动物抗血清及其制备技术要点与应用进展

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1、动物抗血清及其制备技术要点与应用进展抗血清对于把握动物疫病具有很重要的作用。本文综述了动物抗血清的进展历程，产品技术现状、制备技术要点与最争论应用进展以及面临的问题等方面。作为动物疫病预防把握的有力武器，兽用生物制品在畜牧业的进展中发挥着越来越重要的作用。而随着科学技术的飞速进展，兽用生物制品也发生了翻天覆地的变化，技术、方法的不断消灭和广泛应用，为我国兽用生物制品的进展进步供给了强大的助力。兽用生物制品可以分为以下四类：预防用生物制品;治疗用生物制品;诊断检测用生物制品;免疫调整类生物制品。其中，治疗用生物制品包括抗血清、高免蛋黄抗体、免疫球蛋白及干扰素等。各种生物制品的种类比较多，但是有些

2、产品的质量却不是很高，有待于进一步改进。本文就治疗用生物制品中的抗血清及其在最近几年的争论应用进展做一综述。抗血清又称高免血清或抗病血清，是一种含有高效价特异性抗体的动物血 清。抗血清包括抗毒素、抗细菌、抗病毒血清。抗毒素血清：用细菌类毒素或毒素免疫异源动物所取得的血清， 如破伤风抗毒素;抗菌血清：用细菌免疫异源动物所取得的血清，如抗炭疽血清;抗病毒血清：用病毒免疫异源动物所取得的血清，如抗猪瘟血清。1 抗血清的进展历程两个世纪前，人们将白喉杆菌培育上清中分别到的可溶性毒素注入马体内， 得到的抗血清可以治疗白喉，这是第一个用抗体治疗的例子。经过两百多年的进展，人们已经可以通过各种免疫手段来获得

3、针对毒素、病毒、细菌乃至癌细胞的特异性抗体。在我国，抗血清的争论利用也比较早。上世纪初，当时的中华民国筹建第一个血清所青岛商品检验局血清所，始终到抗日战斗的先后 20 年中， 争论和生产了多种兽用抗血清，有：牛瘟抗血清、猪瘟抗血清、猪肺疫抗血清、牛出败抗血清、禽霍乱抗血清、猪丹毒抗血清等1。建国后，经过近 60 年的进展，抗血清的争论和应用也已经相当成熟。目前，对血清抗体的争论已进入的进展阶段，即免疫球蛋白的争论和应用。2 产品及技术现状据版的中华人民共和国兽药典(以下简称“兽药典”)可知，国家已经批准生产应用的抗血清有：抗气肿疽血清、抗炭疽血清、抗绵羊痢疾血清、抗猪羊多杀性巴氏杆菌病血清、抗

4、猪瘟血清、破伤风抗毒素、抗猪丹毒血清等，以及抗犬瘟热血清、抗细小病毒病血清等“非兽药典”产品2。与抗血清相并列的高免卵黄抗体也比较成熟，现在市场上的产品有小鹅瘟精制蛋黄抗体、鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体、鸡传染性法氏囊病精制蛋黄抗体，其中前两种在药典中已有具体的质量标准。而针对于动物疫病的免疫球蛋白，在市场上还没有相关的产品。而国外抗体方面的争论和应用要较国内还要早，且已经上市的产品比国内的产品更多更全面3。相对于人的治疗性的抗体产品，动物的抗血清产品也显得相对缺乏。虽然抗体产品比较少，但专利技术却比较多。经国家学问产权局专利查询网站查实，到目前为止，已经公布的动物性抗血清的专利技术已有 20 余

5、种，卵黄抗体的专利技术 40 多种，而免疫球蛋白的专利技术也近 20 种。而查询美国学问产权局的网站得知，近 10 年美国在抗血清相关方面的专利有 10 多项。3 制备要点及相关技术的争论进展谈到抗血清，无论是在科学争论中还是在应用实践中，它都起着很大的作用。如在争论中，可用作标准阳性血清;在临床应用中，则是一种很好的治疗性抗体。抗血清的制备技术虽说目前比较成熟，但是还会在不同层面上消灭各种各样的问题。结合前人的争论成果，依托本工程组的相关争论课题，总结了一套抗血清制备技术的关键点，并对最近几年相关的争论应用进展进展概述。3.1 抗血清的作用及其制备理论特异性抗血清可供给相应疫病短期(12 周

6、)的被动免疫，效果确实，广泛使用于疫病早期治疗和疫病流行早期与未感染动物的短期预防，也可抑制引起器官移植死亡的淋巴细胞活动，特异性抗血清还可用于疾病诊断与微生物鉴定。但存在剂量要求大，保护期短，价格昂贵等缺点，而且需在隔离条件下进展，以防散毒。通常对紧急预防的动物，仍需进展常规的免疫接种4。抗血清既可以利用病原微生物抗原免疫同种或异种动物后采血提取血清制备,也可以提取耐过的自然感染动物血清制造。通常是给动物适当反复屡次注射特定的病原微生物或其代谢产物等物质(抗原、免疫原)，促使动物不断产生免疫应答反响(体液免疫与细胞免疫)，从而使血清中含有大量相应的特异性抗体，然后采(放)血、分别血清制成。具

7、体的制备过程，各种疾病略有不同，且已有大量的文献报道511。下面将着重对作者制备抗血清过程的各个环节中总结的一些阅历进展阐述。3.2 抗血清的制备技术要点及争论进展3.2.1 动物的选择抗血清制备的第一步，也是比较关键的一步是免疫动物的选择。可作为免疫用的动物多为哺乳类和禽类，主要有家兔、绵羊、马、牛、猪、驴、豚鼠和鸡等，其中试验常用家兔、绵羊、鸡和豚鼠。张振兴12总结出，大批抗血清是多用马、牛生产的，由于一般状况下马、牛具有产量大、本钱低、饲养治理便利等优点，在高免中具有不受接种途径、接种量与接种次数的限制。而且最好选择年龄 38 岁(或 310 周岁的阉牛)经检疫强健的马、牛进展，且能经采

8、血后连续高免循环利用。依据报道的争论文献，结合对抗血清制备争论的阅历，在选择动物时要留意以下几个方面：抗原与动物种系的关系：动物性抗原的免疫原性，随动物种系远近而有差异。近缘动物的蛋白质免疫原性弱，反之则强。因此选择动物时应选用亲缘关系较远的动物。抗血清的用量：依据所需要免疫血清的量，来选择免疫动物。如是常常大量使用，选择免疫动物时则应选择大动物;假设所需的免疫血清量不大，则以选择小动物为宜。动物的个体状态：用于免疫的动物必需是适龄、强健、无感染的动物。免疫过程中应特别留意养分和卫生治理。注射抗原1 个月后，动物仍无良好的抗体反响，或在规定注射日程后抗体效价不高，可再注射 l2 次，假设仍不佳

9、者马上淘汰。3.2.2 免疫原制备事实说明，选择具有良好的反响原性和免疫原性的抗原，是作为制备优质抗血清的根底;而制备优良抗原的关健是选择优良的菌(毒)株，所以应选择形态、培育、生化特性、血清学与抗原性、毒力等具有典型性的菌(毒)株作为抗原制造用毒株。张振兴等13在其文章中指出，抗原制备方法随免疫途径、程序、毒株的特性而异。而依据病原性区分，可分为两类，一类是病毒性抗血清，一般是用本动物的含毒组织(发病鸡胚或病变细胞)作抗原，首先把强毒接种本动物(鸡胚或细胞)，使其发病(或病变)，实行其含毒性组织(发病鸡胚或病变细胞)作为抗原，注射于免疫动物。另一类是细菌性血清，是用抗原性好的强毒或弱毒菌种，

10、接种于规定培育基内，于 37培育，细菌发育良好者，经纯粹检验后用作抗原。3.2.3 免疫接种据报道1418，由于病原体的特点、免疫机理等不同，其制备抗血清的免 疫方案也不尽一样，即使是同一疫病，也有不同的免疫方案;而且用不同的免疫方案制备的抗血清，其效价亦有差异。因此，为了获得高效价的免疫抗体，动物的免疫程序一般分为根底免疫与高度免疫。根底免疫一般是注射疫苗，然后再以递增量强毒抗原进展高免;或者用佐剂抗原进展连续免疫。每次注射剂量，要随着注射次数的增加而增加。接种抗原的次数和剂量，应依据制造抗血清的品种和动物安康状况加以调整。为了获得效价高的抗血清，动物饲养条件必需保持良好。免疫剂量、次数、间

11、隔，在各种抗血清制造中差异极大，如抗猪丹毒血清全程要注射抗原 20 次，历时 60100 d;抗猪瘟血清要注射 6 次以上，全程约 50 d，且以获得高抗体效价为佳。3.2.4 血清抗体的检测免疫程序接近完毕时，测定血清的抗体效价，假设效价已达规定的要求，即可视作免疫成功，开头采血。假设经试血，血清效价不合格，则可连续增加注射抗原次数或剂量，如再试血仍不合格，应将动物淘汰。测定免疫血清效价是准时把握采血时机的重要步骤。在“兽药典”中规定了各种血清抗体的检测方法。目前，关于抗体效价不同检测方法的报道也很多，有血凝试验和血凝抑制试验19，20、间接 ELISA 试验21，22、斑点 ELISA 试

12、验23、琼脂集中试验24，25等。假设用琼脂集中试验测定血清效价时，假设在抗原孔与抗体孔之间消灭沉淀线者，即为阳性。最高稀释倍数血清孔消灭沉淀线，即为该血清的抗体效价。琼脂集中试验的效价通常比环状沉淀反响稍低。3.2.5 血清采集与提取阅历得出，通常在末次免疫后 710 d 采血样检测抗体效价，抗体滴度到达要求后再按体重采血(10 mL/kg)。不管免疫动物是大动物或小动物，采血方法均分一次放血和屡次放血法两种：一次放血：绵羊或其他大动物可用颈动脉放血，家兔、豚鼠和鸡等小动物则可通过心脏直接采血;屡次少量放血法：大动物可通过静脉采血，小动物可通过心脏采血，在第 1 次采血后 35 d 可进展第

13、 2 次采血，经 35 d 后进展第 2 个免疫程序。留意，动物采血应在上午空腹时进展， 提前禁食 1d，可避开血中消灭乳糜而获得澄清的血清。血清提取常承受自然凝固加压法和枸橼酸盐血浆分别血清法。在操作过程 中，应当留意的是，血清的分别应在无菌条件下进展，并应尽量防止溶血。采血用的器械、容器等用前要进展灭菌，以无菌操作采血，分别的血清加防腐剂经检验合格后分装，保存。3.3 抗血清的检验依据中华人民共和国兽用生物制品质量标准(以下简称“质量标准”)的要 求，每一种生物制品都需要进展检验26。抗血清的检验包括物理性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、安全检验、效力检验和苯酚或汞类防腐剂残留

14、量测定。物理性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验均按“质量 标准”中成品检验的有关规定进展。其中，外源病毒检验时检查的病毒有：禽 类：鸡传染性支气管炎病毒、鸡城疫病毒、禽腺病毒、禽 A 型流感病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、鸡马立克氏病病毒、禽淋巴白血病病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡痘病毒;家畜：牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、 蓝舌病病毒、马传染性贫血病毒、狂犬病病毒。安全检验通常用体重 1822g的安康小白鼠 5 只，各皮下注射血清 0.5ml，用体重 250450g 的安康豚鼠 2 只，各皮下注射血

15、清10ml，观看10 天，均应健活。效力检验则按不同病原的抗血清规定方法和剂量进展。苯酚或汞类防腐剂残留量测定应符合兽用生物制品通则的规定。4 抗血清中病原体的处理对于制备的抗血清，假设没有对外源病原体的检测和相应的处理，则其应当是一种不合格的产品。因此，处理抗血清中的病原体(主要是病毒)成为抗血清 安全性的首要问题，也是提高抗血清产品质量的一个关键环节。一般状况下，处理病毒需进展以下三个方面的程序：病毒排解、病毒去除和病毒灭活。排解病毒的最主要的工作是对材料的筛选，它至少防止了抗血清分别混合物中过高的病毒负荷27。而去除病毒则是确保抗血清成品安全的一个重要程序。其去除过程主要依据的是传统物理

16、法，如膜过滤法等。膜过滤法去除病毒的原理是利用病毒颗粒体积大于膜平均孔径而使病毒载留在滤膜上。通过这一步，可使抗血清制品得到进一步纯化28。最具有技术难度的是病毒灭活技术。由于所选的灭活方法必需满足以下条件：灭活技术本身或其致活因子与血液成分反响的产物应无急、慢性毒性作用;不使血清成分发生变性，不产生的免疫原，或不使长期使用者发生免疫反响性疾病;灭活后的终产品照旧具有正常理化活性和免疫学性质;灭活方法要简便、可行，无需大量人力、设备和空间29。目前，已经开发利用的方法很多， 但只有其中一些比较适合抗血清制品的病毒灭活，如亚甲蓝/光化学(MB)法30、-射线辐照法31，32、以核酸为靶点的光化学

17、技术33，34以及流体力学高压法35等。5 抗血清的应用几乎全部动物传染病的病原微生物(特别是细菌和病毒)及其代谢产物都可 制造相应的抗血清，用于疾病的紧急预防与治疗，局部高免血清可以用于疾病诊断和病原鉴定，这在我国目前的国情下仍具有重要的经济意义。特别是针对于宠物、珍稀动物以及易患突发性疾病的动物具有格外重要的应用价值。首先，在疾病的紧急预防与治疗方面的作用就格外突出。目前，市场上的疫苗和治疗药物都有各自的缺点，如疫苗的免疫力保护力不高，治疗药物易产生耐药性等等。与疫苗和治疗药物相比，抗血清具有其无可比较的优点。当动物接种相应抗血清后，机体快速得到大量非自身免疫抗体，从而快速中和了侵入机体的

18、病原，或者抵抗了致病病原的攻击，如抗猪瘟血清有效的把握了猪瘟的疫情，抗犬瘟热血清对犬瘟热有独特的疗效。当前，被批准的产品还有：抗气肿疽血清、抗炭疽血清、抗绵羊痢疾血清、抗猪羊多杀性巴氏杆菌病血清、破伤风抗毒素、抗猪丹毒血清等2。在疾病诊断和病原鉴定方面，主要表达在作为阳性血清上。进展到现在，尽管有的疾病诊断和病原鉴定方法不断消灭，但是血清学诊断方法仍占主要地 位。而在用血清学方法时，必需要用到阳性血清作为反响的诊断物。因此，具有高效价特性的抗血清成为首选。目前，已批准生产的有：炭疽沉降素血清、布鲁氏菌病试管凝集试验阳性血清、衣原体病间接血凝试验阳性血清、口蹄疫细胞中和试验性血清、蓝舌病琼脂集中

19、试验阳性血清、日本吸血虫病凝集试验阳性血清等 38 种2。6 抗血清争论及应用中的问题及解决方案首先是抗血清产品的安全性问题。要使一种抗血清成为合格产品面市，必需保证制备的抗血清安全，无外源病原。如何去除抗血清中的外源病原则是目前抗血清争论应用中面临的一个难题，这就需要各种病毒处理技术去解决。病毒处理技术已经在上面介绍过。但是，还需要进展更有效的处理技术。其次是抗血清抗体效价降低的问题。血清抗体效价在很多状况下都会降低， 如血清处理、保存血清的温度、期限等等。在处理血清过程中，如外源病原处理时，难免会影响血清抗体效价，因此，一种有效且不造成抗体效价转变的病原处理方法将是以后的争论的一个方向。再

20、就是抗血清本身具有的缺点，如用量大、本钱高、质量低等。鉴于此，提高抗体表达量，降低生产本钱以及提高产品质量等问题将成为以后解决的重点。7 总结与展望综上所述，动物抗血清制备的常规技术已经比较成熟，但目前市场上的产品却很少，主要是由于安全性问题、抗体效价变化以及抗血清的缺点造成的。因此， 以后的争论重点也将集中在这些方面。经争论和临床应用说明，抗血清在特别的状况下具有很重要的治疗价值，如治疗宠物、珍稀动物等的疾病，以及用于重大疫病的突发性大事的应对和预防，可见，抗血清产品还是具有很大的市场潜力。随着生产抗体的方法的不断消灭、抗体生产工艺的日趋成熟，抗血清的争论和应用将迈入的阶段。因此，可以信任在不久的将来，抗血清处理技术将会更加完善，动物性免疫球蛋白将应用于临床，技术抗体争论将成为热点，如基因工程抗体、小分子模拟抗体等。