 、 生 长素 以 及 水 分 等 。 另 外 ， 培 养 基 还 应 具 有 适 宜 的 pH值 、一 定 的 缓 冲 能 力 、 一 定 的 氧 化 还 原 电 位 及 合 适 的 渗 透压 。 培 养 基n 培 养 基 ： 是 指 由 人 工 配 制 的 、 适 合 微 生 物 生 长 繁 殖 或产 生 代 谢 产 物 用 的 混 合 营 养 材 料 。n 营 养 配 置 要 求 ： 碳 源 、 氮 源 、

5、无 机 盐 、 能 源 、 生 长 因子 、 水 等 浓 度 适 宜 、 配 比 适 宜n 物 理 化 学 条 件 ： 适 宜 的 培 养 基 pH值 、 一 定 的 渗 透 压 、 一 定 的 水 活 度 和 氧 化 还 原 电 势 等 培 养 基 的 分 类n 根 据 微 生 物 的 种 类 和 实 验 目 的 的 不 同 ， 培 养 基 分 类 可以 按 以 下 方 式 ：n 按 成 分 的 不 同 分n 按 培 养 基 的 物 理 状 态 分 n 按 培 养 基 的 用 途 分 按 照 培 养 基 的 成 分 来 分n 天 然 培 养 基 :主 要 成 分 是 复 杂 的 天 然 有

6、机 物 质n 合 成 培 养 基 :用 化 学 成 分 完 全 了 解 的 纯 化 合 物 药 品 配 制而 成 的 培 养 基n 半 合 成 培 养 基 :以 天 然 有 机 物 作 为 微 生 物 营 养 来 源 的 同时 ， 适 当 补 充 一 些 成 分 已 知 的 化 学 药 品 所 配 制 的 培 养 基 按 照 培 养 基 的 物 理 状 态n 固 体 培 养 基 ： 加 入 凝 固 剂 ， 如 1.5% 2.0%琼 脂n 半 固 体 培 养 基 ： 加 入 少 量 凝 固 剂 ， 如 0.2% 0.5%琼 脂n 液 体 培 养 基 ： 不 含 任 何 凝 固 剂 按 照 培 养

7、 基 的 用 途 分v 基 础 培 养 基 ： 含 有 细 菌 生 长 繁 殖 所 需 的 基 本 营 养 物 质 ，可 供 大 多 数 细 菌 生 长 。v 营 养 培 养 基 （ 加 富 培 养 基 ）v 鉴 别 培 养 基 ： 含 有 特 定 化 合 物 或 试 剂 。 某 种 微 生 物 在这 种 培 养 基 上 培 养 后 ， 产 生 的 某 种 代 谢 产 物 与 这 种 特定 的 化 合 物 或 试 剂 能 发 生 某 种 明 显 的 特 征 性 反 应 ， 根据 反 应 结 果 可 以 将 某 种 微 生 物 与 他 种 微 生 物 区 别 开 来 。 v 选 择 培 养 基

8、： 利 用 微 生 物 对 某 种 化 学 物 质 的 敏 感 性 不同 ， 在 培 养 基 中 加 入 这 类 物 质 ， 抑 制 不 需 要 的 微 生 物生 长 ， 而 利 用 所 需 分 离 的 微 生 物 生 长 ， 从 而 达 到 分 离或 鉴 别 某 种 微 生 物 的 目 的 。 培 养 基 灭 菌n 配 制 培 养 的 各 类 营 养 物 质 和 容 器 等 含 有 各 种 微 生 物n 微 生 物 生 长 繁 殖 ：n 消 耗 养 分n 改 变 培 养 的 酸 碱 度 n 产 生 毒 素 或 者 抑 制 物 细 菌 ： pH 7.08.0放 线 菌 ： pH 7.58.5酵

9、 母 菌 ： pH 3.86.0霉 菌 ： pH 4.05.8藻 类 ： pH 6.07.0原 生 动 物 ： pH 6.08.0 初 始 pH通 常 培 养 条 件 ： 琼 脂 是 最 优 良 的 凝 固 剂 ， 自 1880年 开 始 用 于 配 制 微生 物 培 养 基 以 来 ， 至 今 经 久 不 衰 。 实 验 室 的 常 用 培 养 基 ：细 菌 ： 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 ；放 线 菌 ： 高 氏 1号 合 成 培 养 基 培 养 ；酵 母 菌 ： 麦 芽 汁 培 养 基 ；霉 菌 ： 查 氏 合 成 培 养 基 ； 操 作 步 骤1.称 量2.溶 化3.补 足 水

10、 分 ， 调 pH4.（ 过 滤 ）5.分 装 6. 加 塞7. 包 扎8. 灭 菌9. 搁 置 斜 面10. 无 菌 检 查 1.称 量 按 照 培 养 基 配 方 ， 准 确 称 量 各 成 份 放 于 烧 杯 中 。 对 于 不是 粉 状 （ 如 肉 膏 ） ， 应 用 烧 杯 称 量 。培 养 基 配 制 的 基 本 步 骤 2.溶 化 向 烧 杯 中 加 入 适 量 的 水 ， 搅 拌 ， 使 其 溶 解 （ 可 加 热 助溶 ） 。 如 是 配 制 固 体 培 养 基 ， 在 琼 脂 的 溶 化 时 ， 需 不 断 搅 拌 ，并 控 制 火 力 不 要 使 培 养 基 溢 出 或

11、烧 焦 。 待 完 全 溶 化 后 ， 补 足所 失 水 分 。 如 果 配 方 中 含 有 淀 粉 ， 先 将 淀 粉 用 少 量 冷 水 调 成 糊 状 并在 火 上 加 热 搅 拌 ， 然 后 加 足 水 分 及 其 他 药 品 ， 待 完 全 熔 化 后补 足 所 失 水 分 。 培 养 基 配 制 的 基 本 步 骤 3.调 节 pH值 培 养 基 溶 解 均 匀 并 冷 却 至 室 温 时 用 pH试 纸 测 pH， 然 后 根据 要 求 加 酸 或 碱 （ 一 般 用 1molHcl和 1molNaOH） ， 要 缓 慢 少 量且 多 加 搅 拌 。 培 养 基 配 方 为 自

12、然 pH时 ， 不 用 调 节 。 4.过 滤 用 滤 纸 或 多 层 纱 布 过 滤 ， 一 般 无 特 殊 要 求 可 省 去 。培 养 基 配 制 的 基 本 步 骤 5.分 装 将 制 好 的 培 养 基 分 装 入 试 管 内 或 三 角 瓶 内 ， 管 （ 瓶 ）口 塞 上 棉 塞 。 固 体 培 养 基 要 趁 热 装 。 分 装 时 要 避 免 培 养 基 粘 染 管 （ 瓶 ） 口 ， 引 起 污 染 。 分装 量 可 分 为 下 面 几 方 面 ：（ 1） 斜 面 ： 装 量 为 管 长 的 1/4-1/5。（ 2） 液 体 培 养 基 、 高 层 培 养 基 、 半 固

13、体 培 养 基 ： 装 载 量 不超 过 管 长 的 1/3。（ 3） 三 角 瓶 ： 装 量 不 超 过 容 积 1/2。培 养 基 配 制 的 基 本 步 骤 6-8.加 塞 ， 包 扎 ， 灭 菌 塞 棉 塞 或 橡 胶 塞 ， 用 牛 皮 纸 包 扎 严 实 ， 放 入 高 压 锅 中进 行 灭 菌 。 高 压 蒸 汽 灭 菌 法 ： 是 在 密 闭 的 加 压 容 器 内 进 行 ， 加 热使 器 内 的 水 产 生 蒸 汽 ， 由 于 密 闭 ， 增 加 了 器 内 的 压 力 ， 使水 的 沸 点 升 高 ， 从 而 获 得 高 于 100度 的 蒸 汽 温 度 。培 养 基 配

14、 制 的 基 本 步 骤 9.搁 置 斜 面 当 培 养 基 冷 却 至 50 左 右 时 ， 将 试 管 带 棉 塞 的 一 端 搁在 一 根 木 棒 上 。 搁 置 的 长 度 要 合 适 ， 使 培 养 基 形 成 的 斜 面的 长 度 不 超 过 试 管 总 长 的 一 半 。培 养 基 配 制 的 基 本 步 骤 10.无 菌 检 查 培 养 基 配 置 完 成 后 。 等 待 其 冷 却 至 室 温 然 后 放 于 4 冰箱 ， 第 二 日 需 要 进 行 无 菌 检 查 。三 .操 作 步 骤 及 本 次 实 验 具 体 安 排 培 养 基 配 制 的 基 本 步 骤1、 固 体

15、 培 养 基 （ 平 板 制 作 ）2、 固 体 培 养 基 （ 斜 面 制 作 ）2、 半 固 体 培 养 基3、 液 体 培 养 基 （ 一 ） 平 板 固 体 培 养 基 制 作 1.称 取 一 定 量 的 营 养 琼 脂 到 250ml的 三 角 瓶 中 . 2. 加 入 100mL水 . 3.塞 上 硅 胶 塞 ,用 牛 皮 纸 包 扎 好 ; 4.高 压 蒸 汽 灭 菌 5.灭 菌 后 ,当 培 养 基 冷 却 至 50 左 右 时 ,倾 注 平 皿(每 100ml可 制 备 5-6个 平 皿 ) 6.凝 固 后 放 冰 箱 备 用 （ 二 ） 斜 面 培 养 基 制 作1.称 取

16、 一 定 量 的 营 养 琼 脂 到 100ml的 三 角 瓶 中 .2. 加 入 100mL水 .3. 放 入 水 浴 锅 内 或 放 在 电 热 炉 上 溶 解 .4. 在 空 试 管 内 倒 入 2 3mL已 经 溶 解 好 的 培 养 基 ， 【 注 意尽 量 不 要 让 培 养 基 沾 到 试 管 口 】 塞 好 硅 胶 塞 .5.放 入 烧 杯 中 ,高 压 蒸 汽 灭 菌 .6.摆 斜 面 ,凝 固 后 放 冰 箱 备 用 . 用 于 活 化 菌 种 ，或 培 养 菌 种 的 斜 面用 于 保 存 菌 种 的 斜 面 （ 三 ） 半 固 体 培 养 基 制 作1.按 牛 肉 膏

17、蛋 白 胨 半 固 体 培 养 基 配 方 称 取 相 应 成 分 到 250ml的三 角 瓶 中 .2. 加 入 100mL水 .3. 放 入 水 浴 锅 内 溶 解 .4. 在 空 试 管 内 倒 入 2 3mL已 经 溶 解 好 的 培 养 基 ， 【 注 意 尽 量不 要 让 培 养 基 沾 到 试 管 口 】 塞 好 硅 胶 塞 .5.放 入 烧 杯 中 ,高 压 蒸 汽 灭 菌 .6.凝 固 后 放 冰 箱 备 用 . （ 四 ） 液 体 培 养 基 制 作1.按 牛 肉 膏 蛋 白 胨 液 体 培 养 基 配 方 称 取 相 应 成 分 到 250ml的 三角 瓶 中 .2. 加

18、 入 100mL水 .3. 充 分 溶 解 .4. 在 空 试 管 内 倒 入 2 3mL已 经 溶 解 好 的 培 养 基 ， 【 注 意 尽 量不 要 让 培 养 基 沾 到 试 管 口 】 塞 好 硅 胶 塞 .5.放 入 烧 杯 中 ,高 压 蒸 汽 灭 菌 .6. 冷 却 后 放 冰 箱 备 用 . 各 组 任 务 ：第 1-4组 配 制 固 体 培 养 基 ， 制 平 板 ；第 5.6组 配 制 固 体 培 养 基 ， 制 斜 面 ；第 7,8组 配 制 半 固 体 培 养 基 ；第 9,10组 配 制 液 体 培 养 基 。 n 任 何 一 种 培 养 基 一 经 制 成 就 应

19、 及 时 彻 底 灭 菌 ， 以 备纯 培 养 用 。 一 般 培 养 基 的 灭 菌 采 用 高 压 蒸 汽 灭 菌 。n 常 用 的 灭 菌 的 方 法 有 ： 干 热 灭 菌 、 高 压 蒸 汽 灭 菌 、常 压 蒸 汽 灭 菌 、 常 压 间 歇 式 灭 菌 超 高 温 灭 菌 、 过 滤除 菌 、 辐 射 灭 菌 、 化 学 药 品 灭 菌 等 方 法 。n 本 实 验 培 养 基 的 灭 菌 常 使 用 的 是 高 压 蒸 汽 灭 菌 ， 它是 利 用 高 温 湿 热 空 气 使 菌 体 蛋 白 质 凝 固 变 性 而 达 到灭 菌 的 。（ 二 ） 培 养 基 的 灭 菌 高 压

20、 蒸 气 灭 菌 一 般 培 养 基 : 1.05 Kg/cm2, 121.3 , 15-30 min 含 糖 培 养 基 : 0.56 Kg/cm2, 112.6 , 15-30 min 培 养 基 的 灭 菌 器 皿 的 灭 菌 ： 干 热 空 气 ： 160 ， 2 小 时无 菌 室 的 消 毒 ： 紫 外 光 化 学 药 物 熏 蒸 （ 苯 酚 ； 高 锰 酸 钾 +甲 醛 ） 灭 菌 锅湿 热 灭 菌 使 用 的 设 备 操 作 过 程 加 水 装 锅 盖 盖 加 热 当 压 力 升 为 0.5kg/cm2时 排 放 冷 空 气 正 式 升 压 保 压 （ 1.1kg/cm2， 121 ， 保持 20-30min） 停 止 加 热 自 然 降 压 至 零 排 放 余 汽 开盖 取 出 灭 菌 物 品 趁 热 摆 斜 面 检 验 灭 菌 效 果 。 思 考 题n 培 养 基 配 制 完 成 后 ， 为 什 么 必 须 立 即 灭 菌 ?若不 能 及 时 灭 菌 应 如 何 处 理 ?已 灭 菌 的 培 养 基 如何 进 行 无 菌 检 查 ? 实 验 报 告三 次 实 验 后 上 交