生化试验观察血清中谷丙转氨酶的活力变化.ppt
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1、实 验 六 观 察 血 清 中 谷 丙 转 氨 酶 的 活 力 变 化Experiment 6 Observing Enzyme Activity Changes of Alanine Aminotransferase in Sample 一 、 目 的 要 求1、 了 解 血 清 谷 丙 转 氨 酶 活 力 变 化 的 意 义2、 掌 握 血 清 谷 丙 转 氨 酶 活 力 的 测 定 方 法 二 、 相 关 知 识 点1. 转 氨 作 用 transamination 2. 氨 基 转 移 酶 转 氨 酶 ( aminotransferase, transaminase) 催 化 氨 基
2、酸 与 酮 酸 之 间 氨 基 转 移 的 一 类 酶 谷 丙 转 氨 酶 glutamic-pyruvic transminase GPT 又 称 丙 氨 酸 转 氨 酶 alanine aminotransferase ALT 谷 草 转 氨 酶 glutamic oxaloacetic transaminase GOT又 称 天 冬 氨 酸 转 氨 酶 aspartate transaminase, AST 3.转 氨 作 用 的 机 制 : 4 转 氨 作 用 的 意 义正 常 时 转 氨 酶 主 要 分 布 在 细 胞 内 , 血 清 中 酶 活力 很 低GOT以 心 脏 细 胞 中
3、 活 力 最 大 , 其 次 为 肝 脏 细 胞GPT则 以 肝 脏 细 胞 中 活 力 最 大 正 常 组 织 异 常 组 织心 脏 肝 脏 心 脏 肝 脏细 胞 中 酶 活 力 GOT高 GOT/GPT高 细 胞 破 损 酶 溢 出血 清 中 酶 活 力 GOT低 GOT/GPT低 GOT升 高 GOT/GPT 升 高 5.谷 丙 转 氨 酶 的 临 床 意 义如 果 GPT血 清 值 超 过 正 常 上 限 2 3倍 , 并 持 续 两周 以 上 , 表 明 有 肝 胆 疾 病 存 在 的 可 能 。ALT的 正 常 上 限 是 40单 位 , 2.5倍 为 100单 位 , 20倍 为
4、 800单 位 。 三 、 实 验 原 理 丙 酮 酸 二 硝 基 苯 腙 红 棕 色2,4-二 硝 基 苯 肼 SUBSTRATEPyruvate dinitrate phenylhydrazone 2,4-dinitrate phenylhydrazine alanine-ketoglutarate Red brownpyruvic acidpyrivic acid glutamic acid SALT单 位 的 定 义 是 : 1ml 血 清 在 37 与 底 物 作用 30min, 每 产 生 2.5g丙 酮 酸 所 需 酶 的 量 为 一 个SALT单 位 。 四 、 实 验 操 作
5、1.标 准 曲 线 的 绘 制试 剂 管 号 0 1 2 3 4 5丙 酮 酸 标 准 液 , mlSALT底 物 溶 液 , ml磷 酸 缓 冲 液 , ml 0.000.500.10 0.050.450.10 0.100.400.10 0.150.350.10 0.200.300.10 0.250.250.1037 水 浴 中 保 温 10min2,4-二 硝 基 苯 肼 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.5037 水 浴 保 温 20min 氢 氧 化 钠 ml 5 5 5 5 5 5室 温 下 静 置 10min 蒸 馏 水 调 零 点 , 于 520nm处 测 吸
6、 光 度 1. 为 什 么 在 制 作 标 准 曲 线 时 要 加 入 底 物 溶 液2. 为 什 么 加 入 底 物 溶 液 的 体 积 不 同 , 对 反 应 没 有 影 响3. 怎 么 计 算 丙 酮 酸 的 质 量 丙 酮 酸 微 克 数 -吸 光 度 标 准 曲 线 2 SALT活 力 测 定 : 洁 净 干 燥 试 管 4支 , 即 测 定 管 、 对 照 管 各 2支 试 剂 测 定 管 对 照 管血 清 , mlSALT底 物 溶 液 , ml 0.10.5 0.1_37 水 浴 30min2,4-二 硝 基 苯 肼 溶 液 , mlSALT底 物 溶 液 , ml 0.5_
7、0.50.537 水 浴 20min0.4mol/L氢 氧 化 钠 溶 液 , ml 5.0 5.0室 温 下 静 置 10min 1. 4根 干 燥 试 管 的 用 途 是 什 么 ?2. 样 品 测 定 为 什 么 要 使 用 对 照 管 ? 3. 样 品 测 定 的 酶 反 应 怎 样 终 止 ?4. 血 清 样 品 和 底 物 在 使 用 前 最 好 提 前 放 置 于 水 浴 中 预 热 ,保 证 反 应 时 的 温 度 的 准 确 性5. 反 应 温 度 和 计 时 要 准 确 SALT活 力 = 测 定 管 微 克 数 对 照 管 微 克 数 2.5 0.1 ( 单 位 ) 五
8、、 注 意 事 项1. 2, 4-二 硝 基 苯 肼 可 与 有 酮 基 的 化 合 物 作 用 形 成 苯 腙2. 吸 量 应 准 确 , 严 格 控 制 反 应 时 间 和 温 度 。3. 在 测 定 SALT活 力 时 , 应 事 先 将 底 物 、 血 清 在 37 水 浴 中 恒温4. 溶 血 标 本 不 宜 采 用 , 因 血 细 胞 内 转 氨 酶 活 力 较 高 , 影 响 测 定结 果 。5 在 测 定 时 , 如 酶 活 力 较 大 ( 大 于 100单 位 ) , 应 将 样 品 稀 释后 再 进 行 测 定 。 六 、 专 业 词 汇 glutamic-pyruvic
9、transminase GPT alanine aminotransferase ALTglutamic oxaloacetic transaminase GOT aspartate transaminase, ASTenzyme activity serumAminotransferase/ transaminasecatalyzealanine-ketoglutarateglutamic acidpyruvic acidalkali substrate ABSTRACT Observing Enzyme Activity Changes of Alanine Aminotransferas
10、e in Sample Abstract: Objetcive: To determine the activity of serum ALT in sample. Method: SALT was measured by Reitman-Frankel colorimetric end point method Results: The normal SALT activity is ( ) unit, the abnormal SALT activity is ( ) unit. Conclusion: The activity of SALT in abnormal sample is
11、much higher than that in normal sample Key Words: alanine aminotransferase, aspartate transaminase, enzyme activity, serum, -ketoglutarate, substrate, ( 1) draw calibration curvetubes Add standard pyrivic acid solution, SALT substrate solution and phosphate bufferWater bathing at 37 for 10Add 2,4-di
12、nitrate phenylhydrazine and water bath at 37 for 20Add NaOH solution and keep in room temperature for 10 Assay at 520nm ( 2) determining the activity of SALTNormal tubes Abnormal tubesseraSALT substrate solution sera_Water bathing at 37 for 30 Water bathing at 37 for 302,4-dinitrate phenylhydrazine 2,4-dinitrate phenylhydrazine_ SALT substrate solution Water bathing at 37 for 20Water bathing at 37 for 20Add NaOH solution and keep in room temperature for 10 Add NaOH solution and keep in room temperature for 10Assay at 520nm Assay at 520nm
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