发酵过程及优化实验

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1、发酵过程及优化试验产淀粉酶细菌的优化试验淀粉酶是一类能催化淀粉糖苷键水解的酶类，作用于淀粉分子产生糊精、低聚糖及葡萄糖等多种产物。而淀粉酶是应用最广的酶制剂之一，占全球酶工业市场份额的 25%-33%。淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物有机体中。目前，已报道的能够产生淀粉酶的微生物种属包括不动杆菌属、微球菌属、黄隐球酵母、盐单胞菌属、青霉菌属、类芽孢杆菌属、链霉素属、假单胞菌属和杆菌菌属等。试验一 培育基的配置、灭菌一、试验目的1. 温故配制微生物培育基的原理及配制的一般方法、操作步骤。2. 了解鉴别性培育基的原理，并把握配制鉴别性培育基的放到和步骤。二、试验原理鉴别性培育基是一类在成分中加有

2、能与目的菌的无色代谢产物发生显色反 应的指示剂，从而到达只需用肉眼区分颜色就能便利地从近似菌落中找出目的菌菌落的培育基。如对于淀粉酶产生菌的筛选，选用的是在含有淀粉的培育基中培育微生物，滴加碘液进展染色，假设消灭透亮圈，则说明该菌能产生胞外淀粉酶。三、材料和器材（1） 培育基：一般培育基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，自来水 1000mL，pH7.27.4。鉴别型培育基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，可溶性淀粉 10g， NaCl 5g，琼脂 20g， 自来水 1000mL，pH7.27.4。另一个鉴别性培育基加可溶性淀粉 15g 每 1000ml。（2） 器皿：电子天平，烧杯

3、，锥形瓶，量筒，培育皿，玻棒，涂布棒，移液管等。（3） 其他：药匙，记号笔，报纸等。（4） 碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，参加碘11g，溶解后定容至500mL，贮于棕色瓶中。稀碘液：取碘原液2mL，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500mL，贮于棕色瓶中。四、方法和步骤1. 配制根本培育基，分装 50mL 至 250mL 锥形瓶，供试验菌株扩增。2. 配制鉴别培育基，检测试验菌株是否能产胞外淀粉酶。3. 配制稀释用的生理盐水，分装 4.5mL 至每个试管11 管。4. 包扎培育皿、锥形瓶，移液管等。5121，灭菌 20min。6将试验菌株经过适当稀释涂布在鉴别性培育基上培育 2 天

4、，在菌落四周滴加碘液，依据透亮圈的大小，挑取适宜的单菌落进展后续试验。在加可溶性淀粉 15g/L 的鉴别性培育基中涂布的稀释梯度分别是 10-3，10-4， 10-5。在加可溶性淀粉 10g/L 的鉴别性培育基中涂布的稀释梯度分别是 10-5，10-6，10-7。五、留意事项将试验菌株涂布至鉴别性培育基外表时，把握好稀释度，尽量获得单独的单菌落，以利于后期的筛选。六、试验结果1. 菌落的透亮圈透亮圈淀粉浓度(g/L)1015菌悬液的浓度梯度10-510-610-710-310-410-52. 菌落计数菌落数平均值11010710991010353937菌落太多无法计数/130137134323

5、735试验二 生长曲线和产物形成曲线的测定一、试验目的1. 了解分批培育时微生物生长曲线形成的原理及各时期的主要特点。2. 学习微生物生长曲线和产物形成曲线的测定方法。二、试验原理将少量微生物接种到肯定体积的颖培育基中，在适宜的条件下培育，定时测定培育液中微生物的生长量吸光度或活菌数的对数，以生长量为纵坐标，培育时间为横坐标绘制的曲线就是生长曲线，它反映了微生物在肯定环境条件下的群体生长规律。依据生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。这四个时期的长短因菌种的遗传特性、接种量和培育条件而异。因此，通过微生物生长曲线的测定，可了解微生物的生长规律，对于科研和生

6、产实践都具有重要的指导意义。测定微生物的数量有多种方法，如血球计数法、平板活菌计数法、称重法、比浊法等。本试验承受比浊法来测定。由于菌悬液的浓度与吸光值A也称光密度成正比，只要用分光光度计测得菌液的 A 后与其对应的培育时间作图，即可绘出该菌株的生长曲线，此法快捷、简便。产物形成曲线就是产物产量对培育时间的曲线。工业发酵的目的是为了收获产物，因此必需搞清楚产物积存最高时所需的发酵时间。假设提前终止发酵，养分物质还没有完全被利用，发酵液中的产物量偏低；假设发酵时间过长，一方面产物可能会分解，另一方面也降低了设备利用率。因此，学会生长曲线和产物形成曲线的测定对工业发酵具有格外重要的指导意义。三、材

7、料和器材1. 菌种试验菌株。2. 培育基一般培育基，鉴别性培育基。3. 器材高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，分光光度计，摇床等。四、方法和步骤一生长曲线的测定1. 将试验菌株经过适当稀释涂布在鉴别性培育基上培育 2 天，在菌落四周滴加碘液，依据透亮圈的大小，挑取适宜的单菌落进展后续试验。2. 将选择的菌挑取到颖的根本培育基中，放置摇床上30，180rpm 培育，过夜。3. 将第 2 步中培育得到的菌悬液摇匀，吸取 0.5mL 接入颖根本培育集中，30，180rpm 培育，每隔 4h 取一瓶，在 560nm 处测吸光度，以未接种、但已灭菌的根本培育基作比照；每隔 2 小时取次样。4. 以培育时间为横

8、坐标，吸光值为纵坐标，作生长曲线。二产物形成曲线的测定同上，在进展生长量测定的同时，进展产物形成量淀粉酶活力的测定， 以培育试验为横坐标，产物形成量为纵坐标，作出产物形成曲线。五、留意事项1各瓶的接种量、培育条件应全都。2、假设吸光度太高，可适当稀释后再测定。六、结果记录培育时间/hA5601. 数据记录048121620242832360.0020.0040.0060.0180.1250.1850.0570.0890.8940.5432. 绘制出试验菌株的生长曲线和产物形成曲线。从标曲中，查出对应时间下吸光度值 A660 下的淀粉浓度，计算出酶活力。生长曲线及淀粉酶活力图见下个试验的试验结果

9、中。试验三 液化型淀粉酶活力的测定一、试验目的1. 把握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的根本原理和方法。2. 把握在微生物分批培育时酶活力测定的根本方法。二、试验原理淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括 -淀粉酶，淀粉1,4-麦芽糖苷酶 -淀粉酶，淀粉1,4-葡萄糖苷酶糖化酶和淀粉 1,6-葡萄糖苷酶异淀粉酶。 -淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的 -1,4 糖苷键，形成麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的黏度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在 660nm 处有较大的吸取峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切

10、断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反响渐渐消逝 ，因此可以依据肯定时间内蓝色消逝的程度为指标来测定 -淀粉酶的活力。三、材料与器材1. 样品试验二中的发酵液 4000rpm，5min 离心得到的上清液作为粗酶液。2. 试剂（1） 碘原液：称取碘化钾 22g，加少量蒸馏水溶解，参加碘 11g，溶解后定容至 500mL，贮于棕色瓶中。（2） 比色稀细碘液：取碘原液 2mL，加碘化钾 20g，用蒸馏水定容至 500mL， 贮于棕色瓶中。（3） 2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉枯燥至恒重 2g，用少量蒸馏水混合调匀，倒入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸 2min 后冷却，加水定容至 100mL。须当天配

11、制。（4） pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠 Na2HPO412H2O4.523g，柠檬酸 0.807g，用水溶解并定容至 100mL。（5） 0.5mL/L 乙酸溶液，0.85%生理盐水。3器材恒温水浴锅、分管光度计。四、方法和步骤 1标准曲线的制作1 将可溶性淀粉稀释成 0.2%，0.5%，1%，1.5%和 2%的稀释液。（2） 吸取淀粉稀释液 2.0mL 加至试管中，再参加磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液1.0mL，40水浴保温 5min。（3） 加蒸馏水 1mL，40保温 30min 后参加 0.5mol/L 乙酸 10mL。（4） 吸取反响液 1mL，加稀碘液10mL，

12、混匀，在660nm 下测得吸光度 A用2.0mL 蒸馏水代替步骤2中的淀粉稀释液作为比照。（5） 以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。标准曲线：淀粉酶活力标准曲线0.80.70.6y = 0.352x - 0.0557R2 = 0.99390.506A0.40.30.20.1000.51淀粉浓度/%1.522.52. 淀粉酶活力测定用 2%可溶性淀粉按 12操作，用稀释后的粗酶液 1mL 代替 13中的释液/mL蒸馏水，测得吸光度A660，从标准曲线中查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量。管号12345678910淀 粉 稀 2222222222缓 冲 液1111111111/

13、mL40水浴锅保温 5min蒸 馏 水 1111111111/mL粗 酶 液 1111111111/mL40保温 30min，然后参加 0.5mol/L 乙酸 10mL，混匀吸取反响液 1mL稀 碘 液10101010101010101010/mLA6600.550.570.5710.5560.5160.4790.0650.0790.0730.082淀 粉 浓1.7211.7781.7801.7381.6241.5190.3430.3830.3660.391度/%消 耗 淀2.7932.2242.1962.6223.7594.81016.57116.1716.34416.088粉量/(mg/m

14、l)酶活力1.3961.1121.0981.3111.8792.4058.2868.0878.1728.0443. 酶活力计算酶活力以每毫升粗酶液在 40，pH6.0 的条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。枯草压板杆菌生长曲线及淀粉酶活力图9876 活5 酶4 粉淀3210生长曲线淀粉酶活04812162024283236培育时间10.90.80.700.6560.5A0.40.30.20.10试验四 试验菌株的培育基条件的优化一、试验目的1. 了解发酵条件对产物形成的影响，用单因子试验找出试验菌株的最正确培育条件。2. 把握发酵培育基的配制原则，生疏用正交试验优化发酵培育基的方法。二、试验

15、原理发酵培育基是指大生产时所用的培育基，由于发酵产物中一般含有较高比例的碳元素，因此培育基中的碳源含量也应当比种子培育基中高，假设产物的含氮量高，还应增加培育基中氮源比例。但必需留意培育基的渗透压，假设渗透压太高，又会反过来抑制微生物的生长，在这种状况下可考虑用流加的方法逐步参加碳氮源。培育基组分对发酵起着关键性的影响作用。工业发酵培育基与菌种筛选时所用的培育基不同，一般以经济节约为主要原则，因此常用廉价的农副产品为原料。选择碳源时常用山芋粉、麸皮、玉米粉等代替淀粉，而用豆饼粉、黄豆粉等作为氮源；此外，还应考虑所选原料不至于影响下游的分别提取工作。由于这些自然原料的组分简单，不同批次的原料成分

16、各不一样，在进展发酵前必需进展培育基的优化试验。发酵培育基中的原料多是大分子物质，微生物一般不能直接吸取，必需通过胞外酶的作用后才能被利用，所以是一些“迟效性”养分物质。而微生物分泌的胞外酶有不少是诱导酶，为了使发酵起始阶段微生物能快速生殖，可适当在培育基中添加一些速效养分物。三、材料与器材1. 菌种试验菌种。2. 培育基以根本培育基为根底，分别添加葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、蔗糖和乳糖作为碳源。3. 器材电子天平、高压蒸汽灭菌锅 、摇床、超静工作台。四、方法与步骤1. 查阅资料，选定培育基中碳源的含量，计算出对应的葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、蔗糖和乳糖的量以碳含量一样为准则；配置相应培育基。2.

17、 将试验菌株接种至颖的根本培育基中，30培育过夜。3. 将上述菌悬液以 10%的接种量接种至各个培育基中，30，180rpm 培育，培育时间以之前测出酶活最高点为准。4. 检测各个培育基培育的试验菌株的菌含量及酶活量。碳源A560A660五、结果记录葡萄糖果糖乳糖可 溶 性淀粉蔗糖0.8170.7850.5260.8970.6380.2870.280.0190.0370.4141、各个碳源对试验菌株生长的影响图10.90.80.70.60.50.40.30.20.10葡萄糖可溶性淀粉果糖蔗糖乳糖各个碳源对试验菌株生长的影响图A不同碳源从芽孢杆菌生长状况来看，用淀粉作碳源最为适宜。(不同碳源对试

18、验菌株生长量由大到小挨次为：可溶性淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖。)2、各个碳源对试验菌株产酶的影响图各个碳源对试验菌株产酶影响图葡萄糖可溶性淀粉果糖不同碳源蔗糖乳糖10987力 6活 5酶 43210从芽孢杆菌的生产淀粉的酶活力的状况来看，以乳糖为碳源的培育基最正确。(不同碳源对试验菌株产酶酶活力由大到小挨次为：乳糖、可溶性淀粉、果糖、葡萄糖、蔗糖。)六思考题1. 如假设通过鉴别性培育基鉴定该试验菌株不产生透亮圈，是否可以认定该菌就不产淀粉酶？缘由是什么？不行以。缘由还有可能是该菌产的淀粉酶很少，透亮圈不明显；或是培育时间不够，还没有开头产淀粉酶。不肯定代表该菌就不产淀粉酶。2. 假设每次从

19、同一摇瓶中取出 1mL 进展测定，会对结果产生怎么样的影响？ 这样的话前面测的值与后面测的值除了培育时间不同之外，培育液的多少等其他条件也不一样，无法在只有一个变量的状况下相互比照，结果会变得不准确。3. 本试验中产物形成量用淀粉酶活力来表征，是否适宜？为什么？适宜。产生的淀粉酶用来分解淀粉正好是酶活力在此次试验的定义即以每毫升粗酶液在 40，pH6.0 的条件下每小时所分解的淀粉毫克数。4. 依据试验所得曲线，我们可以得到哪些结论？一段时间内枯草芽孢杆菌量不断增加，超过一段时间后开头缓慢削减。而酶的活力也随时间先升后降，最高处有一个酶活力最高的时间。5. 查阅相关资料，提出切实可行的提高酶活

20、量的相关措施。 1培育基的成分以及含量应中选择最正确的量。2最正确的培育时间和温度。3)温度、pH 等条件适宜。4适当添加有益于菌体生长的物质。6. 依据本试验设计的思路，请设计考察不同氮源的种类及含量对试验菌株生长和产酶的影响。1将试验菌株接种至颖的根本培育基中，30C 培育过夜。2) 查阅资料，选定培育基中氮源的含量，计算出对应的植物蛋白、牛肉膏、酵母膏、硫酸铵、硝酸铵的量以碳含量一样为准则；配置相应培育基。3) 将上述菌悬液以 0.2ml 的接种量接种至各个培育基中，30，180rpm 培育，培育时间以之前测出酶活最高点为准。4检测各个培育基培育的试验菌株的菌含量及酶活量。试验小结本次试

21、验主要是是产淀粉酶细菌的优化试验。步骤就是筛选产淀粉酶的菌株， 测诞生长曲线及酶活力，最终找出最适合菌株生长及产酶的碳源。在加可溶性淀粉 15g/L 的鉴别性培育基上涂布的菌液稀释倍数太低，导致10-3 的平板菌落生长的太密集而无法计数，这是以后试验要留意的。鉴别性培育基上菌落生长的大致规律是稀释倍数越小的，长得菌越多越密，也比较小；稀释倍数大的平板上的菌长得菌比较少，但是明显比稀释倍数少的平板要长得大。在试验中，在用稀碘液滴定透亮圈时，要留意不要滴到菌上，挑取菌株时选择长得比较大的单菌落挑取。在测定生长曲线时，要适当稀释菌液，我们稀释了6 倍。配制培育基时不要遗忘调 PH，试验过程中留意操作标准。