细胞培养基本技术

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1、第三章第三章 细胞培养基本技术细胞培养基本技术况海斌南昌大学医学院生理学教研室南昌大学医学院生理学教研室生殖内分泌研究室生殖内分泌研究室内容：原代细胞分离、培养（酶消化法和组织块培养原代细胞分离、培养（酶消化法和组织块培养法）。法）。细胞生长状况的观察。细胞生长状况的观察。培养细胞一代生长过程。培养细胞一代生长过程。传代。传代。冻存与复苏。冻存与复苏。细胞培养注意事项（如细胞污染）。细胞培养注意事项（如细胞污染）。细胞培养的一些专业术语介绍（如细胞株、细胞培养的一些专业术语介绍（如细胞株、系，上皮细胞型、成纤维细胞型）系，上皮细胞型、成纤维细胞型）第一节 细胞原代培养原代培养原代培养也叫初代培

2、养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。原代培养组织或细胞的特点：原代培养组织或细胞的特点：1组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传性，最接近和反映体内生长特性，是药物测试、细胞分化等实验的很好对象；2.缺点是成分组成比较复杂，因而原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需对细胞进行短期传代后进行。一、原代培养的方法一、原代培养的方法 (一)、消化培养法 (二)、组织块培养法（三）、其它（如机械方法）(一)、消化培养法1、培养前的准备、培养前的准备-培养用品的消毒培养用品的消毒根据所要进行的具体培养对象如组织块贴壁原代培根据所要进行

3、的具体培养对象如组织块贴壁原代培养、末梢血白细胞培养、传代培养等，准备培养所养、末梢血白细胞培养、传代培养等，准备培养所需器械和物品，清点无误后进行清洗、包装和消毒需器械和物品，清点无误后进行清洗、包装和消毒灭菌。灭菌。-培养室的消毒培养室的消毒培养室每天用培养室每天用0.2%的新洁尔灭或的新洁尔灭或2%5%的来苏儿的来苏儿拖洗地面一次（拖布专用），拖洗地面一次（拖布专用），30瓦紫外灯管照射消瓦紫外灯管照射消毒毒3050分钟。分钟。-超净工作台的消毒超净工作台的消毒2、无菌培养操作注意事项：、无菌培养操作注意事项：（为保证无菌，除实验所需物品需预先消毒外，实验中还需保持无菌操作）。-工作台面

4、上的用品要布局合理，原则上是右手使用的东西置右侧，左手使用的东西置左侧，酒精灯置中央；-实验前点燃酒精灯，一切操作如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都应在火焰近处并经过烧灼进行。3、常用消化试剂：常用消化试剂：胰蛋白酶、胶原酶、蛋白水解酶、EDTA4、原代细胞培养程序1、取材、取材2、漂洗、漂洗3、剪切、剪切4、消化、消化5、过滤、过滤6、清洗、清洗7、计数、计数8、接种、接种（1）、培养细胞的取材）、培养细胞的取材1.取材的组织最好尽快培养，若不能及时培养，可将组织浸泡于培养液内放置于冰浴或40C冰箱。若组织块很大，应先将其切成1cm2以下的小块再低温保存，但时间不能超过24小时，因放置时间长

5、或组织块太大都易造成细胞的死亡；2.取材时严格无菌操作。用预先消毒好的器皿和带有少量培养液的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化学试剂及有害药物如碘、汞等。从消化道及周围有坏死组织等有污染因素存在的区域取材时，为减少污染，可用含5001000单位/ml的青、链霉素BSS液漂洗510分钟，或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10分钟再作培养；3.取材时要细心去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及坏死组织等。修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于少量培养液中；原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）原

6、代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）n n取材取材取材取材：用用用用颈椎脱位法颈椎脱位法颈椎脱位法颈椎脱位法使使使使孕鼠孕鼠孕鼠孕鼠迅速死亡。把迅速死亡。把迅速死亡。把迅速死亡。把整个孕鼠整个孕鼠整个孕鼠整个孕鼠浸入盛有浸入盛有浸入盛有浸入盛有75757575乙醇乙醇乙醇乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超超超超净台净台净台净台。用消过毒的剪刀。用消过毒的剪刀。用消过毒的剪刀。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开在躯干中部环行剪开在躯干中部环行剪开在躯干中部环

7、行剪开皮肤，剖腹取出皮肤，剖腹取出皮肤，剖腹取出皮肤，剖腹取出子宫子宫子宫子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，剪开子宫，剪开子宫，剪开子宫，取出取出取出取出鼠胎，鼠胎，鼠胎，鼠胎，剪去剪去剪去剪去头、爪，头、爪，头、爪，头、爪，以以以以平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液洗去血污洗去血污洗去血污洗去血污n n切割切割切割切割：用用用用平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液将取出的将取出的将取出的将取出的组织块组织块组织块组织块清洗三次，然后用眼科清洗三次，然后用眼科清洗三次，然后用眼科清洗三

8、次，然后用眼科手术剪刀仔细将手术剪刀仔细将手术剪刀仔细将手术剪刀仔细将组织反复剪碎组织反复剪碎组织反复剪碎组织反复剪碎，直到成，直到成，直到成，直到成1mm1mm1mm1mm3 3 3 3左右的小块左右的小块左右的小块左右的小块，再，再，再，再用用用用平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清组织块自然沉淀到管底，弃去上清组织块自然沉淀到管底，弃去上清组织块自然沉淀到管底，弃去上清n n消化、接种培养消化、接

9、种培养消化、接种培养消化、接种培养：加入加入加入加入0.250.250.250.25胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶消化液消化液消化液消化液（5-105-105-105-10倍量倍量倍量倍量），与组织块混匀。置与组织块混匀。置与组织块混匀。置与组织块混匀。置37373737水浴，观察消化情况水浴，观察消化情况水浴，观察消化情况水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇每隔几分钟摇每隔几分钟摇每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入动一下试管），静止，吸去上清，加入动一下试管），静止，吸去上清，加入动一下试管），静止，吸去上清，加入5 5 5 510ml10ml10ml10ml细胞细胞细胞细胞培养液

10、培养液培养液培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养中培养中培养中培养（2）例如：滋养层细胞分离与培养：（A）真空负压抽吸的早期绒毛组织在无菌条件下置于冰浴PBS（含1 mM葡萄糖）中取回。（B）在无菌条件下立即用无Ca2+和Mg2+的PBS漂洗15-20次以除去血块。（C）用解剖刀片从基膜上轻轻刮下绒毛，用剪刀剪碎至1-2毫米左右。（D）加入5 胰蛋白酶330l(1：25)至10ml细胞悬液中，4消化45min。

11、勿动，静置，然后去上清。（E）重新加入消化液37消化10min。勿动，静置，然后去一半上清。加等体积Hams F12:DMEM 1:1(FD)培养液（内含10 胎牛血清、1 mM丙酮酸钠和2 mM谷氨酰胺）终止消化，吹打细胞悬液。（F）再加入终浓度为15 IU/ml的DNA酶37消化10 min。吹打细胞呈悬浮状，经80目和150目细胞筛过滤，1,000rpm离心10 min收集细胞。（G）重复离心洗涤二次，再次重悬细胞，细胞悬液经1.25-2.5BSA（FD配制）的密度梯度沉降1 h。（H）收集淡黄色的细胞滋养层细胞，清洗一次，接种于涂有I型胶原的24孔培养板中，于37，95 空气和5 CO

12、2条件下培养。（I）所得细胞经免疫荧光染色cytokeratin 7阳性，vimentin 阴性。本方法所获得细胞滋养层细胞纯度约为95%左右。（3）计数：细胞浓度的计算：nVolume(体积体积)n=長x寬x深度n=1mmx1mmx0.1mmn=0.1mm3n=1x10-4cm3(ml)n细胞密度细胞密度(个个/mL)=4个大方格的细胞总数个大方格的细胞总数/410-4n=4个大方格的细胞总数个大方格的细胞总数/4104动物细胞工程的实验室基础动物细胞工程的实验室基础 表3-3 培养器皿特性表3-3 培养器皿特性 表3-3 培养器皿特性培养器皿特性培养器皿特性培养器皿特性培养器皿特性培养器皿

13、培养器皿培养物备份培养物备份每孔面积每孔面积/cm2每孔推荐每孔推荐液体量液体量/ml预计的预计的HeLa细胞产量细胞产量多孔板多孔板微量滴定板微量滴定板960.320.1l105微量滴定板微量滴定板1440.320.111054孔板孔板42251056孔板孔板69.624210612孔板孔板124.513110624孔板孔板2420.52510548孔板孔板4810.25196孔板孔板9610.050.1Animal Cell BiotechnologyAnimal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA College of

14、Veterinary MedicineMA Bao-huaBao-hua动物细胞工程的实验室基础动物细胞工程的实验室基础 培养器皿培养器皿培养物备份培养物备份每孔面积每孔面积/cm2每孔推荐每孔推荐液体量液体量/ml预计的预计的HeLa细胞产量细胞产量培养皿直径培养皿直径30 mm16.921.710635 mm19.623210650 mm117.534410660 mml2l35510690nnn149101107培养器皿特性培养器皿特性培养器皿特性培养器皿特性Animal Cell BiotechnologyAnimal Cell Biotechnology College of Vet

15、erinary MedicineMA College of Veterinary MedicineMA Bao-huaBao-hua动物细胞工程的实验室基础动物细胞工程的实验室基础 培养器皿特性培养器皿特性培养器皿特性培养器皿特性培养器皿培养器皿培养物备份培养物备份每孔面积每孔面积/cm2每孔推荐液体每孔推荐液体量量/ml预计的预计的HeLa细胞产量细胞产量培养瓶培养瓶10号号1102210625号号1255510675号号l7510502107125号号l125251005107150号号l150251006107175号号l175501007107225号号1225501001108滚瓶滚

16、瓶18502002.5108搅拌瓶搅拌瓶500 ml(机械搅拌机械搅拌)15051075 000ml(吹气搅吹气搅拌拌)140004109Animal Cell BiotechnologyAnimal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA College of Veterinary MedicineMA Bao-huaBao-hua原代细胞培养程序:n1、取材、取材n2、漂洗、漂洗n3、剪切、剪切n4、消化、消化n5、过滤、过滤n6、清洗、清洗n7、计数、计数n8、接种、接种(4)原代细胞实验操作要领n除去组织块多余水分操作要领

17、。n器械使用的操作要领。n原代细胞混匀的操作要领。n严格无菌操作，离心管入台时要做好管口的消毒。n高密度接种，细胞多，调节环境能力大，细胞易存活。一般细胞接种数为5105/ml，高度分化二倍体细胞（肝脏、胰、神经组织接种数为106-108/ml。n高分化细胞常用塑料器皿培养，因塑料器材表面涂有多聚赖氨酸等碱性物质，可增加细胞贴壁率。用玻璃器材，细胞常不贴壁,需要涂细胞外基质。n要注意做好标记。培养板或培养瓶的标记：二、组织块培养法：n1、组织块翻转干涸法培养：适于组织块移植、组织量少和细胞易于游离出来的组织.流程：直接从机体某一器官取下组织。尽可能剥除脂肪、纤维结缔组织等。用Hanks液清洗组

18、织。将组织切割后剪成碎块（1-2mm3)。低速离心去上清。将组织小块接种于培养器皿内，组织块翻转干涸法培养。经过3-4h的锚定以后，轻轻的加入0.5培养基。注意：n铺细胞外基质：FN（纤粘连蛋白）、胶原、或MatrigelTM胶。nMatrigelTM胶（BD公司）特点：4情况下呈液态，至37培养箱中，30min后凝固成胶体状。n测量细胞迁移的距离所用的软件为ImageJ。关键的过程：n组织块贴壁时间灵活掌握：n5-8h翻转.2、湿润系统培养组织块：n组织块贴壁10分钟后,先加0.5ml培养液湿润组织块，37度孵育过夜，次日从瓶侧面缓慢加入2ml培养基。总的流程：总的流程：（三）、非化学法游离

19、细胞（三）、非化学法游离细胞1、离心：、离心：取材为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，可采用离心法分离。一般用5001000rpm的低速离心，时间约510分钟。若一次离心的样品量很多，时间可适当延长，但离心速度过大，时间过长，细胞常会因挤压而造成损伤甚至死亡。2.切割分离：在进行组织块培养时，可采用剪切法。一般多剪切成1mm2左右大小的块。主要步骤：取1cm2大小的组织块，置入青霉素瓶或小烧杯中，左手斜位持容器，右手持眼科剪或弯剪（柄愈长愈好）伸入容器中，反复剪切组织至要求大小为止（成糊状）。加入35mlHanks液，轻轻吹打片刻，低速离心，去上清，余下组织块即可用于培养。3.机械分离：某些

20、软组织如脑、胚胎及一些肿瘤组织可采用此法进行分散，有以下方法：n(1)把组织放在注射器内通过6号针头挤压出；n(2)剪切到一定程度后用吸管反复吹打；n(3)反复用剪刀剪切后收集脱落下来的细胞；n(4)挤压通过不锈钢纱网；n(5)用Dounce宽缝玻璃匀浆器手动慢速研磨组织。第二节 培养细胞的观察一、培养细胞生长状况常规检查n1、培养液：颜色与透明度的变化n2、细胞生长状况。n3、细胞形态变化。n4、微生物污染。1、培养液PH值（颜色变化）n变黄，表示PH值下降，细胞生长旺盛，代谢产生的酸性物不断积累导致。n变红或紫红色，表示PH值上升，细胞生长停滞、死亡。n一般生长稳定的细胞需要2-3天换液1

21、次，生长慢的细胞需要3-4天换液一次。原代细胞换液：n原代细胞经24小时培养，培养液颜色变浅，表示细胞代谢好。少量换液可刺激细胞生长。n通常每周两次，每次换半量或1/5-1/3量。原代细胞第1次换液时，切记不要把培养液全部倒掉。（1）培养液换半量的方法：nA.瓶口消毒nB.从瓶侧面吸去原培养液量的一半.nC.从瓶侧面补加等体积新培养液.nD.培养液覆盖细胞面,瓶口消毒加盖.(2)细胞系(株)换液:n条件合适时生长迅速，过夜就变黄，可进行全量换液。这种情况下，最好减少细胞接种数，延长换液的时间。n方法:2、细胞生长状况。n常规应特别注意细胞的生长增殖情况。n原代细胞：经历一个适应或潜伏期。n细胞

22、系：多为24小时以内。n细胞长满瓶底80%时应及时传代。3、细胞形态变化：n生长良好细胞：透明度大，折光性强，轮廓不清。n生长状态不良时，细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡，脂滴，颗粒样物质，细胞之间空隙加大。4、微生物污染：n培养液颜色与透明度：n培养液混浊，液体内漂菌丝或细胞菌。n支原体污染，没有明显症状，但细胞生长却明显变缓。细胞培养的污染和检测细胞培养的污染和检测n细胞污染的种类细胞污染的种类 细菌、酵母菌、霉菌和病毒细菌、酵母菌、霉菌和病毒n污染源污染源 无菌操作技术不当无菌操作技术不当 操作室环境不佳操作室环境不佳 污染之血清污染之血清 污染之细胞污染之细胞 细菌培养液被洋

23、葱佰克霍尔德菌污染了。细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。洋葱佰克霍尔德菌（洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单）原属假单胞菌属，是植物病原菌。胞菌属，是植物病原菌。白色念珠菌污染白色念珠菌污染 真菌感染真菌感染支原体污染电镜照片支原体污染电镜照片,煎蛋状和其他形状煎蛋状和其他形状 二、培养细胞分型：体外培养细胞的生长类型体外培养细胞的生长类型 按生长方式按生长方式:2型型 1 1、粘附型（贴壁依赖性）细胞粘附型（贴壁依赖性）细胞:附着在某一固相支持物表面才能附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。绝大多数有机体细胞属粘附型细胞生长的细胞。绝大多数有机体细胞属粘附

24、型细胞 2 2、悬浮型细胞悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬生长的细胞。只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长浮状态下生长 粘附粘附(贴壁贴壁)依赖型依赖型(性性)细胞：唯有粘附于固相表面才细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞能生存的细胞细胞在体内、外的粘附方式：存在差异细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 体内体内：粘附是全方位粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征外形具有复杂的立体特征 体外体外：多数情况，细胞只有一个附着平面多数情况，细胞只有一个附着平

25、面 外形一般与体内时明显不同外形一般与体内时明显不同体外培养的贴壁细胞：按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型 贴壁型细胞按照其生长类型进行分类贴壁型细胞按照其生长类型进行分类：根据形态大致的不同，主要根据形态大致的不同，主要2类：类：上皮样上皮样 成纤维细胞样成纤维细胞样其它，不定型其它，不定型（游走细胞型以及多细胞型）（游走细胞型以及多细胞型）（1）上皮样细胞型）上皮样细胞型 名称：名称：仅形态上似体内仅形态上似体内，实际上不完全等于体内情况。，实际上不完全等于体内情况。来源（类似于返祖现象）：来源（类似于返祖现象）：来源于内、外胚层来源于内、外胚层，如：皮肤及其衍生物如：皮肤及其衍生物

26、消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤上皮性肿瘤形态：形态：类似类似体内的体内的上皮细胞上皮细胞 扁平扁平，不规则多角形不规则多角形，中有圆形核，中有圆形核 生长特点：生长特点：易相连易相连成片成片 相靠相靠紧密相连紧密相连成薄层成薄层铺石状铺石状 生长生长时呈时呈膜状膜状移动移动 很少很少脱离细胞群而脱离细胞群而单个活动单个活动 （2）成纤维细胞样细胞）成纤维细胞样细胞 名称：名称：凡在凡在培养中形态与成纤维细胞类似培养中形态与成纤维细胞类似来源：来源：由由中胚层间充质组织起源中胚层间充质组织起源的组织的组织 如如：真真正正的的成成纤纤维维细细胞胞，心心肌肌，平平滑滑肌肌，成骨细胞

27、，血管内皮成骨细胞，血管内皮形形态态：似似体体内内成成纤纤维维细细胞胞的的形形态态，胞胞体体梭梭形形或或不不规规则则三三角角形形，胞胞质质向向外外伸伸出出23个个长长短短不不等等的的突起，突起，中有卵圆形核中有卵圆形核生长特点：生长特点：排列成排列成放射状放射状，漩涡状，漩涡状 并不紧靠连成片并不紧靠连成片，细胞细胞细胞接触易断开而细胞接触易断开而 单独行动单独行动 游离的游离的单独的单独的成纤维样细胞，成纤维样细胞，常有几个常有几个伸长的细胞突起伸长的细胞突起 （3）悬浮生长型）悬浮生长型概念概念 培养时培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状

28、态下生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源来源 自自血血，脾或骨髓，脾或骨髓，尤以血中白细胞尤以血中白细胞 癌肿细胞也可能癌肿细胞也可能特点特点 在在悬浮中生长良好悬浮中生长良好 细胞细胞圆形圆形，单个或小细胞团，单个或小细胞团优点优点 生存空间大，提供数量大生存空间大，提供数量大 传代方便传代方便(不需消化不需消化)易于收获易于收获 可获得稳定状态可获得稳定状态缺点缺点 观察不方便观察不方便 很多细胞不能悬浮生长很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞尤以正常细胞)（4）培养细胞的培养细胞的形态不稳定形态不稳定条件改变条件改变，细胞形态，细胞形态可有变化。可有变化。培养细胞形态不稳定培养细胞形态

29、不稳定血清血清 Hela 高高血清血清 低血清低血清 成纤维细胞样成纤维细胞样 上皮样细胞上皮样细胞 pH Hela 太酸或太碱太酸或太碱 标准标准pH 成纤维细胞样成纤维细胞样 上皮样细胞上皮样细胞 细胞密度细胞密度 3T3 低密度低密度 高密度高密度 成纤维细胞样成纤维细胞样 上皮样细胞上皮样细胞 生长状态改变生长状态改变 悬浮或贴附悬浮或贴附 悬浮悬浮 贴附贴附 圆形圆形 成纤维或上皮样成纤维或上皮样 转化与否转化与否 未转化未转化 转化后转化后 成纤维样成纤维样 可成上皮样可成上皮样 三、细胞培养中的常用术语：1.组组织织培培养养(Tissue(Tissue Culture)Cultu

30、re)：指的是从体内取出组织，在模拟体内生理环境，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。2.器器官官培培养养（Organ Organ CultureCulture）：培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。3.细细胞胞培培养养(Cell(Cell Culture)Culture)：培养物是单个细胞和细胞群。4、*原代培养（primary culture）：从体内取出细胞或组织的第一次培养。5、*传代（passage）也称再培养无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。也称再培养。6、*细胞系（cell line

31、）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。7、亚系（subline）：由原细胞系分离出的具有与原细胞系不同性状的细胞系。8、有限细胞系（finite cell line）：细胞系形成后仅能维持有限传代次数，最后死亡。9、连续或无限细胞系（continuous cell line or infinite cell line）：具有无限繁殖能力（获得不死性：immortality）和能反复进行传代细胞系。10、*细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。11、亚株（substrain）：由原细胞株分离出的具有原株性状不同

32、的细胞株。12、体外培养转化（in vitro transformation）：细胞在体外培养中发生与原细胞遗传性状不同的变化，但不一定具有致癌性。13、汇合（confluent）：细胞相互连接成片占据所有底物面积。14、超汇合（super confluent）：单层培养细胞附在底物上生长，汇合后发展成多层状态。15、接触抑制（contact inhibition）：细胞汇合相互接触后失去运动的现象。16*克隆（clone）：由单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体。17、克隆形成率（cloning effeciency）：向底物接种单细胞悬液能形成细胞小群的百分数。四、培养细胞一代生长过程：体外

33、培养细胞从细胞接种到分离再培养，每代贴附生长细胞的生长过程一般要经过以下五个阶段。游离期、贴壁期、潜伏期、指数增生期、停止期。细胞传代的三个阶段细胞传代的三个阶段 1）游离期：细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形.10分钟一4小时。n细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。n底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等n血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。n进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的

34、功能基团）2）贴壁期：）贴壁期：n3）潜伏期n此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。n4）对数生长期（指数增生期）：）对数生长期（指数增生期）：n细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。v指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制接触抑制（Contactinhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。v癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制密度抑制（Densityinhi

35、bition）n5）停止期（平台期）：n细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂n机制：接触抑制、密度依赖性机制：接触抑制、密度依赖性四、原代培养细胞的生命期n原代培养期n传代期n衰退期细胞培养的生长过程：a.原代培养或初代培养期首次培养(14周)n n细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长始生长n n如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密度适宜，5 5天到一周即可形天到一周即可形成单层成单层b.传代期细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种至两个或者更多的培养器皿中(数天到一周左右)n n目的：传代以便获得稳定的细胞

36、株或得到大量的同种细目的：传代以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细目的：传代以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细目的：传代以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续胞，并维持细胞种的延续胞，并维持细胞种的延续胞，并维持细胞种的延续n n培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以营养枯竭，将培养的细胞

37、分散，从容器中取出，以营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:21:21:21:2或或或或l:3l:3l:3l:3或或或或l:5l:5l:5l:5以以以以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养细胞传代方法：3种1.悬浮生长细胞传代n离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。n直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2.半悬浮生长细胞传代（He

38、la细胞）n此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3.贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代n采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法：n1.吸光培养瓶中的培养液n2.加入0.5-2ml0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），然后两种方式处理：一种30S后，吸去消化液，剩余的酶液继续作用，后在相差显微镜下观察。第二种，不吸去消化液，静置2-10min（显微镜下动态监测）。n n在倒置镜下观察被消化的细胞，如果胞质回缩，细胞在倒置镜下观察被消化的细胞，如果胞质回缩，细胞在倒置镜下观察被消化的细胞，如果胞质回

39、缩，细胞在倒置镜下观察被消化的细胞，如果胞质回缩，细胞变圆，相互之间不再连接成片变圆，相互之间不再连接成片变圆，相互之间不再连接成片变圆，相互之间不再连接成片.n3.吸去胰蛋白酶液，加入含血清的培养液。n4.用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液(按顺序)。然后离心沉淀细胞。n5.吸取1:2-5细胞悬液，接种于新的培养瓶内。n6.加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。n7.将后者放入培养箱中培养。盖玻片条细胞培养法：n1、盖玻片的准备：n（1）购买n（2）小砂轮将盖玻片划成大小不一数块，再经95%酒精浸泡，蒸馏水冲洗，干燥备用。n（3）消毒（硫酸纸包或小皿）n2、细胞接种

40、。培养皿先加少量培养液，再加盖玻片。在此期间细胞开始时虽仍然存活，但生殖已经很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰亡、死亡(传代3050次以后)c.衰退期第四节第四节 细胞冻存、复苏和运输细胞冻存、复苏和运输冻存和复苏的原则：慢冻快融n当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰形成冰晶。晶。nn如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。低温保护剂的应用n在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。n常用的低温保护剂是

41、DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法n1、预先配制冻存液：含20%血清培养基10%DMSOn2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（11065106细胞/ml)n3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。冷冻保存要点：冷冻保存要点：n n冷冻过程要缓慢。冷冻过程要缓慢。冷冻过程要缓慢。冷冻过程要缓慢。4 304 304 304 3060 60 60 60 分钟分钟分钟分钟-20

42、20 20 20 30 30 30 30 分钟分钟分钟分钟 -80-80-80-80 1616161618 18 18 18 小时（或过夜）小时（或过夜）小时（或过夜）小时（或过夜）液氮长期保存液氮长期保存液氮长期保存液氮长期保存n n冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90909090，无微生物污染。细胞浓度控制在：无微生物污染。细胞浓度控制在：无微生物污染。细胞浓度控制在：无微生物污染。细胞浓度控制在：1 1 1 1101010107 7 7 75 5 5 5101010107 7

43、7 7/ml/ml/ml/ml。简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。根据原理：n标准程序：n当温度在-25以上时，12/minn当温度达-25以下时，510/minn当温度达-100时，可迅速放入液氮中n细胞冻存器细胞复苏方法n（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738水浴中，使其融化（1分钟左右）。n（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的5-10倍以上。n（3）低速离心10分钟。n（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。解冻与复苏要点：解冻与复苏要

44、点：n n快速解冻快速解冻n n冻存细胞从液氮中取出后，立即放入冻存细胞从液氮中取出后，立即放入冻存细胞从液氮中取出后，立即放入冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37373737水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 1 1 1 分钟分钟分钟分钟内全部融化（不要超过内全部融化（不要超过内全部融化（不要超过内全部融化（不要超过3 3 3 3 分钟）分钟）分钟）分钟）n n24 24 小时后再用新鲜完全培养液替换旧小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除培养液，以去除DMSODMSO细胞运输：n（1）长距离运输（

45、几天）长距离运输（几天）n选择生长良好细胞，换细胞液，补充新培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖，n瓶子口用胶密封，并用棉花包，放在携带者贴身口袋带回，或用包装盒空运。n（2）短距离运输（几小时）短距离运输（几小时）n去掉大部分生长液，仅留少量液体覆盖单层细胞，防止细胞干燥，将细胞附着面朝上带回。n（3）液氮冻存运输）液氮冻存运输细胞培养常见问题解答：细胞培养常见问题解答：3 3、为何培养基保存于、为何培养基保存于4 C 4 C 冰箱中，冰箱中，颜色会偏颜色会偏暗红色，暗红色，且且pHpH值会越来越偏碱性？值会越来越偏碱性？n 培养基保存于培养基保存于4C 4C 冰箱中，冰箱中，培养基内之培

46、养基内之CO2 CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂基中之酸碱指示剂(通常为通常为phenol red)phenol red)的颜色也的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之可以通入无菌过滤之CO2CO2，以调整，以调整pH pH 值。值。4 4、培养细胞生长减慢可能原因：、培养细胞生长减慢可能原因：n n由于更换不同培养液或血清由于更换不同培养液或血清n n比较新培养液

47、与原培养液成分，比较新血清比较新培养液与原培养液成分，比较新血清比较新培养液与原培养液成分，比较新血清比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验与旧血清支持细胞生长实验与旧血清支持细胞生长实验与旧血清支持细胞生长实验n n增加起始培养细胞浓度增加起始培养细胞浓度增加起始培养细胞浓度增加起始培养细胞浓度n n培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏n n让细胞逐渐适应新培养液。换入新鲜配制培让细胞逐渐适应新培养液。换入新鲜配制培让细胞逐渐适应新培养液。换入新鲜配制培让细胞逐渐适应新

48、培养液。换入新鲜配制培养液。补加谷氨酰胺或生长因子养液。补加谷氨酰胺或生长因子养液。补加谷氨酰胺或生长因子养液。补加谷氨酰胺或生长因子n n培养物中有少量细菌或真菌污染培养物中有少量细菌或真菌污染n n用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。培养物。或用抗生素除菌。培养物。或用抗生素除菌。培养物。或用抗生素除菌。n n试剂保存不当试剂保存不当n n血清需保存在血清需保存在血清需保存在血清需保存在-5-5-5-5 到到到到-20-20-20-20。培养液需在。培

49、养液需在。培养液需在。培养液需在2 2 2 28888避光保存。含血清完全培养液在避光保存。含血清完全培养液在避光保存。含血清完全培养液在避光保存。含血清完全培养液在2-82-82-82-8保存，并在保存，并在保存，并在保存，并在2 2 2 2 周内用完周内用完周内用完周内用完5 5、培养细胞不贴壁、培养细胞不贴壁n n胰蛋白酶消化过度胰蛋白酶消化过度n n缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度n n支原体污染支原体污染n n分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养分离培养物，检测支

50、原体。清洁支架和培养分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物箱。如发现支原体污染，丢弃培养物箱。如发现支原体污染，丢弃培养物箱。如发现支原体污染，丢弃培养物n n培养液中无贴壁因子培养液中无贴壁因子6 6、欲将一般动物细胞离心下来，、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？其离心速率应为多少转速？n欲回收动物细胞，其离心速率一般为欲回收动物细胞，其离心速率一般为300 xg(300 xg(约约1,000rpm)1,000rpm)，5-10 5-10 分钟，分钟，过高之转速，过高之转速，将造成细胞死亡将造成细胞死亡 8

51、 8、培养液、培养液pH pH 值变化太快值变化太快n nCO2 CO2 张力不对张力不对n n按培养液中按培养液中按培养液中按培养液中NaHCO3 NaHCO3 NaHCO3 NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内浓度增加或减少培养箱内浓度增加或减少培养箱内浓度增加或减少培养箱内CO2 CO2 CO2 CO2 浓度，浓度，浓度，浓度，2.0g/L 2.0g/L 2.0g/L 2.0g/L 到到到到3.7g/L 3.7g/L 3.7g/L 3.7g/L 浓度浓度浓度浓度NaHCO3 NaHCO3 NaHCO3 NaHCO3 对对对对应应应应CO2 CO2 CO2 CO2 浓度为浓度为浓度为浓度为

52、5 5 5 5 到到到到10101010n n改用不依赖改用不依赖改用不依赖改用不依赖CO2 CO2 CO2 CO2 培养液培养液培养液培养液n n培养瓶盖拧得太紧培养瓶盖拧得太紧n n松开瓶盖松开瓶盖松开瓶盖松开瓶盖1/4 1/4 1/4 1/4 圈圈圈圈n nNaHCO3 NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足缓冲系统缓冲力不足n n加加加加HEPES HEPES HEPES HEPES 缓冲液至缓冲液至缓冲液至缓冲液至10 10 10 10 到到到到25mM 25mM 25mM 25mM 终浓度终浓度终浓度终浓度 n n培养液中盐浓度不正确培养液中盐浓度不正确n n在在在在CO2 CO2 CO

53、2 CO2 培养环境中改用基于培养环境中改用基于培养环境中改用基于培养环境中改用基于EarlesEarlesEarlesEarles 盐制盐制盐制盐制的培养液，在大气培养环境中培养改用的培养液，在大气培养环境中培养改用的培养液，在大气培养环境中培养改用的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks Hanks Hanks Hanks 盐配制的培养液盐配制的培养液盐配制的培养液盐配制的培养液n n细菌、酵母或真菌污染细菌、酵母或真菌污染n n丢弃培养物或用抗生素除菌丢弃培养物或用抗生素除菌丢弃培养物或用抗生素除菌丢弃培养物或用抗生素除菌9 9、培养液出现沉淀，、培养液出现沉淀，但但pHpH值不变值

54、不变n n用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来分沉淀下来n n用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌n n冰冻保存培养液冰冻保存培养液n n将培养液加热到将培养液加热到将培养液加热到将培养液加热到37373737，摇动使其溶解如沉，摇动使其溶解如沉，摇动使其溶解如沉，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液淀仍然存在，丢弃培养液淀仍然存在，丢弃培养液淀仍然存在，丢弃培养液1010、培养液出现沉淀，同时、培养液出现沉淀，同时pH pH 发生变化发生变化

55、n n细菌或真菌污染细菌或真菌污染n n丢弃培养物丢弃培养物丢弃培养物丢弃培养物n n抗生素除菌抗生素除菌抗生素除菌抗生素除菌1111、原代细胞培养物污染、原代细胞培养物污染n n原代培养组织在进入培养前已污染原代培养组织在进入培养前已污染n n培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织反复冲洗组织反复冲洗组织反复冲洗组织1212、支原体、支原体(mycoplasmamycoplasma)污染的细胞，污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？是否能以肉眼观察出异状？n不能。除极有经验之专家外，大

56、多数遭不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，受支原体污染的细胞株，无法以其外观无法以其外观分辨之。分辨之。n如有支原体污染，直接灭菌后丢弃，以如有支原体污染，直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。避免污染其它细胞株。培养细胞活力测定n细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。n任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。n1.细胞克隆形成率实验：单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力。n克隆形成率比克隆形成数接种细胞数n缺点：操作繁琐n优点：精确、可靠n2.台盼蓝法n活

57、细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞恬力 n已淘汰n3.四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，n四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值nMTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。n操作步骤n（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），

58、37、5nCO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）n（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时。n（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。n（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制3.MTT法(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物(formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。DMSO能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比，再用酶标仪测定OD值

59、nMTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。操作步骤a.100L单细胞悬液接种于96孔板(5104)。b.培养24h后，加药，设六个平行样。c.给药72h后，加入0.5mg/mL的MTT液(50L)；继续培养4h。d.吸出孔内培养液后，加入DMSO(200L)，然后微孔板扳荡器上振荡10分钟。e.酶标仪检测各孔OD值(检测波长570nm)抑制率=(1-给药组平均OD/对照组平均OD)100%实验结果：剂量细胞抑制率(%)(g/mL)SGC-7901HepG-21-15.2-19.95072.056.910083.078.215082.979.5IC50分别

60、为22.406g/mL和31.429g/mL培养细胞活力测定n细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。n任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。n1细胞克隆形成率实验单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力n克隆形成率比克隆形成数接种细胞数n缺点：操作繁琐n优点：精确、可靠2台盼蓝法n活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占n细胞中的百分比表示细胞恬力 nn已淘汰3四唑盐（MTT）比色法n四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，n四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的

61、蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值nMTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试n验、肿瘤放射敏感性实验等。n操作步骤n（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5nCO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）n（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时。n（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置

62、于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。n（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制n操作步骤n（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5nCO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）n（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时。n（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。n（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长为570nm）。记录结果，绘制细胞生长曲线细胞计数及活力测定n实验原理：当待测细

63、胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。n具体操作：1.盖好盖玻片：取血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。2.制备计数用的细胞悬液：0.5ml细胞悬液到一离心管中，加入0.5ml台盼蓝染液（0.4）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，分别数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中死细胞和活细胞数。5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml（四个大格子细胞数/4)2104 说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）1.0mm（宽）0.1mm（高）0.1mm3而1ml1000mm3