《RT-qPCR操作说明书》由会员分享，可在线阅读，更多相关《RT-qPCR操作说明书（6页珍藏版）》请在装配图网上搜索。
1、留意事项1. 以下的Protocol主要适用于（1）所运用的DNA1、反转录酶、RNA 酶抑制剂以及dNTPs均是Fermentas公司的；而在qPCR中，所运用的Supermix是Bio-RAD公司的。2. RT-qPCR中的留意事项：（1） MgCl2的浓度24mM；（2） 模板的浓度50ng5pg之间；（3） 引物的浓度，500nM比较合适，若反应效果不好可以在0.11uM之间选择；（4） 退火温度的选择，首次设置比实际小5的，之后在12选择；（5） 引物设计的时候Tm值最好在60旁边，正反向引物的Tm的差值在12之间；（6） 抽提得到的RNA，须要验证RNA的纯度，最好验证一下RNA的
2、完整性；（7） 在qPCR中，模板的体积要小于总反应体系的10%（主要是模板的加入量会影响反应体系中的MgCl2浓度）；（8） 扩增曲线肯定要做。通常假如有条件也要做退火温度梯度，以获得最佳的退火温度。另外就是，一块板子上，尽可能取尽量多的样本，而不是基因；（9） 扩增效率在90110%的范围内是可以接受的；（10） 内参基因的选择，尽可能选择与靶基因处于同一信号通路中的内参基因。3. 有关引物设计（1） 扩增子长度小于150bp；（2） 引物Tm的志向值5760；（3） 3端最终5个碱基里面G或C的含量少于三个；（4） GC含量介于2080%，志向值4060%；（5） 避开引物二聚体及自身二
3、级结构；（6） 避开引物内的自身重复序列；4. 在一个试验中不论是肯定定量还是相对定量都须要做标准曲线，做标准曲线的方法，以反转录得到的cDNA为模板，用qPCR的引物做PCR得到的产物为模板，产物先稀释10000倍，以稀释后为基底，以10为倍数，稀释78个梯度（稀释点越多，稀释倍数越大，数据越精确），做qPCR，然后得到标准曲线。利用标准曲线可以验证下列因素：（1） 扩增效率； 扩增效率 E=10-1/斜率-1（2） 标准品的梯度范围；（3） PCR抑制剂的存在于影响；（4） PCR仪验证灵敏度。注：假如运用反转录的试剂盒，那么从反转录起先则会有试剂盒的运用说明书，之后的步骤都依据说明书来！
4、 RNA抽提1. 收集OD值等于0.2的硫化叶菌（ACVY），清洗细胞！2. 加入1ml的TRIzol，运用移液枪打匀几次！3. 室温下，孵育5min；4. 加入200ul的氯仿（每ml的TRIzol）。用手猛烈震荡15s，室温孵育23min；5. 12,000g，4离心15min；6. 当心移取无色相到新的离心管中！7. RNA沉淀：加入0.5ml的异丙醇（每1ml的TRIzol）。室温下孵育10min；12,000g，4离心15min（通常状况下，离心之前RNA是可见的）。8. 洗：移去上清，加入1ml的75%的乙醇（每1ml的TRIzol），轻轻涡旋混匀，7500g，4离心5min；9.
5、 略微的风干RNA（不用风干的太狠），运用50ul的RNA-free Water溶解RNA，用移液枪混匀几次，5560孵育10min，测得浓度，部分溶解的RNA的A260/A280值1.6.10. -80保存或者是干脆运用！除去RNA中的DNA1. DNA处理RNA50ug10buffer3uLDNase I1-5U(依据RNA的量和DNA的好用说明)RNA-free waterUp to 30uL37条件下孵育60min2. 加入1l 的50mM的EDTA，之后65孵育10min，主要是用于除去DNA1.3. 将用DNA酶处理之后的RNA做PCR验证，运用荧光定量的引物做PCR。主要是用于验
6、证RNA中的DNA有没有除尽！反转录第一条cDNA的合成：RNA-free WaterUp to 12.5uLTotal RNA (DNaseI treated)10ng-5ugReverse Primer 终浓度100pmol（可适量增大）轻轻混匀，65孵育5min，之后放置在冰上5min；依照下列依次加入下列物质：5*RT buffer4RNase inhibitor0.5dNTP mix (10uM)2Reverse Transcriptase1轻轻混匀，并且简洁离心，主要是让反应匀称；42孵育60min，之后70反应10minRT-qPCR反应反应体系组成：组成体积/每个反应（ul）终浓度Sso EvaGreen supermix51*Premier mixVariable300500nM（常用500）RNA-free WaterVariableDNA templateVariable（10%体系）Total volume10Roche LightCycler LC480 Real-Time PCR systemCycling StepTemperatureTimeCyclesEnzyme activation9530s1Denaturation955s3040Annealing/extention556020sMelt curve6595Continuous1
RT-qPCR操作说明书
