第九章海洋分子生态学

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1、第九章海洋分子生态学第九章海洋分子生态学 李永峰李永峰 教授教授刘瑞娜刘瑞娜 研究生研究生目录目录海洋分子生态学导论海洋分子生态学导论1我国的海洋微型生物我国的海洋微型生物2海洋细菌生态学研究海洋细菌生态学研究3主要分子生物学技术主要分子生物学技术4导论导论v海洋分子生态学就是用分子生物学的原理与方法在分子水平上研究海洋中的生态学问题。对于海洋资源环境问题，微型生物的生态过程有着特殊的意义。以分子生物学技术研究海洋微型生物的生态适应和生态功能，极大地促进了海洋生态领域的发展。原绿球藻原绿球藻二乙烯基叶绿素二乙烯基叶绿素以培养海洋微藻的K培养基培养。特点：以EDTA作为鳌合剂，且不含铜分离与培养

2、PR02培养基很有效的分离培养基细胞结构细胞结构生理特征生理特征光合光合营养营养温度温度氮源氮源：不利不利用硝用硝态态氮氮磷磷：限制性限制性的的营营养元素养元素之一之一铁铁：“高氮高氮低叶绿素低叶绿素”？原绿球藻生原绿球藻生长最好的水长最好的水层随营养盐层随营养盐跃层的变化跃层的变化而变化而变化对光强敏感对光强敏感细胞分裂受温度的严格控制细胞分裂受温度的严格控制丰度高峰出丰度高峰出现现于夏秋季于夏秋季，丰，丰度低谷出现于度低谷出现于冬春季；表现冬春季；表现在丰度和深度在丰度和深度的分布的分布分布范分布范围围广泛、广泛、数量极大数量极大；主；主要栖息地大洋要栖息地大洋贫营养海区；贫营养海区；受海

3、水温度的受海水温度的调控调控垂直分布垂直分布类类型型随地理位置、随地理位置、季季节节及水文条及水文条件的件的变变化而表化而表现现出差异出差异，随，随氮跃层变化氮跃层变化原绿球藻原绿球藻自然生态学自然生态学自然地自然地理分布理分布季节变季节变动规律动规律垂直分垂直分布特征布特征原绿球藻的分子生态学原绿球藻的分子生态学从分子遗传学水平揭示其不同株系从分子遗传学水平揭示其不同株系之间的细微差别之间的细微差别，MED4与与MIT9313明显的昼夜节律，明显的昼夜节律，DNA复制复制发生在傍晚时，细胞分裂发生在傍晚时，细胞分裂在夜间完成在夜间完成碳、氮、磷、铁的代谢碳、氮、磷、铁的代谢光的可得性，随光的

4、可得性，随水深垂直变化的水深垂直变化的多样性大于水平多样性大于水平分布的多样性分布的多样性不同生态型的基因组比较不同生态型的基因组比较细胞分裂及细胞分裂及DNA复制的分子生物学复制的分子生物学原绿球藻营养分子生态学原绿球藻营养分子生态学原绿球藻的光适应及分子生态学原绿球藻的光适应及分子生态学中国海的原绿球藻生态学中国海的原绿球藻生态学原原原原绿绿绿绿球藻在球藻在球藻在球藻在中中中中国海区的大量存在国海区的大量存在国海区的大量存在国海区的大量存在 （1 1）分布及分布及分布及分布及动态变动态变动态变动态变化化化化三种三种显显著不同的著不同的类类型型：东海，丰度在表层：东海，丰度在表层上最大，向下

5、逐渐减少；南海的深海区域，上最大，向下逐渐减少；南海的深海区域，丰度极大值存在于表层以下；东海黑潮水丰度极大值存在于表层以下；东海黑潮水域，垂直分布无明显的最大值层域，垂直分布无明显的最大值层（2 2）生态地位）生态地位）生态地位）生态地位原绿球藻是超微型自养生物中碳生物量的原绿球藻是超微型自养生物中碳生物量的主要贡献者，高增长速率，营养物质循环主要贡献者，高增长速率，营养物质循环和能量流动中扮演着重要角色。和能量流动中扮演着重要角色。（3 3）分子生态学）分子生态学）分子生态学）分子生态学南海原绿球藻遗传多样性非常丰富南海原绿球藻遗传多样性非常丰富 聚球藻聚球藻聚球藻聚球藻(Synechoc

6、occus)是海洋蓝细菌是海洋蓝细菌的主要代表性类群之一，为超微型光合自养的主要代表性类群之一，为超微型光合自养原核生物，其主要特征色素为藻红蛋白原核生物，其主要特征色素为藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)聚球藻聚球藻的细胞生理学的细胞生理学藻胆蛋白藻胆蛋白温度和营养温度和营养细胞形态与结构特征细胞形态与结构特征球状或短棒状球状或短棒状，体，体积很小，在同一平积很小，在同一平面上以一分为二的面上以一分为二的方式进行横向分裂，方式进行横向分裂，一般以单细胞的形一般以单细胞的形式存在。有藻胆体、式存在。有藻胆体、羧化体、小囊泡和羧化体、小囊泡和核糖体物质，具有核糖体物质，具有运动功能运动

7、功能藻胆蛋白藻胆蛋白聚球藻聚球藻光捕获色素的原因。光捕获色素的原因。一类为红色的藻红一类为红色的藻红蛋白蛋白(PE)，另一种，另一种为蓝色的藻蓝蛋白为蓝色的藻蓝蛋白(PC)。最适生长温度一般最适生长温度一般为为2026；利用铵或硝酸盐作利用铵或硝酸盐作为为氮源氮源；S除了用于构成蛋除了用于构成蛋白质外，还被用于白质外，还被用于形成脂质（油脂）形成脂质（油脂）磷磷出现在低分子量出现在低分子量的复合物和的复合物和RNA中中对对微量元素微量元素需求低需求低聚球藻的自然生态学聚球藻的自然生态学聚球藻的垂直分布聚球藻的垂直分布富含富含PE的聚球藻丰度的聚球藻丰度最大最大值值常出常出现现在次表在次表层层聚

8、球藻丰度随地理位聚球藻丰度随地理位置的变化置的变化PE株系的聚球藻丰株系的聚球藻丰度随地理位置的不同度随地理位置的不同而有所变化数量随纬而有所变化数量随纬度增加而降低；度增加而降低；聚球藻的丰度也随季聚球藻的丰度也随季节的变化而变化节的变化而变化聚球藻的分子生态学聚球藻的分子生态学研究方法研究方法纯培养的研究法纯培养的研究法原位研究法原位研究法流式细胞技术与分子生物学技术相结合的研究法流式细胞技术与分子生物学技术相结合的研究法遗传多样性遗传多样性MC-A 组：含藻红蛋白，生长需高盐组：含藻红蛋白，生长需高盐Na+、Cl-、Mg2+、Ca2+，在近海和大洋的透光层数量丰富；，在近海和大洋的透光层

9、数量丰富；MC-B组：含藻蓝蛋白、不含藻红蛋白、多见于近岸组：含藻蓝蛋白、不含藻红蛋白、多见于近岸MC-C 组：以低组：以低G+C含量为显著特点含量为显著特点对环境的对环境的生理响应生理响应分子标记能在基因转录和蛋白质水平上指示聚球藻对低分子标记能在基因转录和蛋白质水平上指示聚球藻对低营养浓度的胁迫反应或光强变化的反应营养浓度的胁迫反应或光强变化的反应。分子生物学分析所产生的大量分子数据，使得聚球藻以分子生物学分析所产生的大量分子数据，使得聚球藻以及其他海洋微型生物生态方面的研究获得了空前的进步及其他海洋微型生物生态方面的研究获得了空前的进步聚球藻的分子生态学聚球藻的分子生态学v目前已目前已绘

10、绘出了原出了原绿绿球藻和聚球藻球藻和聚球藻(运运动动型聚球藻菌株型聚球藻菌株WH8102)的的基因基因组组序列序列图图v聚球藻菌株聚球藻菌株WH 8103基因组约有基因组约有240万个碱基对，构成了约万个碱基对，构成了约2500多个开放读码框（多个开放读码框（ORFs）v随着今后对更多聚球藻菌株全基因随着今后对更多聚球藻菌株全基因组的测序和分析，进一步了解它们组的测序和分析，进一步了解它们与环境、生物的关系，有助于更好与环境、生物的关系，有助于更好地解决资源和环境问题。地解决资源和环境问题。聚球藻遗传多样聚球藻遗传多样聚球藻遗传多样聚球藻遗传多样性与其生理特性、性与其生理特性、性与其生理特性、

11、性与其生理特性、生态型间的关系生态型间的关系生态型间的关系生态型间的关系聚球藻基因组研聚球藻基因组研聚球藻基因组研聚球藻基因组研究究究究 v聚球藻聚球藻遗传遗传多多样样性与某些生性与某些生态态型及型及生理特征有相关性生理特征有相关性v用用rpoCl基因序列分析法基因序列分析法研究表明：研究表明：同一生态型（表层）的聚球藻在遗同一生态型（表层）的聚球藻在遗传上未必一致传上未必一致v用荧光分光光度分析法对用荧光分光光度分析法对PE定量研定量研究的结果表明：究的结果表明：PUB/PEB比值与比值与菌株所在深度有关菌株所在深度有关v根据根据16S-23SrDNA序列差异研序列差异研究表明：在遗传上相近

12、的自然群体究表明：在遗传上相近的自然群体中的聚球藻包含了许多共存的生态中的聚球藻包含了许多共存的生态型型v还有其他遗传上相近的菌株在生理还有其他遗传上相近的菌株在生理上的差异性上的差异性中国海的聚球藻生态学中国海的聚球藻生态学聚球藻水平分布从总体来讲是近海高于外海聚球藻水平分布从总体来讲是近海高于外海；垂直方向上分布层次相对较浅垂直方向上分布层次相对较浅，也呈现出梯，也呈现出梯度分布，最大丰度值一般出现在近表层；度分布，最大丰度值一般出现在近表层；聚球藻的分布受营养盐、光照、温度等的影聚球藻的分布受营养盐、光照、温度等的影响；响；具有明显的季节变化特征。具有明显的季节变化特征。海洋细菌生态学研

13、究海洋细菌生态学研究主要类群主要类群海洋生态作用海洋生态作用中国海细菌生态学中国海细菌生态学大多数的海洋细大多数的海洋细大多数的海洋细大多数的海洋细菌是异养细菌菌是异养细菌菌是异养细菌菌是异养细菌变形细菌变形细菌变形细菌变形细菌 噬纤维菌属噬纤维菌属噬纤维菌属噬纤维菌属-黄杆黄杆黄杆黄杆菌类群菌类群菌类群菌类群=CFB=CFB类类类类群群群群浮霉状菌浮霉状菌浮霉状菌浮霉状菌革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌异养细菌在河口异养细菌在河口异养细菌在河口异养细菌在河口有高值分布，如有高值分布，如有高值分布，如有高值分布，如东海长江口、南东海长江口、南东海长江口、南东海长江口、南海北部珠

14、江口。海北部珠江口。海北部珠江口。海北部珠江口。在东海的丰度普在东海的丰度普在东海的丰度普在东海的丰度普遍高于南海遍高于南海遍高于南海遍高于南海 海洋异养海洋异养海洋异养海洋异养细细细细菌在氮菌在氮菌在氮菌在氮循循循循环环环环中的作用中的作用中的作用中的作用海洋异养海洋异养海洋异养海洋异养细细细细菌在磷菌在磷菌在磷菌在磷循循循循环环环环中的作用中的作用中的作用中的作用海洋异养细菌在硫海洋异养细菌在硫海洋异养细菌在硫海洋异养细菌在硫循环中的作用循环中的作用循环中的作用循环中的作用海洋异养细菌在碳海洋异养细菌在碳海洋异养细菌在碳海洋异养细菌在碳循环中的作用循环中的作用循环中的作用循环中的作用异养细

15、菌在海洋能异养细菌在海洋能异养细菌在海洋能异养细菌在海洋能量循环中的作用量循环中的作用量循环中的作用量循环中的作用主要类群主要类群变形细菌是所有细菌中种类最多变形细菌是所有细菌中种类最多生理特性上最具多样性的类群生理特性上最具多样性的类群噬纤维菌属噬纤维菌属-黄杆菌类群，即黄杆菌类群，即CFB类群形态多种多样，是细菌进化类群形态多种多样，是细菌进化树上一个重要的类群树上一个重要的类群浮霉状菌细胞壁缺少肽聚糖浮霉状菌细胞壁缺少肽聚糖大多数的海洋细大多数的海洋细大多数的海洋细大多数的海洋细菌是异养细菌菌是异养细菌菌是异养细菌菌是异养细菌革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌高（高（G+C）含量和低（）含量和低（

16、G+C）含量两类）含量两类异养细菌在海洋生态系统中的作用异养细菌在海洋生态系统中的作用氮循环氮循环两个主要两个主要过过程是硝化作用和反硝化作用程是硝化作用和反硝化作用还包括利用可溶还包括利用可溶性有机氮过程中对无机氮的吸收和铵的释放性有机氮过程中对无机氮的吸收和铵的释放磷循环磷循环异养细菌都是无机磷（异养细菌都是无机磷（Pi）的主要吸收者）的主要吸收者碳循环碳循环海洋浮游生物是地球上主要的光合作用参与者，是有机海洋浮游生物是地球上主要的光合作用参与者，是有机碳的主要来源，分解转化有机质碳的主要来源，分解转化有机质硫循环硫循环厌氧生物降解过程中硫还原细菌起到很重要的作用厌氧生物降解过程中硫还原细

17、菌起到很重要的作用能量循环能量循环细菌通过光合营养和化能营养采用多种不同的途径进行细菌通过光合营养和化能营养采用多种不同的途径进行能量的循环，合成能量的循环，合成ATP的方式：的方式：基质水平磷酸化基质水平磷酸化呼吸链磷酸化呼吸链磷酸化光合磷酸化光合磷酸化少数红色嗜盐细菌利用光少数红色嗜盐细菌利用光能直接形成质子电荷梯度能直接形成质子电荷梯度中国海异养细菌生态学中国海异养细菌生态学长江口及邻近海域异养细菌的分布及其调控机制长江口及邻近海域异养细菌的分布及其调控机制东海异养细菌的分布及其调控机制东海异养细菌的分布及其调控机制海洋微生物生态学研究的主要分子生物学技术海洋微生物生态学研究的主要分子生

18、物学技术海洋微生物生态学研究的主要分子生物学技术海洋微生物生态学研究的主要分子生物学技术16SrRNADGGE和和TGGE原位原位PCR技术技术环境基因组学技术环境基因组学技术T-RFLP DGGE和TGGE的原理：DGGE 是用尿素和甲酰胺等变性剂配制不是用尿素和甲酰胺等变性剂配制不同同浓度梯度的凝胶，不同浓度梯度的凝胶，不同Tm值的值的DNA在不同浓在不同浓度的变性剂条件下部分解链，导致分子构象度的变性剂条件下部分解链，导致分子构象发生改变，从而影响其电泳迁移率，最终形发生改变，从而影响其电泳迁移率，最终形成位置不同的条带。成位置不同的条带。TGGETGGE是以是以DGGE的原理为的原理为

19、基础，只是利用温度梯度将不同基础，只是利用温度梯度将不同Tm值的各型值的各型DNA加以区分。加以区分。DGGE和和TGGE技术应用中应注意的方面技术应用中应注意的方面注意事项注意事项注意事项注意事项GC-clampGC-clampDGGE/TGGEDGGE/TGGE条带的显色条带的显色条带的显色条带的显色DNADNA片段的片段的片段的片段的解链行为解链行为解链行为解链行为DGGEDGGE和和和和TGGETGGE在微型生物生态学研究中的应用在微型生物生态学研究中的应用在微型生物生态学研究中的应用在微型生物生态学研究中的应用1研究微生物种群结研究微生物种群结构及其动态变化构及其动态变化提提取取DN

20、A，以以DNA为为 模模 板板 PCR扩扩 增增16SrRNA基基因因片片段段，将将混混合合的的PCR产产物物进进行行DGGE或或TGGE，得得到到有有不不同同位位置置组组成成的的DGGE、TGGE指指纹图谱纹图谱2研究有代谢活性的研究有代谢活性的微生物群体结构微生物群体结构DGGE、TGGE被被用于研究生态环境中用于研究生态环境中有代谢活性微生物的有代谢活性微生物的种群结构以及与总微种群结构以及与总微生物群体结构间的比生物群体结构间的比较较3检测检测rRNA基因的基因的异质性用异质性用16SrRNA基因序列基因序列数据估测生物多样性数据估测生物多样性、构建系统进化树以及构建系统进化树以及设计

21、种属特异性探针设计种属特异性探针时要考虑时要考虑16SrRNA基因序列的异质性基因序列的异质性16SrRNA基因序列的扩增分析基因序列的扩增分析产产物物克克隆隆RFLP筛筛选选分分析析和和测测序序引引物物制制备备模模板板Your TextPCR扩增扩增有效地和目标有效地和目标DNA片段杂交并获得片段杂交并获得预期的扩增片段预期的扩增片段 限制性酶切分析限制性酶切分析前前期期处处理理该技术可有效地确定微生物的进化和分类的地位该技术可有效地确定微生物的进化和分类的地位有效地遏制有效地遏制DNA的污染的污染构建克隆构建克隆文库文库实验方法实验方法末端限制性片段长度多态性分析末端限制性片段长度多态性分

22、析T-RFLP技术技术是是将将PCR(聚合聚合酶酶链链式反式反应应)、RFLP（限制性（限制性片段片段长长度多度多态态性）技性）技术术、毛、毛细细管管电电泳技泳技术术和和DNA测测序技序技术术相相结结合的一种全新、有效的微生物群落合的一种全新、有效的微生物群落结结构的分析方法构的分析方法T-RFLP实验的主要流程实验的主要流程提取提取DNA荧光标记的荧光标记的引物进行引物进行PCR扩增扩增纯化浓缩纯化浓缩PCR产物产物消化消化PCR产物产物凝胶或毛细凝胶或毛细管电泳分离管电泳分离酶切产物酶切产物环境基因组学技术环境基因组学技术通过对基因组文库进行分析研究，不仅可以获得通过对基因组文库进行分析研

23、究，不仅可以获得环境样品中微型生物群落的组成信息，还可以通环境样品中微型生物群落的组成信息，还可以通过探针筛选来寻找感兴趣的功能基因或探索未知过探针筛选来寻找感兴趣的功能基因或探索未知的新基因。该技术大大推动了科学家对海洋中微的新基因。该技术大大推动了科学家对海洋中微型生物的多样性、微型生物群体间的相互作用和型生物的多样性、微型生物群体间的相互作用和微型生物系统发育与进化的了解微型生物系统发育与进化的了解BAC文文库库目前在该领域应用最多，目前在该领域应用最多，BAC载体效率高，对大片段的载体效率高，对大片段的DNA可进行稳定和忠实的遗传可进行稳定和忠实的遗传原位原位PCR技术技术主要操作步骤主要操作步骤产物检测产物检测原位原位PCR扩增扩增标本消化标本消化标本标本固定固定原理：原理：原位原位PCR是先通是先通过过在在单细单细胞胞或或组织组织切片上切片上对对特异的特异的DNA序列序列进进行原位行原位PCR扩扩增，然后通增，然后通过过DNA分分子子杂杂交和交和荧荧光光检测检测方法方法进进行行细细胞内特胞内特定核酸序列的定核酸序列的检检出及定位出及定位