《血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定试验用.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定试验用.ppt（47页珍藏版）》请在装配图网上搜索。
1、 选 择 材 料破 碎 细 胞提 取分 离 纯 化分 析 及 鉴 定 溶 解 度 盐 析 、 等 电 点 沉 淀 、有 机 溶 剂 沉 淀分 子 大 小 透 析 、 超 过 滤 密 度 梯 度 离 心 、 凝胶 过 滤带 电 特 性 电 泳 、 离 子 交 换 层 析吸 附 特 性 吸 附 层 析对 配 体 分 子的 亲 和 性依 据 性 质 方 法用 于 粗 分 用 于 细 分亲 和 层 析 、 金 属螯 合 层 析 溶解度 盐 浓 度Salting-out 脱 水 脱 水 脱 水带 负 电 荷 蛋 白 质（ 疏 水 胶 体 ）阴 离 子 阳 离 子碱酸 酸碱水 化 膜带 正 电 荷 蛋 白
2、 质（ 疏 水 胶 体 ） n 常 用 的 中 性 盐 ： (NH4)2SO4 1) 溶 解 度 大 ： 血 清 球 蛋 白 清 蛋 白(NH4)2SO450%饱 和 度 饱 和析 出 析 出 色 谱 法chromatography脱 盐 和 纯 化 石 油 醚 （ 流 动 相 M）植 物 叶 子 的 石 油 醚 萃 取 液 (样 本 )碳 酸 钙 （ 固 定 相 S）玻 璃 管 （ 色 谱 柱 ）胡 萝 卜 素 、 叶 黄 素和 叶 绿 素 A、 B连 续 色 带（ 色 谱 ） 1906年 俄 国 植 物 学 家 米 哈 伊 尔 .茨 维 特 一 基 本 概 念色 谱 法 ： 利 用 混 合
3、 物 中 各 组 分 的 理 化 性 质 的 差 异 （ 吸 附力 、 溶 解 度 、 分 子 形 状 和 大 小 、 分 子 极 性 、 分子 亲 和 力 、 电 荷 等 ） ， 使 各 组 分 以 不 同 程 度 分布 在 两 个 相 中 ， 其 中 一 个 相 叫 固 定 相 ， 另 一 个相 流 过 此 固 定 相 叫 流 动 相 。 由 于 各 组 分 受 流 动相 作 用 产 生 的 推 力 和 受 固 定 相 作 用 产 生 的 阻 力不 同 ， 使 各 组 分 产 生 不 同 的 移 动 速 度 ， 从 而 使结 构 上 具 有 微 小 差 异 的 各 组 分 得 到 分 离
4、的 过 程 ，称 之 为 色 谱 法 。 二 特 点1、 高 效 能2、 高 度 选 择 性3、 高 灵 敏 度4、 操 作 简 单不 足 之 处 ： 定 量 精 确 ， 但 定 性 较 差 色 谱三 、 色 谱 的 种 类气 相 色 谱液 相 色 谱 气 液 色 谱气 固 色 谱液 液 色 谱液 固 色 谱 1、 吸 附 色 谱 法2、 分 配 色 谱 法3、 离 子 交 换 色 谱 法4、 凝 胶 色 谱 法5、 亲 和 色 谱 法按 原 理 分 类 加压 蛋 白 质 溶 液半 透 膜支 持 膜 的 栅 板超 滤 液 离 子 交 换 色 谱 （ ion exchange chromatog
5、raphy） 以 离 子 交 换 剂 为 固 定 相 ， 利 用 样 品 中不 同 的 生 物 大 分 子 的 带 电 部 分 与 具 有 相 反电 荷 的 离 子 交 换 剂 吸 附 强 弱 不 同 ， 而 将 混合 物 中 的 不 同 离 子 进 行 分 离 的 色 谱 技 术 。 三 、 纯 化 （ 离 子 交 换 色 谱 法 ） 阳 离 子 交 换 剂 （ cation exchanger）两 种 离 子 交 换 剂阴 离 子 交 换 剂 （ anion exchanger）R-SO3 H+ + Na+R-S O3 Na+ + H+R-NH4 OH +Cl R-NH4+ Cl +OH
6、离 子 交 换 剂 的 化 学 成 分 1、 树 脂 类 ： 分 离 氨 基 酸 ， 孔 径 小 ； 2、 纤 维 素 类 ： 分 离 蛋 白 质 ， 孔 径 大 。通 过 改 变 盐 浓 度 ， 辅 助 改 变 pH值 进 行 梯 度 洗 脱 。 阳 离 子 交 换 基强 酸 性 ， 聚 苯 乙 烯 树 脂弱 酸 性 ， 羧 甲 基 纤 维 素弱 酸 性 ， 螯 合 作 用 ， 聚 苯 乙 烯 树 脂 阴 离 子 交 换 基强 碱 性 ， 聚 苯 乙 烯 树 脂弱 碱 性 ， 二 乙 氨 乙 基 纤 维 素 阳离子交换层析过程 离 子 交换 树 脂蛋 白 质 高 离 子强 度 洗脱 液 洗
7、高 离 子强 度 洗脱 液 洗加样 平衡液洗 收 集 本 次 实 验 纯 化 采 用 以 醋 酸 纤 维 薄 膜 为 支 持 物 ， 在 pH=8.6的 巴 比 妥 缓 冲 液 中 ， 血 清 蛋 白 的 PI均 小 于8.6， 带 负 电 荷 ， 电 泳 时 向 正 极 移 动 ， 由于 迁 移 率 不 同 而 被 分 离 。实 验 原 理 1 准 备 与 点 样2. 电 泳 （ 点 样 面 朝 下 ， 110V 1h）3 氨 基 黑 10B染 色 5分 钟4. 漂 洗2cm 粗 糙 面操 作 步 骤学 号 （ 1） 血 清 （ 2） 粗 分 的 -球 蛋 白 液（ 3） 粗 分 的 白 蛋
8、 白 液（ 4） 纯 化 的 -球 蛋 白 液 ： 由 于 此 溶 液 浓 度 较 低 ，应 多 次 点 样 于 同 一 位 置 （ 2次 ） ， 每 次 点样 时 待 干 后 再 点 。（ 5） 纯 化 的 白 蛋 白 液 影 响 电 泳 速 度 的 因 素（ 1） 样 品 本 身 ： 带 电 量 、 分 子 大 小 、 形 状 。 Q越 多 ， V越 大 ； r越 小 ， V越 大 ； 球 形 分 子 纤 维 状（ 2） 电 场 强 度 ： X越 大 ， V越 大（ 3） 缓 冲 液 ： pH 决 定 Q， (pH-PI)越 大 ， Q越 多 ， V越 大 结 果 分 析 21 21fibrinogen albumin- +血 浆
血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定试验用.ppt
