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1、NK细 胞 杀 伤 活 性 检 测 -乳 酸 脱 氢 酶 释 放 法石 河 子 大 学 医 学 院 免 疫 学 教 研 室2013-7-5 目 的 要 求n 熟 悉 乳 酸 脱 氢 酶 释 放 法 测 定 NK细 胞 杀 伤活 性 的 检 测 方 法 。 【 原 理 】 乳 酸 脱 氢 酶 (LDH) 是 活 细 胞 胞 浆 内 含 酶 之 一 。正 常 情 况 下 ， LDH不 能 透 过 细 胞 膜 。 当 靶 细 胞 受 到效 应 细 胞 的 攻 击 而 损 伤 时 ， 细 胞 膜 通 透 性 改 变 ，LDH可 释 放 至 介 质 中 。 释 放 出 来 的 LDH在 催 化 乳 酸
2、生成 丙 酮 酸 的 过 程 中 ， 使 氧 化 型 辅 酶 (NAD+) 变 成还 原 型 辅 酶 (NADH2)。 后 者 再 通 过 递 氢 体 -吩 嗪 二甲 酯 硫 酸 盐 (PMS) 还 原 硝 基 氯 化 四 氮 唑 蓝 (NBT)，形 成 有 色 的 甲 臢 类 化 合 物 ， 在 490nm或 570nm波 长 处有 一 高 吸 收 峰 。 利 用 读 取 的 A值 ， 经 过 计 算 即 可 得知 NK细 胞 杀 伤 靶 细 胞 的 活 性 。 实验原理 效应细胞 靶细胞 释放LDH 丙酮酸乳酸乳酸脱氢酶(LDH)NAD + NADH+H+PMSNBT 吩 嗪 二 甲 酯
3、硫 酸 盐硝 基 氯 化 四 氮 唑 蓝 【 试 剂 】n 1. 靶 细 胞 检 测 人 的 NK 细 胞 活 性 常 用 的 靶 细 胞 为 体 外 传 代 细 胞 株 K562。n 2. 效 应 细 胞 从 人 外 周 血 （ 肝 素 抗 凝 ） 分 离 的 单 个 核 细 胞 。n 3. 1640 培 养 液 n 4. LDH 底 物 溶 液 （ 临 用 前 配 制 ） NBT 硝 基 氯 化 四 氮 唑 蓝 4mg NAD+I 氧 化 型 辅 酶 I 10mg PMS 吩 嗪 二 甲 酯 硫 酸 盐 1mg 【 试 剂 】 加 蒸 馏 水 2ml 溶 解 ， 混 匀 后 取 上 清 液
4、 1.6ml， 加1mol/L 乳 酸 钠 0.4ml， 然 后 加 入 0.1mol/L pH7.4 PBS 至 10ml。n 5. 1% NP40 ： 取 1ml NP-40 加 去 离 子 水 99ml。 n 6. 1mol/L 柠 檬 酸 终 止 液 取 柠 檬 酸 21g 加 去 离 子 水 100ml 实验步骤效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）靶细胞的制备效-靶细胞相互作用酶促反应结果判读 取培养2448hr的靶细胞(K562), 洗涤3次（1000rpm10min）, 最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1105/ml, 备用。靶细胞的制备： 效应细胞的制备（分离
5、外周血单个核细胞）采集静脉血4 ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝分别吸取2ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中，将管倾斜45，沿管壁缓缓注入抗凝血 离心2000rpm20min 密度梯度离心分离淋巴细胞亚群 用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度（加入0.2ml完全RPMI-1640 ，混匀，1x 107）将所得PBMC用5倍体积的1640洗涤一次2000rpm10 min用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层） 计 数 PBMC1.计 数 4个 大 方 格 中 （ 即 64个 小 方 格 ） 所 有
6、细胞 数2.计 数 原 则 ： 数 上 不 数 下 ， 数 左 不 数 右 。3.总 数 除 以 4， 所 得 数 据 104即 为 1ml液 体 中 的细 胞 总 数4.每 ml健 康 成 人 血 可 分 离 出 1 106 2 106个单 个 核 细 胞 计 数 PBMC举 例n 数 4个 大 方 格 细 胞 数 分 别 为 ： 87， 79， 91，85n 总 数 为 ： 87+79+91+85=342n 一 个 大 方 格 的 平 均 数 为 ： 342/4=85.5n 1ml液 体 中 细 胞 量 为 ： 85.5 104n 如 果 用 染 液 稀 释 后 计 数 ， 则 细 胞 数
7、 为 该 数据 的 2倍 。 效-靶细胞作用 将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加入96孔细胞培养板的孔中, 每份标本设2个复孔,同时设靶细胞自然释放对照组 (0.1ml靶细胞+0.1ml RPMI-1640液)最大释放对照组 (0.1ml靶细胞+0.1ml1NP-40液), 1000r/min, 2min后, 置37、5CO 2温箱中孵育2-4h。 A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 实验组 自然释放组 最大释放组 1 2 3 4 5 6 效应细胞（100l） + + - - - -靶细胞（100l） + + + + + +RPMI1640 （100l
8、） - - + + - - 1%NP-40 （100l） - - - - + + 【 操 作 方 法 】n 酶 促 反 应 ： 从 37 温 箱 中 取 出 培 养 物 ， 吸 取各 孔 上 清 0.1ml 加 于 另 一 培 养 板 孔 中 。 酶促反应置37预温10min, 加入新鲜配制的底物溶液0.1ml, 37避光反应1015min。终止酶促反应（用毛细吸管滴一滴1mol/L柠檬酸30l）A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 结果计算 用酶标检测仪在570nm波长下读取各孔OD值, 并计算NK细胞活性。实验组OD值-自然释放对照组OD值NK细胞活性（%） 最大释放对
9、照组OD值-自然释放对照组OD值=100% 1、无论采用何种试验方法, 靶细胞的质量是影响细 胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因 素。一般要求靶细胞的自然释放率10。2、分离PBMC时，应用毛细吸管尽可能吸取灰白 层，切勿搅动各层。3、吸取细胞培养上清时, 应尽可能不吸动沉淀的细 胞。4、用此法测得NK活性的正常值范围在10-40%。注意事项: 实 验 报 告1. 记 录 NK细 胞 杀 伤 实 验 的 原 理 、 方 法 、 结 果 。 T淋 巴 细 胞 检 查 E花 环 形 成 试 验【 目 的 要 求 】1.掌 握 T淋 巴 细 胞 E花 环 试 验 的 原 理 、 正 常 值 ，
10、 了 解 其 方 法 和 用 途 。2.熟 悉 光 镜 下 E花 环 的 形 态 和 计 数 方 法 。 【 实 验 原 理 】 T细 胞 表 面 具 有 能 与 绵 羊 红 细 胞 （ SRBC）表 面 糖 肽 结 合 的 受 体 ， 称 为 E受 体 （ CD2） 。 已证 实 E受 体 是 人 类 T细 胞 所 特 有 的 表 面 标 志 。 当T细 胞 与 SRBC混 合 后 ， SRBC便 粘 附 于 T细 胞 表 面 ，呈 现 花 环 状 。 通 过 花 环 形 成 检 查 T细 胞 的 方 法 ，称 为 E花 环 形 成 试 验 。 根 据 花 环 形 成 的 多 少 ， 可 测 知 T细 胞 的 数 目 ，从 而 间 接 了 解 机 体 细 胞 免 疫 功 能 状 态 ， 判 断疾 病 的 预 后 ， 考 核 药 物 疗 效 等 。 【 实 验 方 法 】 淋 巴 细 胞 与 SRBC按 一 定 比 例 (1:10)混 合 37 5分 钟 ， 4 20分 钟 取 样 涂 片 瑞 氏 染 色 、 镜 检 。 计 数 E花 环 数 ， 算 出 总 花 环 形 成 率 。 正 常 值 为 60%80%。 花 环 形 成 细 胞花 环 形 成 细 胞 + 不 形 成 花 环 细胞 100% 花 环 形 成 细 胞
NK细胞杀伤活性检测
