基因工程PPT课件2说课讲解

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1、基因工程基因工程PPTPPT课件课件 (2)(2)1、什么是基因？如何分类？什么是基因表达？（1 1）、）、不少教科书给基因下的定义是：基因是脱氧核不少教科书给基因下的定义是：基因是脱氧核糖核酸（糖核酸（DNADNA）分子上的一个特定的片段。）分子上的一个特定的片段。基因：是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列（或核基因：是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列（或核酸片段），它是控制生物性状的功能和结构单位。酸片段），它是控制生物性状的功能和结构单位。（2 2）、根据是否转录和翻译功能可分三类：）、根据是否转录和翻译功能可分三类：一类是既有转录功能又有翻译功能的基因，这类基因一类是既有转录功能又有翻译

2、功能的基因，这类基因是指编码酶和结构蛋白质的结构基因及编码阻是指编码酶和结构蛋白质的结构基因及编码阻 蛋白的蛋白的调节基因（统称为蛋白质基因）；这也是人类基因组调节基因（统称为蛋白质基因）；这也是人类基因组计划中所的功能基因（计划中所的功能基因（26383391142638339114个）。个）。第二类是只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括第二类是只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括编码编码tRNAtRNA和和rRNArRNA的基因；的基因；第三类是既不转录也不翻译的基因，包括启动基因、第三类是既不转录也不翻译的基因，包括启动基因、操纵基因、增强子等（有时也把它称为调控基因）。操纵基因、增

3、强子等（有时也把它称为调控基因）。（3 3）、所以基因表达不能说就是遗传信息经转录和翻）、所以基因表达不能说就是遗传信息经转录和翻译从（译从（DNADNA）传蛋白质的过程。）传蛋白质的过程。基因表达：是基因表现其生物功能所经历的一系列分基因表达：是基因表现其生物功能所经历的一系列分子转化和相互作用的过程。子转化和相互作用的过程。2、什么是基因工程？它产生的背景是什么？它的理论及意义是什么？（1 1）、）、基因工程：应用基因工程：应用DNADNA重组技术，按照人们的意重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物的遗传性，创造新生物物愿，在基因水平上改变生物的遗传性，创造新生物物种，通过工程化为

4、人类提供有用产品及服务的技术。种，通过工程化为人类提供有用产品及服务的技术。遗传工程：是包括基因工程在内的人工改造生物遗传遗传工程：是包括基因工程在内的人工改造生物遗传性的全部技术；性的全部技术；DNADNA重组技术：是采用酶法，将不同来源重组技术：是采用酶法，将不同来源 DNA DNA进行体进行体外切割与连接构成杂种外切割与连接构成杂种DNADNA分子：分子：分子克隆：主要是指分子克隆：主要是指DNADNA分子在宿主细胞内的复制过分子在宿主细胞内的复制过程。三者之间有关系。但是有不同。程。三者之间有关系。但是有不同。（2 2）、一方面是科学发展的必然要求（当时育种工作、）、一方面是科学发展的

5、必然要求（当时育种工作、癌等的治疗都要求科技应有所突破）；癌等的治疗都要求科技应有所突破）；另一方面是有关基因结构与功能的基础理论研究的重另一方面是有关基因结构与功能的基础理论研究的重大突破和技术的必然结果。大突破和技术的必然结果。（3 3）、意义）、意义：基因重组技术使人类可以打破物种之间：基因重组技术使人类可以打破物种之间遗传物质转移交换的天然屏障；跨越生物远缘不能杂遗传物质转移交换的天然屏障；跨越生物远缘不能杂交的鸿沟，使人类有计划、有目的地进行在物种间甚交的鸿沟，使人类有计划、有目的地进行在物种间甚至在动物、植物、微生物之间的基因杂交，达到有选至在动物、植物、微生物之间的基因杂交，达到

6、有选择和定向性改变生物的基本性状，或融合进人们所需择和定向性改变生物的基本性状，或融合进人们所需的优良性状，从而获得新的生物制品或制造出新的物的优良性状，从而获得新的生物制品或制造出新的物种。更为重要的是可以运用基基因工程技术方法去了种。更为重要的是可以运用基基因工程技术方法去了解基因的功能以及基因调控的机理等一系列理论问题。解基因的功能以及基因调控的机理等一系列理论问题。另外在人类基因图谱绘制完成后，将有可能为人类征另外在人类基因图谱绘制完成后，将有可能为人类征服各种疾病开辟新的途径。服各种疾病开辟新的途径。一、基因工程的基本工具 基因工程的基本工具：工具酶、基因运载体和受体细基因工程的基本

7、工具：工具酶、基因运载体和受体细胞。胞。（一）、工具酶：基因工程中所使用的酶类。（一）、工具酶：基因工程中所使用的酶类。1 1、限制酶：凡能识别和切割双螺旋、限制酶：凡能识别和切割双螺旋DNADNA分子内特定核分子内特定核苷酸顺序的酶类，全称是限制性核酸内切酶或限制性苷酸顺序的酶类，全称是限制性核酸内切酶或限制性内切酶核酸。内切酶核酸。（1 1）、限制酶的命名：是根属名和种名相结合的原则。）、限制酶的命名：是根属名和种名相结合的原则。如：来自如：来自Haemophilus aeygtius(Haemophilus aeygtius(埃及嗜血杆菌埃及嗜血杆菌)的三种酶的三种酶为：为：HaeHae

8、 、HaeHae、HaeHae;Haemophilus influenzae Rd(Haemophilus influenzae Rd(流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌)的三种酶为：的三种酶为：HindHind 、HindHind、HindHind;Haemophilus influenzae RfHaemophilus influenzae Rf的三种酶为：的三种酶为：Hinf Hinf 、HinfHinf、HinfHinf;当同属不同种的两种菌名前两个字母完全相同时，则当同属不同种的两种菌名前两个字母完全相同时，则其中一种的酶的符号改用种名词头后第一个字母（小其中一种的酶的符号改用种名词头后第一个

9、字母（小写）代替三字母中最后一个字母如：写）代替三字母中最后一个字母如：Haemophilus Haemophilus parainfluenzae parainfluenzae 的二种酶为：的二种酶为：Hpa Hpa 、HpaHpa;而而Haemophilus parahaemolyticus Haemophilus parahaemolyticus 的二种酶为：的二种酶为：Hph Hph 、HphHph。（2 2）、限制酶的分类：）、限制酶的分类：第一型为单一多功能酶，由三种不同的亚基组成，辅第一型为单一多功能酶，由三种不同的亚基组成，辅因子为因子为ATPATP、MgMg2+2+及及S-S

10、-腺苷蛋氨酸，其甲基化位点与识腺苷蛋氨酸，其甲基化位点与识别位点相一致，切割后产生的别位点相一致，切割后产生的DNADNA片段片段55-末端去掉末端去掉磷酰基后形成的羟基末端不能作为多核苷酸激磷酰基后形成的羟基末端不能作为多核苷酸激酶磷酸化的底物，所以不宜作为工具酶。酶磷酸化的底物，所以不宜作为工具酶。第二型第二型 限制酶由两个相同的亚基组成，分子量限制酶由两个相同的亚基组成，分子量在在2-102-10万道尔顿之间，仅具有限作用，辅助因万道尔顿之间，仅具有限作用，辅助因子仅为子仅为MgMg2+2+，识别位点具有旋转对称性，切割位点与，识别位点具有旋转对称性，切割位点与识别一致，其底物为双螺旋识

11、别一致，其底物为双螺旋DNADNA。它是基因工程的理。它是基因工程的理想工具酶。想工具酶。第三型限制酶由两种亚基组成，具有双重功能，辅因第三型限制酶由两种亚基组成，具有双重功能，辅因子为子为ATPATP、MgMg2+2+，也受，也受S-S-腺苷蛋氨酸激活，但不是必需。腺苷蛋氨酸激活，但不是必需。具有特定识别顺序，甲基化位点与识别位点相一致，具有特定识别顺序，甲基化位点与识别位点相一致，其功能还有待研究。其功能还有待研究。第二型限制酶的特点：第二型限制酶的特点：（1 1）、具有很强的底物专一性，其底物只能是双链）、具有很强的底物专一性，其底物只能是双链DNADNA分子，对单链分子，对单链RNAR

12、NA及双链及双链DNA-RNADNA-RNA杂交分子均杂交分子均不起作用；不起作用；（2 2）、具有很强的位点专一性，它的识别位点为）、具有很强的位点专一性，它的识别位点为4-74-7核苷酸序列，甲基化位点就是识别位点，识别位点也核苷酸序列，甲基化位点就是识别位点，识别位点也切割部位；切割部位；（3 3）、位点上核苷酸顺序通常呈双重螺旋结构。）、位点上核苷酸顺序通常呈双重螺旋结构。其切割其切割 方式有三种：方式有三种：EcoREcoR ：5 5GAATTC3GAATTC3 3CT TAAG5 3CT TAAG5 55G AA TTC3 G AA TTC3 G5 3CTT AA G5 3CTT

13、AA Hind Hind ：5 5NAAGCTTN3NAAGCTTN3 3NT TCGA 3NT TCGA NA5 NA5 55NA AGCTTN3NA AGCTTN3 3NTTCGA NA5 3NTTCGA NA5 Sma Sma ：5 5CCCCCCGGGGGG33 3GGG 3GGG CCC5 CCC5 55CCC CCC GGGGGG3 3GGG CCC53 3GGG CCC5 (4)(4)：影响限制酶活性的因素：影响限制酶活性的因素：底物的纯度；底物的纯度；DNADNA的甲基化程度；的甲基化程度；DNADNA分子结构；分子结构；反应温度；反应温度；反应缓冲液。反应缓冲液。终止限制酶反

14、应的方法：加热失活，终止限制酶反应的方法：加热失活，6565保温保温5 5分钟；如是分钟；如是耐热酶，则可用脲、耐热酶，则可用脲、SOSSOS、及胍等变性剂使之失活。、及胍等变性剂使之失活。2、DNA连接酶及T4-DNA连接酶 问题：什么是连接酶？作用机理如何？两种连接酶各问题：什么是连接酶？作用机理如何？两种连接酶各有什么特点？有什么特点？能催化能催化DNADNA片段片段5-5-磷酰基与磷酰基与3-3-羟基形成磷酸二酯键的羟基形成磷酸二酯键的酶。酶。T T4 4-DNA-DNA连接酶是连接酶是T T4 4-噬菌体编码的一种重要连接酶噬菌体编码的一种重要连接酶 机理机理 特点：特点：DNADN

15、A连接酶只能封连接酶只能封T T4 4-DNA-DNA连接酶闭缺口，而不连接酶闭缺口，而不能封闭裂口；只能连接粘性末端，不能连接平整末端。能封闭裂口；只能连接粘性末端，不能连接平整末端。T T4 4-DNA-DNA连接酶具能连接粘性末端，又能连接平整末端。连接酶具能连接粘性末端，又能连接平整末端。但用量大。但用量大。（二）、基因工程载体和受体系统 问题：什么是载体？如何分类？做为载体必须符合哪些条件？基问题：什么是载体？如何分类？做为载体必须符合哪些条件？基因因 工程为什么要用载体？什么是受体、克隆和重组体（重组子）工程为什么要用载体？什么是受体、克隆和重组体（重组子）？载体：能将目的基因运载

16、进生物细胞并在其中自我复制的遗传因载体：能将目的基因运载进生物细胞并在其中自我复制的遗传因子。子。分类分类（P13P13）：）：做为载体必须符合哪些条件：做为载体必须符合哪些条件：在细胞中能自我复制，即本身是复制子在细胞中能自我复制，即本身是复制子可繁殖性；可繁殖性；具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片断后，不影响其本身的复制功能源基因片断后，不影响其本身的复制功能可利用性；可利用性；在基因重组中有在基因重组中有1212个筛选标记从而容易进行选择个筛选标记从而容易进行选择具有便利具有便利性；性；分子小，多拷贝，安全

17、性好，适应性强，容易控制，便于表达分子小，多拷贝，安全性好，适应性强，容易控制，便于表达待。待。在基因工程中，载体一般是用天然质粒或病毒为材料，在基因工程中，载体一般是用天然质粒或病毒为材料，经过人工改造或重新构建而成，改造的目标是增加它经过人工改造或重新构建而成，改造的目标是增加它们作为无性繁殖的有效性及安全性。改造的内容有们作为无性繁殖的有效性及安全性。改造的内容有（1 1）、质粒改小，以增加有效的装载量和拷贝数；）、质粒改小，以增加有效的装载量和拷贝数；1 1、质粒载体（、质粒载体（Plasmid UectorPlasmid Uector）：）：问题：什么是质粒载体？有何生物特征？做为理

18、想的问题：什么是质粒载体？有何生物特征？做为理想的质粒载体是哪一类？质粒载体是哪一类？（1 1）、质粒载体是染色体外能自我复制的双链闭合杂）、质粒载体是染色体外能自我复制的双链闭合杂环状环状DNADNA分子。分子。（2 2）、同学自学。）、同学自学。（3 3）、类型：根据）、类型：根据DNADNA分子中是否含有接合转移基因分子中是否含有接合转移基因 分为接合型质粒和非接合型质粒；分为接合型质粒和非接合型质粒；根据拷贝数多少可分为低拷贝根据拷贝数多少可分为低拷贝“也称为也称为严紧型严紧型”和高拷贝和高拷贝“也称为松驰型也称为松驰型”质粒。质粒。（4 4）、介绍）、介绍PBR322PBR322质粒

19、：质粒：PBR322PBR322质粒最早是由质粒最早是由BoliverBoliver待人构建，多年来广泛采待人构建，多年来广泛采用并经改进，产生了更有用的质粒载体。用并经改进，产生了更有用的质粒载体。PBR322 PBR322质粒质粒是大肠杆菌质粒载体，有万能质粒载体之称。它是由是大肠杆菌质粒载体，有万能质粒载体之称。它是由 PSF2124PSF2124、PMB8PMB8、PSC101PSC101三个亲本质粒经过复杂的重三个亲本质粒经过复杂的重组构成的。组构成的。PSF2124PSF2124带有氨苄青霉素抗菌素基因（带有氨苄青霉素抗菌素基因（AmpAmpr r）；）；PMB8PMB8带有带有C

20、OELCOEL（大肠杆菌素因子大肠杆菌素因子）松驰型复制松驰型复制子；子；PSC101PSC101带有一个四环素抗性基因（带有一个四环素抗性基因（TetTetr r）。）。因此因此PBR322PBR322质粒是一个带有（质粒是一个带有（AmpAmpr r）和（）和（TetTetr r）标记）标记的松驰型质粒载体。的松驰型质粒载体。2 2、噬菌体载体；、噬菌体载体；3 3、病毒载体；、病毒载体；受体：用于扩增载体及目的基因受体：用于扩增载体及目的基因 的细胞。的细胞。克隆：目的基因的扩增过程。克隆：目的基因的扩增过程。重组体（重组子）：携带重组重组体（重组子）：携带重组DNADNA分子的受体细胞

21、。分子的受体细胞。对受体要求：对受体要求：对人体无害：对人体无害：繁殖能力强、生长速度快、从而在短时间内能产生繁殖能力强、生长速度快、从而在短时间内能产生 大量的后代，得到大量的基因拷贝和产物；大量的后代，得到大量的基因拷贝和产物；限制系统缺陷，对外来限制系统缺陷，对外来DNADNA不降解；不降解；有蛋白质的加工修饰能力。如糖基化、氨基化和有蛋白质的加工修饰能力。如糖基化、氨基化和磷酸化等。磷酸化等。二、基因工程的基本操作程序 基因工程是将一个基因片断插入到一个载体中，基因工程是将一个基因片断插入到一个载体中，构成重组体，再导入宿营主细胞进行复制扩增，构成重组体，再导入宿营主细胞进行复制扩增，

22、即进行无性繁殖。因此，任何即进行无性繁殖。因此，任何DNADNA克隆都包括克隆都包括四个步骤：四个步骤：获取载体裁获取载体裁DNADNA和目的基因和目的基因把目的基因和把目的基因和载体在体外连接载体在体外连接将人工构建的重组将人工构建的重组DNA DNA 导入宿主细胞进行扩增导入宿主细胞进行扩增选择与鉴定重组的选择与鉴定重组的克隆。克隆。（一）、目的基因的获得 问题：什么是目的基因？什么是外源基因？获问题：什么是目的基因？什么是外源基因？获得目的基因的方法和原理是什么？得目的基因的方法和原理是什么？目的基因：我们通常将哪些已被或要被分离、目的基因：我们通常将哪些已被或要被分离、改造、扩增或表达

23、的特定基因或改造、扩增或表达的特定基因或DNADNA片段，能片段，能编码某一产物或控制某一性状。编码某一产物或控制某一性状。外源基因：把插入到载体内的那个特定的外源基因：把插入到载体内的那个特定的DNADNA片断。片断。关系：外源关系：外源DNADNA不一定含有目的地基因。不一定含有目的地基因。方法：方法：1 1、物理法：、物理法：原理是从几个方面来利用核酸原理是从几个方面来利用核酸DNADNA双螺旋之间存在着双螺旋之间存在着碱基碱基G G和和C C 配对，配对，A A和和T T配对的特性差别，以达到生物配对的特性差别，以达到生物基因分离目的基因的目的。基因分离目的基因的目的。（1 1）、密度

24、梯度离心法：）、密度梯度离心法：（2 2）、单链酶法：）、单链酶法：（3 3）、分子杂交法：）、分子杂交法：2 2、化学法合成基因：、化学法合成基因：条件：已知某种基因的核苷酸序列或者根据某条件：已知某种基因的核苷酸序列或者根据某种基因产物的氨基酸序列。种基因产物的氨基酸序列。缺点：反应专一性不强，副反应多，合成片段缺点：反应专一性不强，副反应多，合成片段越长分离纯度化困难，产率越低，而且合成能越长分离纯度化困难，产率越低，而且合成能力有限一般局限于力有限一般局限于150-200bp150-200bp。3 3、化学与酶促相结合的合成法（、化学与酶促相结合的合成法（P20P20）：）：4、从基因

25、文库（gene library）中分离基因 基因文库（基因文库（gene librarygene library）：是指汇聚某一生物）：是指汇聚某一生物染色体所有染色体所有DNADNA序列的重组序列的重组DNADNA群体（转化子群体（转化子群）。它是将一种生物的基因储存在可以长期群）。它是将一种生物的基因储存在可以长期保存的重组体中。保存的重组体中。基因探针：是一段带有放射性或非放射但有其基因探针：是一段带有放射性或非放射但有其它类似放射性标记的与待查基因或其邻近区段它类似放射性标记的与待查基因或其邻近区段的核苷酸顺序互补的核苷酸片断。的核苷酸顺序互补的核苷酸片断。5 5、逆转录法：、逆转录法

26、：逆转录法即利用逆转录酶由逆转录法即利用逆转录酶由mRNAmRNA逆转录合成逆转录合成 的方法。的方法。主要是合成分子量大而又不知道其序列的基因。主要是合成分子量大而又不知道其序列的基因。原因（原因（P23P23）：）：方法：与目的基因的方法：与目的基因的mRNAmRNA为模板为模板借助逆转录酶借助逆转录酶合成互补双链合成互补双链DNADNA分子，即分子，即cDNAcDNA（单链）（单链）再在再在DNADNA聚合酶的作用下合成双链聚合酶的作用下合成双链DNADNA片断片断与适当的与适当的载体结合后转入受体菌载体结合后转入受体菌扩增为扩增为cDNAcDNA文库文库采用采用适当的方法从适当的方法从

27、cDNAcDNA文库中筛选出目的基因。如家兔和文库中筛选出目的基因。如家兔和从的珠蛋白质基因等。从的珠蛋白质基因等。：6、聚合酶链技术（PCR）聚合酶链技术（聚合酶链技术（PCRPCR）是）是19851985年美国加利福尼年美国加利福尼亚的亚的MullisMullis等到人开发的一项专利技术。等到人开发的一项专利技术。定义：是指在四种脱氧核苷三磷酸（定义：是指在四种脱氧核苷三磷酸（dNTPdNTP）存在下，）存在下，以单链以单链DNADNA为模板与寡聚核苷酸为引物，经为模板与寡聚核苷酸为引物，经DNADNA聚合聚合酶催化合成酶催化合成DNADNA互补链的过程。互补链的过程。PCRPCR的操作体

28、系中含有：双链模板的操作体系中含有：双链模板DNADNA（即目的基因）（即目的基因）、热稳定的、热稳定的DNADNA聚合酶；一对引物和合成时所需要的聚合酶；一对引物和合成时所需要的原材料（原材料（dNTPdNTP）方法：高温变性（双链模板方法：高温变性（双链模板DNADNA在在90900 0-95-950 0加热加热30-12030-120分钟）；分钟）；低温退火（低温退火（50-60 50-60 ）适温延伸（适温延伸（72 72）如如如如此再重复循环，则目的此再重复循环，则目的DNADNA片段的数量就呈指数性扩片段的数量就呈指数性扩增。增。（二）、目的基因与载体DNA的连接 问题：什么是基因

29、重组？进行基因重组前应考虑问题：什么是基因重组？进行基因重组前应考虑 哪些哪些问题？基因重组常用的方法有哪些？问题？基因重组常用的方法有哪些？基因重组：就是利用限制酶和其它一些酶基因重组：就是利用限制酶和其它一些酶 类切割和修类切割和修饰载体饰载体DNADNA和目的基因，将两者连接起来，将目的基和目的基因，将两者连接起来，将目的基因插入到自我复制的载体内，再转入受体细胞。以期因插入到自我复制的载体内，再转入受体细胞。以期这种外源性的目的基因能在受体细胞内正确表达。这种外源性的目的基因能在受体细胞内正确表达。考虑的问题：必需结合研究目的基因的特性，认真设考虑的问题：必需结合研究目的基因的特性，认

30、真设 计最终构建的重组体；计最终构建的重组体；实验步骤要尽可能简单易行；实验步骤要尽可能简单易行；采用的方法要使重组体分子在连接混合物中占有较大采用的方法要使重组体分子在连接混合物中占有较大的比例。的比例。方法：方法：1 1、插入灭活法：将外源基因插入选择性标记、插入灭活法：将外源基因插入选择性标记使其灭活的方法使其灭活的方法 。优缺点：是在连接反应中，易产生载体及目的优缺点：是在连接反应中，易产生载体及目的基因的环化作用，以及载体和目的基因自身聚基因的环化作用，以及载体和目的基因自身聚合作用，影响杂合重组体。合作用，影响杂合重组体。2 2、定向克隆法、定向克隆法P26P26：将目的基因按正确

31、的方向：将目的基因按正确的方向插入载体的方法。插入载体的方法。优缺点：不产生自身环化现象，但载体和目的优缺点：不产生自身环化现象，但载体和目的基因仍可产生线性聚合体。基因仍可产生线性聚合体。3 3、同聚物接尾法：在载、同聚物接尾法：在载DNADNA及目的基因两端及目的基因两端分别接上能相互配对的同一个碱基聚合单链的分别接上能相互配对的同一个碱基聚合单链的重组过程。重组过程。优缺点：对载体及外源优缺点：对载体及外源DNADNA的切割部位无特殊的限制，的切割部位无特殊的限制，具有任何末端的具有任何末端的DNA DNA 及载体均可通过此法重组；载体及载体均可通过此法重组；载体与基因均不产生自身环化与

32、线性聚合体；方法简便、与基因均不产生自身环化与线性聚合体；方法简便、应用范围广。应用范围广。若载体和目的基因中间存在裂口，则也可产生同聚作若载体和目的基因中间存在裂口，则也可产生同聚作用，退火时将产生复杂而无感染力的重组分子，影响用，退火时将产生复杂而无感染力的重组分子，影响转化率。转化率。4 4、双接头法：在目的基因两端分别接上不同的化学联、双接头法：在目的基因两端分别接上不同的化学联接器，然后与载体同时用两种不同的限制酶切割，再接器，然后与载体同时用两种不同的限制酶切割，再将切割产物连接的方法。将切割产物连接的方法。方法：在方法：在T T4 4-DNA-DNA连接酶的作用下连接酶的作用下将

33、不同联接器联接将不同联接器联接到目的基因的两端到目的基因的两端经两种不同的限制酶切割后，经两种不同的限制酶切割后，再与载体重组。再与载体重组。5 5、平接法：具有、平接法：具有3-3-羟基和羟基和5-5-磷酸酰基的平末端磷酸酰基的平末端DNADNA片断之间，在片断之间，在T T4 4-DNA-DNA连接酶的作用下，形成共价结合连接酶的作用下，形成共价结合的过程。的过程。优缺点：是优缺点：是DNADNA重组中最简单的一种方法，任重组中最简单的一种方法，任何齐平末端外源何齐平末端外源DNADNA片段及载体之间均可以进片段及载体之间均可以进行重组。在基因工程中用途较大，对于没有交行重组。在基因工程中

34、用途较大，对于没有交错切割位点的外源错切割位点的外源DNADNA片段的重组，具有特别片段的重组，具有特别重要的意义。但反应速度慢，仅为粘接法的重要的意义。但反应速度慢，仅为粘接法的1%1%，T T4 4-DNA-DNA连接酶用量大，为粘接法的连接酶用量大，为粘接法的10-3010-30倍。倍。作业题：在重组实验中，如何防止或消除自身再环化作业题：在重组实验中，如何防止或消除自身再环化作用和线性聚合体？作用和线性聚合体？影响连接效果的因素有哪些？影响连接效果的因素有哪些？（三）、重组DNA导入宿主细胞 问题：体外构建的重组问题：体外构建的重组DNADNA为什么要导入宿主细胞？为什么要导入宿主细胞

35、？P28P28 1 1、重组体、重组体DNADNA的转化或转染：的转化或转染：问题：什么是转化？什么是转染？两者有何异同？什问题：什么是转化？什么是转染？两者有何异同？什么是转化率？什么是转化频率？么是转化率？什么是转化频率？转化（转化（transformationtransformation）：是一种外源）：是一种外源DNADNA分子或片断分子或片断进入受体细胞使后者获得新的遗传性状的过程。进入受体细胞使后者获得新的遗传性状的过程。转染（转染（transfectiontransfection）：裸露的病毒）：裸露的病毒DNADNA或或RNARNA感染寄感染寄主细胞的过程。主细胞的过程。两者之

36、间的关系：两者的不同是两者之间的关系：两者的不同是DNADNA的来源不同。而的来源不同。而过程相同的，过程相同的，也就是说本质上两者之没有根本的差别，也就是说本质上两者之没有根本的差别，所以习惯上人们往往也把转染通称为广义的转化。所以习惯上人们往往也把转染通称为广义的转化。转化率：指转化细胞占受体细胞的比例。转化率：指转化细胞占受体细胞的比例。转化频率：指在受体细胞过量的情况下，重组转化频率：指在受体细胞过量的情况下，重组DNADNA所所能获得的转化子的菌落数。能获得的转化子的菌落数。影响转化率的因素：第一，宿主限制影响转化率的因素：第一，宿主限制-修饰系统的影响；修饰系统的影响；第二，宿主细

37、胞人工感受态形成率对转化率有重大的第二，宿主细胞人工感受态形成率对转化率有重大的影响；影响；第三，重组第三，重组DNADNA的构型与转化率也有关；的构型与转化率也有关；第四，外源基因与宿主染色体第四，外源基因与宿主染色体DNADNA的同源性与转化率的同源性与转化率也有关；也有关；第五，转化体系中重组第五，转化体系中重组DNADNA的浓度与纯度对转化率有的浓度与纯度对转化率有一定的影响。一定的影响。2 2、重组体、重组体DNADNA的体外包装及入噬菌体的转导：的体外包装及入噬菌体的转导：问题：什么是转导？什么是体外包装？体外包装的基问题：什么是转导？什么是体外包装？体外包装的基本原理和方法怎样？

38、本原理和方法怎样？转导：以病毒为介导（载体）将遗传物质从一个细胞转导：以病毒为介导（载体）将遗传物质从一个细胞转移到另一个细胞的过程。转移到另一个细胞的过程。在基因在基因 工程中，是指借助温和噬菌体或病毒的感染作工程中，是指借助温和噬菌体或病毒的感染作用将重组的用将重组的DNADNA转移至宿主细胞的过程。转移至宿主细胞的过程。限制限制 性转导：由温和噬菌体和病毒性转导：由温和噬菌体和病毒DNADNA为载体构成的为载体构成的重组重组DNADNA分子，经体外包装成完整的噬菌体或病毒颗分子，经体外包装成完整的噬菌体或病毒颗粒的转导作用。粒的转导作用。广义转导：任意广义转导：任意DNADNA片断或重组

39、片断或重组DNA DNA 分子经体外包装分子经体外包装完整的噬菌体颗粒的转导。完整的噬菌体颗粒的转导。所谓体外包装：就是在体外将重组的所谓体外包装：就是在体外将重组的DNADNA放置到噬菌放置到噬菌体的外壳里，然后通过正常的噬菌体感染过程，将它体的外壳里，然后通过正常的噬菌体感染过程，将它们导入宿主细胞。们导入宿主细胞。体外包装采用噬菌体感染过的大肠杆菌溶解液，也就体外包装采用噬菌体感染过的大肠杆菌溶解液，也就是包装提取物（是包装提取物（packaging extractpackaging extract）进行的。）进行的。包装提取物（包装提取物（packaging extractpackag

40、ing extract）包括：）包括：E E蛋白：是噬菌体头部的主要成分。蛋白：是噬菌体头部的主要成分。D D蛋白：位于噬菌体头部外侧并与噬菌体头部成熟有关。蛋白：位于噬菌体头部外侧并与噬菌体头部成熟有关。A A蛋白：与入噬菌体蛋白：与入噬菌体DNADNA插入头部，与粘性末端形成插入头部，与粘性末端形成有关。有关。Z Z蛋白：是尾部的主要成分。蛋白：是尾部的主要成分。得到包装提取物的方法得到包装提取物的方法 ：一种是虽然可以从入噬菌体直接提取到包装蛋白，但一种是虽然可以从入噬菌体直接提取到包装蛋白，但是这种方法比较复杂，不能成为常规技术。是这种方法比较复杂，不能成为常规技术。另一种方法另一种方

41、法 是采用是采用E E基因变异株和基因变异株和A A基因变异株（基因变异株（E E-和和A A-）或（）或（E E-和和D D-）的入噬菌体感染大肠杆菌。）的入噬菌体感染大肠杆菌。以入噬菌体作基因载体进行基因克隆有以下优点：以入噬菌体作基因载体进行基因克隆有以下优点：具有很大的外源具有很大的外源DNADNA包容能力，对外源基因的克隆效包容能力，对外源基因的克隆效率高；率高；有非常高的入重组回收率，特别是适用于建立基因库；有非常高的入重组回收率，特别是适用于建立基因库；具有正性筛选性质。具有正性筛选性质。（四）、重组体克隆的筛选与鉴定问题：为什么要对重组体进行筛选和鉴定？为什么要对重组体进行筛选

42、和鉴定？筛选的方法如何？原理如何？筛选的方法如何？原理如何？方法：遗传检测法、核酸杂交法、免疫化学法、物理方法：遗传检测法、核酸杂交法、免疫化学法、物理检测法和检测法和DNADNA顺序法等。顺序法等。依据是根据载体体系、宿营主细胞的特征以及外源基依据是根据载体体系、宿营主细胞的特征以及外源基因在受体细胞表达不同，即：因在受体细胞表达不同，即：直接筛选方法：是针对载体携带的某种标记基因和目直接筛选方法：是针对载体携带的某种标记基因和目的基因而设计的筛选方法。特点是直接测定基因和基的基因而设计的筛选方法。特点是直接测定基因和基因表型。因表型。间接筛选是不直接测定基因，而是利用其它方法，例间接筛选是

43、不直接测定基因，而是利用其它方法，例如利用特异性抗体与目的基因表达产物相互作用对重如利用特异性抗体与目的基因表达产物相互作用对重组体的筛选。组体的筛选。1 1、利用表型、利用表型 特征筛选（遗传检测法）：特征筛选（遗传检测法）：表型表型 是指机体遗传组成同环境相互作用所产生的外观是指机体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其它特征。或其它特征。这些特征一个是克隆载体提供的这是最主要的也是应这些特征一个是克隆载体提供的这是最主要的也是应用最多的；另一个是插入的外源用最多的；另一个是插入的外源DNADNA序列提供的，相序列提供的，相对来说数量较少。对来说数量较少。（1 1）、抗药性标记插入灭活筛选

44、法：）、抗药性标记插入灭活筛选法：原理：原理：特点：是一种简便快速的方法特点：是一种简便快速的方法 。但有时由于试剂或操。但有时由于试剂或操作规程方面的原因，自身环化的载体分子有时也会失作规程方面的原因，自身环化的载体分子有时也会失去特定的遗传标记。去特定的遗传标记。（2 2）、）、-半乳糖苷酶显色反应选择法：半乳糖苷酶显色反应选择法：原理：原理：优点：是更为简单的方法优点：是更为简单的方法 。2 2、利用插入序列提供的表形特征筛选。、利用插入序列提供的表形特征筛选。这种筛选要求：这种筛选要求：（1 1）、克隆的）、克隆的DMADMA片断是一个完整的基因序列；片断是一个完整的基因序列；（2 2

45、）、而且能够在大肠杆菌中实现功能表达。）、而且能够在大肠杆菌中实现功能表达。这无疑是一个很大局限，特别是对真核基因。这无疑是一个很大局限，特别是对真核基因。3 3、利用核酸杂交技术筛选：、利用核酸杂交技术筛选：从基因文库中筛选带有目的基因插入序列的克隆，最广泛应用的从基因文库中筛选带有目的基因插入序列的克隆，最广泛应用的是核酸分子杂交技术。它是根据核酸杂交原理，利用基因探针捡是核酸分子杂交技术。它是根据核酸杂交原理，利用基因探针捡测出培养平板上重组转化体菌落的位置。故也称为原位杂交技术测出培养平板上重组转化体菌落的位置。故也称为原位杂交技术或菌落（噬菌斑）杂交。或菌落（噬菌斑）杂交。核酸杂交技

46、术：用基因探针与样品中的核酸杂交技术：用基因探针与样品中的DNADNA或或mRNAmRNA进行杂交以检测其中是否含有目的基因进行杂交以检测其中是否含有目的基因或目的或目的mRNAmRNA存在的技术。存在的技术。原位杂交技术：让含有重组体的菌落或是噬菌原位杂交技术：让含有重组体的菌落或是噬菌斑，由平板转移到膜上并释放斑，由平板转移到膜上并释放DNA DNA，变性并，变性并固定在膜上，再同固定在膜上，再同DNADNA探针杂交的方法。探针杂交的方法。方法：培养方法：培养影印影印溶菌溶菌固定固定显显色色对号取菌。对号取菌。优点：可以广泛的应用。特别是适合于大量群优点：可以广泛的应用。特别是适合于大量群

47、体的筛选。体的筛选。3 3、利用免疫学方法筛选：、利用免疫学方法筛选：免疫学方法是间接筛选方法，也就是利用特异免疫学方法是间接筛选方法，也就是利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选的抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选的方法。方法。这种方法的优点是特异性强、灵敏度高、特别是适用这种方法的优点是特异性强、灵敏度高、特别是适用于选择不为宿主提供任何选择标记基因的筛选。于选择不为宿主提供任何选择标记基因的筛选。（1 1）、放射性抗体检测方法：）、放射性抗体检测方法：原理：一种免疫血清含有原理：一种免疫血清含有IgGIgG抗体，它们识别抗原分子抗体，它们识别抗原分子的不同决定簇，并分别与各自

48、的抗原决定簇相结合。的不同决定簇，并分别与各自的抗原决定簇相结合。抗体分子或抗体的抗体分子或抗体的F F（abab）部分能够牢固地吸附在固体）部分能够牢固地吸附在固体基质（例如聚已烯等塑料制品）上。而不会被洗脱掉，基质（例如聚已烯等塑料制品）上。而不会被洗脱掉，通过体外碘化作用，通过体外碘化作用，IgGIgG抗体便会被放射性同位素抗体便会被放射性同位素125125I I 标记上。标记上。方法：培养方法：培养影印影印裂菌裂菌覆盖覆盖处理处理获取所需的重组克隆。获取所需的重组克隆。（2）、免疫沉淀检测法 这种方法相对于放射性免疫法来讲，灵敏度要低，而这种方法相对于放射性免疫法来讲，灵敏度要低，而且

49、易受干扰。但是它的价值在于操作简便易行。且易受干扰。但是它的价值在于操作简便易行。方法：在生长菌落的琼脂培养基中，加入专门抗这种方法：在生长菌落的琼脂培养基中，加入专门抗这种蛋白质分子蛋白质分子 的特异性抗体。如果有些菌落的细胞能分的特异性抗体。如果有些菌落的细胞能分泌出目的蛋白，就会在它的周围出现一条叫做沉淀素泌出目的蛋白，就会在它的周围出现一条叫做沉淀素的抗原的抗原-抗体沉淀物所形成抗体沉淀物所形成 的白色园圈。的白色园圈。这种方法的缺点是只能检测分泌出细胞的蛋白质，这这种方法的缺点是只能检测分泌出细胞的蛋白质，这就限制了该法的应用。要用来检测非分泌的蛋白质，就限制了该法的应用。要用来检测

50、非分泌的蛋白质，需要对该法进行改良。需要对该法进行改良。4、转译筛选法 概述：在基因工程中。通过基因重组，筛选的最终目概述：在基因工程中。通过基因重组，筛选的最终目的是获得高表达的基因工程细胞，通过工程化生产有的是获得高表达的基因工程细胞，通过工程化生产有用的物质。因此所获得的重组体能否表达相应产物是用的物质。因此所获得的重组体能否表达相应产物是关键的问题。采用相应的技术检查工程细胞目的产物关键的问题。采用相应的技术检查工程细胞目的产物表达情况是直接最有效的手段。目前用于检查工程细表达情况是直接最有效的手段。目前用于检查工程细胞目的产物表达情况的转录胞目的产物表达情况的转录-翻译系统有：翻译系

51、统有：（1 1）、小细胞转译系统：）、小细胞转译系统：原理：某些大肠杆菌在生长过程中能产生含重组质粒原理：某些大肠杆菌在生长过程中能产生含重组质粒而不含宿主而不含宿主DNADNA的无生命小泡称为小细胞。的无生命小泡称为小细胞。如果小细胞中含有重组质粒，则合成的蛋白质是重组如果小细胞中含有重组质粒，则合成的蛋白质是重组质粒所编码的，故可用于检测重组质粒表达情况。质粒所编码的，故可用于检测重组质粒表达情况。方法：将重组方法：将重组DNADNA转化到能产生小细胞的大肠转化到能产生小细胞的大肠杆菌中，杆菌中，通过选择与培养即可获得含重组通过选择与培养即可获得含重组DNADNA小细小细胞胞用速度沉降法离

52、心，分离出小细胞用速度沉降法离心，分离出小细胞如果表达的产物是蛋白质，则在反应体系中加如果表达的产物是蛋白质，则在反应体系中加入入3535S-met S-met 及其它的氨基酸原料，即合成蛋白质及其它的氨基酸原料，即合成蛋白质然后将合成的产物用然后将合成的产物用SDS-PAGSDS-PAG电泳分析，电泳分析，并进行自显影并进行自显影就可以检测重组质粒表达情就可以检测重组质粒表达情况（如产物的种类、大小与相对含量）。况（如产物的种类、大小与相对含量）。：（2）、大细胞转译系统 应用紫外线多次照射含重组应用紫外线多次照射含重组DNADNA的大肠杆菌细的大肠杆菌细胞，细胞生长停止，染色体不能复制和蛋

53、白质胞，细胞生长停止，染色体不能复制和蛋白质合成终止。这种状态的细胞称为大细胞系统。合成终止。这种状态的细胞称为大细胞系统。方法与小细胞转译系统相同。方法与小细胞转译系统相同。（3 3）、无细胞转译系统：）、无细胞转译系统：无细胞体系是一种具有高水平翻译能力的体外合成反无细胞体系是一种具有高水平翻译能力的体外合成反应系统。这是由具有高水平翻译能力的动、植物及微应系统。这是由具有高水平翻译能力的动、植物及微生物细胞制备的。如大肠杆菌、小麦胚、玉米胚、果生物细胞制备的。如大肠杆菌、小麦胚、玉米胚、果蝇等。蝇等。无细胞合成体系的成分相当复杂，其中含有无细胞合成体系的成分相当复杂，其中含有RNARNA

54、聚合聚合酶、核糖体、酶、核糖体、tRNAtRNA及能合成系统。还需要加入各种氨及能合成系统。还需要加入各种氨基酸、磷酸肌酸激酶、磷酸肌酸、无机离子及还原剂基酸、磷酸肌酸激酶、磷酸肌酸、无机离子及还原剂等。在反应系统中加入重组等。在反应系统中加入重组DNADNA及及3535S-Met S-Met 后即可实现后即可实现转录和翻译。合成重组转录和翻译。合成重组DNADNA编码的蛋白质，产物经编码的蛋白质，产物经SDS-PAGSDS-PAG电泳，自显影以及水解后指纹图谱分析，即电泳，自显影以及水解后指纹图谱分析，即可判断目的基因的表达结果。可判断目的基因的表达结果。5、物理筛选法（1 1）、电泳筛选法

55、：）、电泳筛选法：原理：根据带有插入片段的重组体原理：根据带有插入片段的重组体DNADNA在分子量会有增加，然后在分子量会有增加，然后分离质粒分离质粒DNADNA并测定其分子长度，是一种直接的方法。并测定其分子长度，是一种直接的方法。优点：比抗药性插入失活平板筛选法更进一步。优点：比抗药性插入失活平板筛选法更进一步。（2 2）、）、R-R-环检测法：环检测法：原理：原理：R-R-环指的是环指的是RNARNA通过取代与其序列一致的通过取代与其序列一致的DNADNA链与双链杂链与双链杂交，被取代的交，被取代的DNADNA单链与单链与RNARNA：DNADNA杂交双链所形成的环状结构。杂交双链所形成

56、的环状结构。由于杂交双链由于杂交双链DNADNA：RNARNA分子分子 比双链比双链DNADNA：DNADNA分子分子 更为稳定。更为稳定。那么将那么将RNARNA及及DNADNA相互混合，创造接近相互混合，创造接近DNADNA变性的条件，变性的条件，RNARNA便会同它的双链便会同它的双链DNADNA中的互补序列退火形成稳定的中的互补序列退火形成稳定的DNADNA：RNARNA杂杂交分子，而使被取代的另一条链处于单链状态。交分子，而使被取代的另一条链处于单链状态。R-R-环一旦形成就环一旦形成就十分稳定，而且在电子显微镜下可以观察到。十分稳定，而且在电子显微镜下可以观察到。处理：在百分之处理

57、：在百分之7070的酰胺缓冲溶液中接近变性温度。的酰胺缓冲溶液中接近变性温度。五、目的基因的表达与调控 问题：问题：1 1、目的基因表达必须具备怎样的条件？、目的基因表达必须具备怎样的条件？2 2、制约目的基因表达式的因素是什么？、制约目的基因表达式的因素是什么？3 3、什么是表达体系？、什么是表达体系？1、目的基因表达必须具备怎样的条件？概述：不论基因工程的研究目的如何，最终均涉及到概述：不论基因工程的研究目的如何，最终均涉及到目的基因的表达问题。绝大多数的基因工程研究是以目的基因的表达问题。绝大多数的基因工程研究是以获得基因表达产物为目标。此外，有时基因工程的目获得基因表达产物为目标。此外

58、，有时基因工程的目的是研究基因结构与机能的关系，进行这种研究时，的是研究基因结构与机能的关系，进行这种研究时，需要将天然的或人工突变的基因片断插入含有一定报需要将天然的或人工突变的基因片断插入含有一定报告基因的载体的适当部位，比较天然基因与突变基因告基因的载体的适当部位，比较天然基因与突变基因对表达水平的影响，从而分析目的基因的结构与功能对表达水平的影响，从而分析目的基因的结构与功能的关系。那么基因表达必须符合下列条件：的关系。那么基因表达必须符合下列条件：（1 1）、基因的密码区不能被插入序列所中断：）、基因的密码区不能被插入序列所中断：（2 2）、基因必须在启动子的控制之下，而启动子必须）

59、、基因必须在启动子的控制之下，而启动子必须被宿主细胞的被宿主细胞的RNARNA聚合酶有效地识别；聚合酶有效地识别；（3 3）、）、mRNAmRNA必须相当稳定，并且被有效转译。产生必须相当稳定，并且被有效转译。产生外源的蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所水解。外源的蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所水解。2 2、制约目的基因表达式的因素是什么？、制约目的基因表达式的因素是什么？外源基因在受体细胞内表达与否以及表达水平受到很外源基因在受体细胞内表达与否以及表达水平受到很多因素的制约，其中主要有：多因素的制约，其中主要有：（1 1）、外源基因是否插入在正确的阅读框架；）、外源基因是否插入在正确的阅读框

60、架；（2 2）、目的基因的有效转录（启动子的作用）；）、目的基因的有效转录（启动子的作用）；（3 3）、）、mRNAmRNA的有效翻译（如的有效翻译（如SDSD序列等作用）；序列等作用）；（4 4）、转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程等。）、转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程等。这些因素在不同的表达体系又是不同的，这种不同不这些因素在不同的表达体系又是不同的，这种不同不但与基因的来源、基因的性质有关，而且与载体和受但与基因的来源、基因的性质有关，而且与载体和受体细胞有关。体细胞有关。所谓阅读框架：是由每三个核苷酸为一组联接起来的所谓阅读框架：是由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列。编码序

61、列。外源目的基因自己必须置于正确性的阅读框架之中，外源目的基因自己必须置于正确性的阅读框架之中，也就是说外源基因只有在它与载体上也就是说外源基因只有在它与载体上DNADNA的起始密码的起始密码相吻合时，才算是处于正确的阅读框架之中。相吻合时，才算是处于正确的阅读框架之中。所谓启动子：是指一段所谓启动子：是指一段DNADNA序列，它能指导序列，它能指导RNARNA聚合聚合酶连接在酶连接在DNADNA模板上，并开始合成模板上，并开始合成mRNAmRNA。不同的启动子效率不同的启动子效率 不同，强的启动子指导产生较多的不同，强的启动子指导产生较多的mRNAmRNA，弱启动子指导下转录合成，弱启动子指

62、导下转录合成 mRNA mRNA很少。很少。启动子有明显的特点：每个启动子序列都有两个高度启动子有明显的特点：每个启动子序列都有两个高度保守的区域。即保守序列（原核保守的区域。即保守序列（原核DNADNA链能被外切酶水链能被外切酶水解，唯独启动子区有一区核苷酸对抗被水解而保持完解，唯独启动子区有一区核苷酸对抗被水解而保持完整序列，这一区整序列，这一区RNARNA聚合酶的结合得到保护，故名）聚合酶的结合得到保护，故名）另外，外源基因要在宿主细胞中高效表达，除了有强另外，外源基因要在宿主细胞中高效表达，除了有强的启动子外还要在翻译过程要求合适的条件。例如在的启动子外还要在翻译过程要求合适的条件。例

63、如在mRNAmRNA链上要有一个可利用的核糖体结合位点，以确链上要有一个可利用的核糖体结合位点，以确保保mRNAmRNA能被有效翻译。在原核生物中，能被有效翻译。在原核生物中，mRNAmRNA分子上分子上有两个核糖体结合位点：一个是起始密码子（有两个核糖体结合位点：一个是起始密码子（AUGAUG或或CUCCUC），另一个是起始密码子上游），另一个是起始密码子上游311bp311bp处的处的39bp39bp的序列称为的序列称为SDSD序列。序列。SDSD序列与大肠杆菌中序列与大肠杆菌中rRNArRNA的的16S16S亚基未端序列是互亚基未端序列是互补的，通过互补作用，核糖体与补的，通过互补作用，

64、核糖体与mm链连接起来，链连接起来，开始翻译过程。那么影响翻译的因素主要有：开始翻译过程。那么影响翻译的因素主要有：（）、（）、SD SD序列与序列与rRNArRNA的的16S16S亚基亚基 未端未端序列之间的互补程度是影响翻译的主要因素；序列之间的互补程度是影响翻译的主要因素；（2 2）、起始密码子）、起始密码子AUGAUG与与SDSD序列之间的距离以及序列之间的距离以及SDSD序列序列的核苷酸组成也影响翻译能力；的核苷酸组成也影响翻译能力；（3 3）、起始密码之后的第一个核苷酸对）、起始密码之后的第一个核苷酸对mRNAmRNA与核糖体的结合也与核糖体的结合也有影响；有影响；（4 4）、基因

65、末端的转录终止区的影响。）、基因末端的转录终止区的影响。外源基因末端要安装好启动子，还要注意到终止区的设计。否则外源基因末端要安装好启动子，还要注意到终止区的设计。否则转录的表达的过程可能会：转录的表达的过程可能会：第一是转录与翻译物不必要地加长，增加了细胞能量的消耗，产第一是转录与翻译物不必要地加长，增加了细胞能量的消耗，产生大量无用的蛋白质；生大量无用的蛋白质；第二是转录可能形成不理想的二级结构，从而降降低了翻译的效第二是转录可能形成不理想的二级结构，从而降降低了翻译的效率；率；第三是可会发生启动堵塞现象，也就是从克隆基因的启动了开始第三是可会发生启动堵塞现象，也就是从克隆基因的启动了开始

66、转录可能于扰另一个重要基因的转录和翻译。转录可能于扰另一个重要基因的转录和翻译。3、什么是表达体系？所谓表达体系：是由目的基因、表达载体与宿主细胞所谓表达体系：是由目的基因、表达载体与宿主细胞组成的完整系统。分为原核表达体系和真核表达体系。组成的完整系统。分为原核表达体系和真核表达体系。原核宿主系统是最早开发的基因表达系统，业已证明原核宿主系统是最早开发的基因表达系统，业已证明在合适的调节控制下，通过调整基本条件，做出正确在合适的调节控制下，通过调整基本条件，做出正确设计，任何来源的基因都可以在原核宿主细胞中获得设计，任何来源的基因都可以在原核宿主细胞中获得表达。尽管表达。尽管 如此，利用真核细胞作宿主表达系统还是如此，利用真核细胞作宿主表达系统还是具有明显的优点：真核细胞能识别和除去外源基因的具有明显的优点：真核细胞能识别和除去外源基因的内含子，切接加工形成成熟的内含子，切接加工形成成熟的mRNAmRNA，也就是说真核，也就是说真核细胞带内含子的天然基因是可以利用的，这是原核细细胞带内含子的天然基因是可以利用的，这是原核细胞办不到的；胞办不到的；真核细胞将表达的蛋白质糖基化，而大肠杆