第三章植物外源DNA的导入

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1、第三章第三章植物外源植物外源DNA的导入的导入n外源DNA的导入是指通过某种特定的途径将外源基因或外源DNA片段导入受体细胞，使之整合到受体细胞基因组中，而实现其功能表达的过程。第三章 植物外源DNA的导入 目前已经建立了十多种外源DNA导入方法，按照技术属性可将它们分为物理法、化学法、生物法：n1、物理法：基因枪法、电激法、微注射法、激光穿刺法、超声波法、碳化硅纤维法等；n2、化学法：聚乙二醇（PEG）法、磷酸钙DNA共沉淀、脂质体法等；n3、生物法：农杆菌介导法、花粉管通道法、浸渍法、病毒介导法等。第三章 植物外源DNA的导入 按照媒介类型的有或无，可分为载体介导法、直接导入法和种质系统介

2、导法：n1、载体介导法：将目DNA转入农杆菌或病毒中，并以之为载体，随着它们对植物的感染而将目的DNA导入植物细胞中；n2、直接导入法：以裸露的外源DNA通过化学或物理方法直接导入植物细胞；n3、种质系统介导法：借助植物自身的种质细胞与媒介（如花粉、子房、花粉管通道、幼胚等）来实现外源DNA导入，它包括花粉管导入法、子房、幼穗、幼胚注射法、种子浸渍法等。第三章第三章植物外源植物外源DNA的导入的导入一、原理一、原理 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，它们侵染植物后能诱发植物形成肿瘤。从一种致癌的农杆菌中分离出了一种巨大质粒（约200Kb），称为致癌质粒，简称Ti质粒。Ti质 粒 上 有 一 段

3、DNA被 称 为 转 移DNA（简称TDNA），能转移并整合到植物染色体上，其上携带的基因能在受体细胞中表达。Ti质粒随后被改造用作人工植物基因工程的载体。这种利用农杆菌的遗传转化体系，将外源目的基因或DNA片段插入Ti质粒的TDNA中，并随之导入受体植物细胞，而获得转基因植株的方法，即为农杆菌介导法。第三章 植物外源DNA的导入nlTi质粒的必需组成元件，包括TDNA区域和致毒基因(Vir gene)nTi质粒为160250 kb的大质粒，包括毒性区(Vir区)、结合转移区(Con区)、复制起始区(Ori区)和T-DNA区4部分，其中与冠瘿碱生成有关的是Vir区和T-DNA区。前者大小为30

4、kb，分virA-J等至少10个操纵子，决定了T-DNA的加工和转移过程。nT-DNA可以将携带的任何基因整合到植物基因组中，但这些基因本身与T-DNA的转移和整合无关，仅左右两端各25bp的同向重复序列为其加工所必需，其中14bp是完全保守的，分10和4bp不连续的两组，两边界中以右边界更为重要。第三章 植物外源DNA的导入（1 1）T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA区段的两端均有相似的区段的两端均有相似的25bp25bp的特殊序列。的特殊序列。T TL L GGCAGGATATATTCAATTGTAAATGGCAGGATATATTCAATTGTAAATT TR R GGCAGGATA

5、TATCGAGGTGTAAAAGGCAGGATATATCGAGGTGTAAAA第三章 植物外源DNA的导入二、操作步骤二、操作步骤用农杆菌法转化受体植物的全过程包括：n植物受体系统的建立nTi质粒转化载体系统的构建n工程农杆菌的制备n外源基因的转化n转化体的筛选和转基因植株的检测 第三章第三章植物外源植物外源DNA的的导入导入 基因枪法又称微弹轰击法、粒子轰击法、高速粒子喷射技术、弹道微靶点射击，是一种借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。第三章 植物外源DNA的导入n一一、原理原理 基因枪技术的基本原理是利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，将载有外源DNA的金（或钨）粉等金

6、属微粒加速，射入受体细胞或组织，从而达到将外源DNA分子导入细胞中的目的。第三章第三章植物外源植物外源DNA的导入的导入n1、受体细胞或组织的预处理 通过渗透剂（甘露醇、山梨醇等）处理来调节受体细胞或组织的渗透压，维持细胞的高渗状态，使其在轰击受伤后细胞质的外渗减少，从而有利于细胞的成活。第三章 植物外源DNA的导入n2、DNA微弹的制备 这一过程是将外源基因DNA分子以一定比例附着在金属微粒子（金粉或钨粉）载体上。n3、受体材料的轰击 PDS-1000/H台式基因枪台式基因枪 第三章 植物外源DNA的导入n4、过渡培养与筛选培养 轰击后的材料先在不含选择压力的培养基中过渡培养一段时间（一般1

7、2周），以利于受轰击材料的恢复并充分表达外源基因（包括选择压力抗性基因），再转入有选择压力的培养基中进行培养，以抑制非转化细胞的生长，而转化细胞则能继续生长分化，从而被筛选出来。第三章第三章植物外源植物外源DNA的的导入导入n一、基本原理一、基本原理 聚乙二醇（PEG）是一种选择性化学渗透剂，它可以使细胞膜之间或使DNA与细胞膜之间形成分子桥，促使相互间的接触和粘连，并通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜透性变化，从而促进外源大分子进入原生质体，因此称之为PEG诱导法。第三章 植物外源DNA的导入二、操作程序二、操作程序n1、分离原生质体n2、提取带有目的基因的质粒或其它外源DNA；n3、取0

8、.5ml新制备的原生质体悬浮液（原生质体密度为2X106/ml）,加入50l小牛胸腺DNA，混匀后静置10分钟，然后再加入10ml外源DNA，轻轻混匀后静置10分钟；第三章 植物外源DNA的导入n4、加入等体积40的PEG溶液，立即混匀，室温下置30分钟；n5、每隔5分钟加12ml 0.2mlCaCl2溶液，逐步稀释到10ml；n6、离心收集原生质体，并重新悬浮培养到10ml培养基中培养1周；n7、将原生质体转移到选择培养基中进行筛选培养。第三章第三章植物外植物外源源DNA的导入的导入PEG法的优点如下：n 1实验成本低，不需要特殊的仪器设备n 2受体植物材料不受种类的限制，只要能建立原生质体

9、再生体系的植物都可以采用此法；n 3得到的转化体中嵌合体很少；第三章 植物外源DNA的导入n 4结果稳定，重复性好；n 5有实验证明，此法可使两个非连锁基因的共转化率达50左右；n 6有研究表明，用植物总DNA进行转化，其转化频率与用质粒DNA接近；n 7此法可与电击法、脂质体法、基因枪法、激光微束穿刺法等技术结合使用，可大大提高转化率。第三章 植物外源DNA的导入但PEG法也有较大的局限性：n1必须以原生质体为受体，而建立原生质体再生体系往往十分困难；n2转化率仍然偏低。第三章第三章植物外源植物外源DNA的导入的导入n一、基本原理一、基本原理 浸渍法是将植物的种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼

10、穗、悬浮细胞甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用植物细胞自身的物质运输系统将外源DNA分子直接导入受体细胞。第三章 植物外源DNA的导入 现在已经证明植物细胞至少通过以下几种途径将外源DNA吸入细胞内：n1、外源DNA可以通过细胞间隙与胞间连丝组成的网络化的运输系统而被运输到每一个细胞内；n2、植物细胞通过类似于动物细胞的内吞作用将外源DNA摄入细胞内；n3、植物组织中的传递细胞的膜透性改变可以为大分子物质透过细胞膜提供机会，尤其是生殖细胞以及分生细胞中，外源DNA进入细胞中的机会更大。第三章 植物外源DNA的导入二、基本方法二、基本方法 以种子为受体介绍其基本操作方法：n1、将种子用0

11、.1的升汞或2030次氯酸钠消毒，无菌剥去种皮（也可剥去幼胚）；n2、将剥出的种子浸于无菌的0.1 XSSC缓冲液中，加入20的二甲基亚砜（DMSO）；n3、加入供体DNA溶液（100200g/ml），浸泡30min至数小时；n4、用无菌0.1 XSSC缓冲液冲洗干净；第三章 植物外源DNA的导入n5、将种子放在无菌滤纸上吸干水份后，转入无激素的固体培养基上培养；n6、将生长发育正常的胚转入筛选培养基上进行筛选（用质粒DNA浸泡的种子），或成苗后转栽到土壤中进行变异性状分析（用总DNA浸泡的种子）。第三章 植物外源DNA的导入三、基本特点三、基本特点n浸渍法具有如下优点：浸渍法是高等植物转化技

12、术中最简单、快速、便宜的一种转化方法，它无需昂贵的仪器设备和复杂的组织培养技术，可以进行大批量的受体转化工作，容易推广。n此法的局限性如下：转化频率较低，重复性较差，筛选和检测也困难，往往很难得到分子生物学证据。第三章第三章植物外源植物外源DNA的导入的导入n一、基本原理一、基本原理 在受精及胚胎发育的初期是植物接受远缘遗传物质的敏感时期，就生殖细胞的结构而言，在胚囊中的精、卵细胞类似天然的原生质体；而且在精子入卵时，卵膜有一个开闭的过程；即使到了合子期，胞壁的形成也尚未完备，胞壁的屏障作用还很小，因此外源基因进入受体卵细胞及合子的阻力较小。第三章 植物外源DNA的导入 在花粉管伸入胚珠的过程

13、中可形成花粉管通道，这为外源DNA分子进入胚囊提供了天然的途径。植物授粉后外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎。第三章 植物外源DNA的导入 就整体分子而言，亲缘关系愈远的生物间的染色体基因DNA的结构愈不易亲和，而容易相互排斥，但从局部的DNA片段来看，两种来源的DNA在部分区段上可能保持一定的亲和性，因而远缘DNA片段在受体细胞DNA复制过程中有可能被重组进去，这便是染色体水平以下的分子杂交。第三章 植物外源DNA的导入二、操作方法二、操作方法n1.柱头切除法：当受体植物自花授粉一定时间后（一般23小时），切去花柱，然后马上在切口上滴

14、入供体DNA溶液（浓度为50100g/ml，溶于1XSSC），最后套袋隔离至种子成熟。第三章 植物外源DNA的导入n2花粉粒吸入法：收集新鲜花粉加入到供体DNA溶液中混匀，使外源DNA吸入花粉粒，然后取混合液滴于预先去雄套袋隔离的雌花上进行人工授粉，再继续套袋至种子成熟。第三章 植物外源DNA的导入n3柱头涂抹法：在未授粉前先用DNA溶液涂抹柱头，然后人工授粉套袋隔离，通过花粉管的伸入将外源DNA带入胚囊，成熟后收获种子。第三章第三章植物外源植物外源DNA的导入的导入n 1无需细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程。避免了原生质体再生以及组织培养过程中可能导致染色体变异或优

15、良农艺性状丧失的问题。n 2不受植物种属的限制，在具备有性生殖过程的任何植物上都能应用。n 3简便，易于掌握，可以在大田、棚栽或温室种进行。第三章 植物外源DNA的导入n4育种时间短，筛选遗传稳定的品系一般只需34代时间。n5通过外源总DNA片段的导入可以了解一些具有重大经济价值的农艺性状是否能够通过DNA片段进行转移，这些性状是单基因性状还是多基因性状，从而能为目的基因的克隆提供参考和材料。第三章第三章植物外源植物外源DNA的导的导入入n一、基本原理一、基本原理 超声波是指频率为2X1042X109Hz的声波。它的生物效应主要是机械作用、热化作用和空化作用，导致细胞壁与细胞膜的击穿或可逆的通

16、透性的变化，这将使得外源DNA进入细胞中。第三章第三章植物外源植物外源DNA的导入的导入n1、受体材料的培养：一般采用无菌苗的不同器官、愈伤组织或原生质体，按常规方法进行培养。n2、提取外源DNA：所用质粒DNA或外源总DNA均按常规方法提取和纯化。第三章 植物外源DNA的导入n3、超声波处理：将受体材料切成小块，放入超声波小室中，加入23ml超声缓冲液，同时加入20g/ml供体DNA及40g/ml鲑鱼精DNA，超声波处理的声强为0.52.0 W/cm2,处理时间为1050分钟。n4、处理后受体材料的培养和筛选：处理后将受体材料从缓冲液中取出，在正常培养基上恢复生长1周后，转入到选择培养基上进

17、行筛选。第三章第三章植物外源植物外源DNA的导入的导入优点：优点：n1、不受受体种类的限制，不仅适应于原生质体，而且适用于带壁细胞的转化；n2、操作简单，转化效率高。缺点：缺点：外源DNA用量大，许多参数有待于优化。第三章第三章植物外源植物外源DNA的导入的导入n一、基本原理基本原理 激光是一种很强的相干单色电磁射线，一定波长的激光束经聚焦后到达细胞膜表面时其直径大约只有0.30.5nm。这种直径很小、能量很高的激光束可以使细胞膜产生可逆性穿孔，利用激光微束的这种穿孔效应可以使外源DNA导入到受体细胞中。第三章第三章植物外源植物外源DNA的导入的导入n1、受体材料的预处理 将欲处理的材料（幼胚

18、、愈伤组织、悬浮细胞等）转入高渗缓冲液（10m mol Tris-HCl,0.7mol山梨醇或甘露醇、pH7.2），浸泡15小时，然后用新鲜培养液洗去高渗液，将受体材料移入激光机的样品处理室中，加入0.5ml培养液，加入浓度为5g/ml的外源DNA50l混匀，并设不加DNA的对照。第三章 植物外源DNA的导入n2、激光微束照射n3、受体材料的培养：照射后的受体材料按照常规方法进行培养。第三章第三章植物外源植物外源DNA的导入的导入n优点：1、是一种物理转化方法，无受体材料限制，适用于各种功能植物材料和各种类型的受体细胞；2、操作简单、方便、转化效率较高；3、还可进行细胞器的基因转化，由于激光微

19、束小于细胞器，它可以在亚显微水平上直接对细胞器穿孔，实现外源DNA对细胞器的转移。第三章 植物外源DNA的导入n缺点：1、需要昂贵的仪器设备，转化频率只有103104；2、其稳定性和安全性目前还不如电激法和基因枪法。第三章第三章植物外源植物外源DNA的导入的导入n一、脂质体介导法一、脂质体介导法 脂质体介导法是用脂类化学物质合成人工脂质膜，把外源DNA分子包裹在膜内形成脂质体，然后通过植物原生质体的吞噬或融合作用把内含的DNA转入到受体细胞中。第三章 植物外源DNA的导入n脂质体是由磷脂组成的膜状结构，用它包装外脂质体是由磷脂组成的膜状结构，用它包装外源源DNA分子，然后与植物原生质体共保温。

20、于分子，然后与植物原生质体共保温。于是脂质体与原生质体膜结构之间发生相互作用，是脂质体与原生质体膜结构之间发生相互作用，尔后通过细胞的内吞作用而将外源尔后通过细胞的内吞作用而将外源DNA高效地高效地纳入植物的原生质体。纳入植物的原生质体。这种方法具有保护这种方法具有保护DNA在导入细胞之前免受核在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了对细胞的毒性效应，酸酶的降解作用，降低了对细胞的毒性效应，适用的植物种类广泛，重复性高包装在脂质体适用的植物种类广泛，重复性高包装在脂质体内的内的DNA可稳定地贮藏等优点。可稳定地贮藏等优点。第三章 植物外源DNA的导入n二、病毒介导法二、病毒介导法 将病毒基因

21、组中对病毒繁殖非必需的一段核苷酸序列去掉，换上一小段外源DNA，而不影响病毒基因组正常的包装，病毒侵染植株或组织后，可通过系统感染把外源基因转移到细胞。第三章 植物外源DNA的导入n三、电泳转移法三、电泳转移法 借在一定电场强度下由负极向正极泳动的DNA泳动力，将DNA引入到靠正极端的受体组织细胞中。细胞壁是以纤维丝为基质而组成的，含有许多小孔，在电场中DNA迁移可通过细胞壁的小孔，并可通过质膜而进入细胞。第三章 植物外源DNA的导入n四、转座子介导法四、转座子介导法 将植物内源转座子分离出来，构建在含有目的基因的表达载体上，并通过适当的方法将之导入到受体细胞中，利用转座子的转座功能，可将其邻

22、近的目的基因转移到受体细胞的染色体上，即可实现外源基因的有效整合与表达。转基因植物的鉴定主要集中在转基因植物的鉴定主要集中在DNA、RNA和目的蛋白和目的蛋白三个层面上。三个层面上。1.DNA水平水平PCR，southern杂交；斑点杂交（杂交；斑点杂交（dotblotting）:是是在在southern杂交基础上发展而来的快速检测特异核酸杂交基础上发展而来的快速检测特异核酸的方法。其基本的原理是通过抽真空的方式将加在多孔的方法。其基本的原理是通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品直接转移到杂交膜上，然后再过滤进样器上的核酸样品直接转移到杂交膜上，然后再按按southern杂交法进行杂交；杂交法进行杂交；PCR。2.RNA水平水平Northern杂交；杂交；RT-PCR（逆转录（逆转录PCR）：先将）：先将mRNA转录成转录成cDNA，再设计一对引物扩增杂交分子。，再设计一对引物扩增杂交分子。3.蛋白质水平蛋白质水平western杂交杂交,elisa等。等。