生物技术综合实验

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1、生 物 技 术 综 合 实 验Comprehensive experiments of biotechnology 主 要 内 容 Contents：一 、 课 程 简 介 核 酸 的 分 离 与 纯 化 Isolation and Purification of Nucleic Acid二 、 电 泳 技 术 Agarose Gel Electrophoresis and SDS-PAGE 三 、 聚 合 酶 链 式 反 应 技 术 Polymerase Chain Reaction四 、 DNA序 列 测 定 DNA Sequencing五 、 分 子 杂 交 技 术 Molecular

2、Hybridization Southern, Northern and Western Blot六 、 基 因 文 库 和 cDNA文 库 的 构 建 Construction of cDNA Library and DNA Library 七 、 外 源 基 因 的 克 隆 与 表 达 Heterogenic Gene Cloning and Expression八 、 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 技 术 Isolation and Purification of Protein 现 代 生 物 技 术 综 合 性 实 验 是 以 分 子 生 物 学 为 基 础 的 基 因 克 隆

3、重 组 技 术 和 生 物 化 学 的 蛋 白 质 分 离 、 纯 化 技 术 为 核 心 的 教学 ， 它 是 现 代 生 物 技 术 的 核 心 。 主 要 内 容 ： 包 括 实 验 理 论 和 实 验 技 术 实 验 技 术 生 物 技 术 综 合 实 验 ， 它 是 集 目 的 基 因 的 制 备 、 克隆 、 表 达 和 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 及 其 活 性 测 定 等 实 验 方 法 和 技术 为 一 体 的 一 门 综 合 性 实 验 课 。 目 的 ： 通 过 本 门 课 程 的 学 习 ， 使 学 生 掌 握 现 代 生 物 工 程 的上 、 下 游 实 验 技

4、术 ， 对 以 基 因 克 隆 重 组 技 术 为 主 线 的 生 物 实验 技 术 有 一 个 较 全 面 的 了 解 。 核 酸 的 分 离 与 纯 化Isolation and purification of nucleic acids 不 论 是 基 因 工 程 还 是 蛋 白 质 工 程 ， 核 酸 分子 是 这 些 技 术 应 用 所 涉 及 的 主 要 对 象 ， 所 以 核酸 的 分 离 与 提 取 是 生 化 与 分 子 生 物 学 研 究 中 非常 重 要 的 基 本 技 术 。 核 酸 样 品 的 质 量 将 直 接 关系 到 实 验 的 成 败 。 核 酸 的 种 类

5、： 真 核 生 物 的 染 色 体 DNA为 双 链 线 性 分 子 ； 真 核 细 胞器 DNA为 双 链 环 状 分 子 ； 原 核 生 物 的 基 因 组 DNA、 质 粒 DNA为 双 链 环 状 分 子 ； RNA分 子 在 大 多 数 生 物 体 内 均 是 单 链 线 性 分 子 ； 不同 类 型 的 RNA分 子 可 具 有 不 同 的 结 构 特 点 ， 如 真 核mRNA分 子 多 数 在 3 端 带 有 ploy(A)结 构 ;tRNA 的三 叶 草 结 构 。 病 毒 的 DNA、 RNA， 其 存 在 形 式 多 种 多 样 ， 有 双 链 环状 、 单 链 环 状

6、、 双 链 线 状 和 单 链 线 状 等 。 一 、 核 酸 分 离 提 取 的 原 则 1.分 离 纯 化 核 酸 总 的 原 则 应 保 证 核 酸 一 级 结 构 的 完 整 性 ； 排 除 其 它 分 子 的 污 染 ， 保 证 较 高 纯 度 。 2.核 酸 的 分 离 、 纯 化 应 达 到 以 下 三 点 要 求 ： 排 除 其 它 核 酸 分 子 的 污 染 ， 如 提 取 DNA分 子时 ， 应 去 除 RNA分 子 ， 反 之 亦 然 ； 其 它 生 物 大 分 子 如 蛋 白 质 、 多 糖 和 脂 类 分子 的 污 染 应 降 低 到 最 低 程 度 ； 核 酸 样

7、品 中 不 应 存 在 对 酶 有 抑 制 作 用 的 有机 溶 剂 和 过 高 浓 度 的 金 属 离 子 。 3.为 了 保 征 分 离 核 酸 的 完 整 性 和 纯 度 ， 在 实 验过 程 中 ， 应 注 意 以 下 事 宜 ： 尽 量 简 化 操 作 步 骤 ， 缩 短 提 取 过 程 ， 以 减 少各 种 有 害 因 素 对 核 酸 的 破 坏 ； 减 少 化 学 因 素 对 核 酸 的 降 解 ， 为 避 免 过 酸 、过 碱 对 核 酸 链 中 磷 酸 二 酯 键 的 破 坏 ， 操 作 多 在pH4-10条 件 下 进 行 ； 减 少 物 理 因 素 对 核 酸 的 破 坏

8、 ， 物 理 破 坏 因 素主 要 是 机 械 剪 切 力 ， 其 次 是 高 温 。 防 止 核 酸 的 生 物 降 解 ， 细 胞 内 或 外 界 的 各 种核 酸 酶 （ DNA酶 、 RNA酶 ） 酶 解 核 酸 链 中 的 磷酸 二 酯 键 ， 直 接 破 坏 核 酸 的 一 级 结 构 。 其 中 DNA酶 ， 需 要 金 属 二 价 离 子 Mg2+， Ca2+的激 活 ， 使 用 金 属 二 价 离 子 螯 合 剂 乙 二 胺 四 乙 酸(EDTA)、 柠 檬 酸 盐 ， 基 本 上 可 以 抑 制 DNA酶 的 活性 。 而 RNA酶 ， 不 但 分 布 广 泛 、 极 易

9、污 染 样 品 ，而 且 耐 高 温 、 耐 酸 、 耐 碱 ， 不 易 失 活 ， 所 以 生物 降 解 是 RNA提 取 过 程 中 的 主 要 危 害 因 素 。 二 、 真 核 细 胞 染 色 体 DNA的 制 备 真 核 细 胞 染 色 体 DNA的 制 备 过 程 1. 真 核 细 胞 的 破 碎 （ 1） 物 理 方 式 :超 声 波 法 、 匀 浆 法 、 液 氮破 碎 法 、 Al2O3粉 研 磨 法 等 。 这 些 物 理 操 作 均 可导 致 DNA链 的 断 裂 。 （ 2） 为 了 获 得 大 分 子 量 的 DNA， 一 般 采 用蛋 白 酶 K和 去 污 剂 温

10、和 处 理 法 。 2. 去 除 蛋 白 质 常 用 酚 、 氯 仿 抽 提 。 反 复 的 抽 提 操 作 对 DNA链 的 机 械 剪 切 机 会 较 多 ， 所 以 有 人 使 用 高 浓 度甲 酰 胺 解 聚 核 蛋 白 联 合 透 析 的 方 法 ， 可 以 获 得200kb以 上 的 DNA片 段 ， 适 用 于 粘 粒 (cosmid)构建 基 因 组 文 库 。 根 据 不 同 的 实 验 要 求 ， 可 选 择 不 同 的 实 验方 法 制 备 真 核 细 胞 染 色 体 DNA。 3.DNA沉 淀 ： 一 般 采 用 2倍 体 积 乙 醇 沉 淀 或 用 异 丙 醇 （ 0

11、.6）4.DNA溶 解 ： 一 般 采 用 TE方 法 一 ： 酚 抽 提 法 （ 见 实 验 指 导 p20） 三 、 RNA的 分 离 与 纯 化 -真 核 细 胞 RNA的 制 备 从 细 胞 中 分 离 RNA的 纯 度 与 完 整 性 对 于 许 多分 子 生 物 学 实 验 至 关 重 要 。 如 Northern blot及cDNA合 成 及 体 外 翻 译 等 实 验 的 成 败 ， 在 很 大 程 度上 决 定 于 RNA的 质 量 。 RNA主 要 由 以 下 几 类 分 子 组 成 ： rRNA(占 RNA总 量 的 80 85 )、 tRNA和 核 内 小 分 子RNA

12、(占 10 -15 )、 mRNA(占 1 5 )。 rRNA在 总 RNA分 子 中 含 量 最 丰 富 ， 由 28S、18S、 5S及 4S几 类 组 成 ， 它 们 之 间 同 源 性 大 ，分 子 量 变 化 不 大 ， 所 以 可 根 据 它 们 的 密 度 和 分子 大 小 ， 通 过 密 度 梯 度 离 心 ， 凝 胶 电 泳 或 离 子交 换 层 析 进 行 分 离 。 mRNA分 子 种 类 繁 多 ， 分 子 量 大 小 不 均 一 ， 在细 胞 中 含 量 少 ， 绝 大 多 数 mRNA分 子 (除 血 红 蛋 白及 有 些 组 蛋 白 mRNA以 外 )， 均 在

13、3 端 存 在 20-250个 多 聚 腺 核 苷 酸 poly(A)。 利 用 此 特 征 ， 可很 方 便 地 从 总 RNA中 ， 用 寡 聚 (dT)亲 和 层 析 柱 分离 mRNA。 mRNA分 子 群 体 编 码 细 胞 内 所 有 的 多 肽 和 蛋 白质 ， 而 mRNA是 分 子 生 物 学 的 主 要 研 究 对 象 之 一 。 鉴 定 所 提 取 总 RNA分 子 的 质 量 ， 可 以通 过 琼 脂 糖 电 泳 后 观 察 是 否 有 明 显 得28S、 18S条 带 来 判 断 。 Fig.1 Total RNA isolated from Trichoderma

14、reesei induced by different inducers图 1. 木 霉 总 RNA的 分 离1. 微 晶 纤 维 素 2. 天 然 稻 草 粉 如 何 创 造 一 个 无 RNase的 环 境 ？极 力 避 免 外 源 RNase的 污 染 ： 主 要 来 源 于操 作 者 的 手 、 实 验 的 器 皿 和 试 剂尽 力 抑 制 内 源 性 RNase的 活 力 ： 主 要 来 源于 样 品 中 的 组 织 细 胞 。 (1)操 作 者 的 手 直 接 触 摸 之 处 ， 毫 无 疑 问 会 留 下RNase， 说 话 带 出 的 唾 液 也 富 含 RNase。 故 整个

15、 操 作 过 程 中 ， 应 戴 口 罩 和 手 套 。(2)空 气 中 飞 尘 携 带 的 细 菌 、 霉 菌 等 微 生 物 ， 也是 污 染 外 源 RNase的 一 条 途 径 ， 所 以 操 作 过程 应 在 比 较 洁 净 的 环 境 中 进 行 。怎 样 去 除 外 源 性 RNase的 污 染 ？ (3)玻 璃 器 经 过 常 规 洗 净 后 ， 应 用 0.1 焦 碳 酸二 乙 酯 (diethyl pyrocarbonate， DEPC)浸 泡处 理 (37 ， 2小 时 )， 再 用 双 蒸 灭 菌 水 漂 洗 几次 。 高 压 消 毒 去 除 DEPC， 然 后 200

16、 烘 烤 4小时 以 上 或 180 烘 烤 过 夜 。(4)塑 料 器 材 最 好 使 用 灭 菌 的 一 次 性 塑 料 用 品 ，Eppendorf管 、 微 量 加 样 吸 头 最 好 是 新 的 ， 使用 前 进 行 高 压 蒸 汽 消 毒 。 (5)所 有 溶 液 应 加 DEPC至 0.1 ， 室 温 处 理 过 夜 ，或 室 温 下 磁 力 搅 拌 20分 钟 ， 然 后 高 压 蒸 汽 灭 菌处 理 （ 或 加 热 至 70 1小 时 或 60 过 夜 ， 以 去除 所 有 残 留 的 DEPC） 。(6)所 用 的 化 学 试 剂 应 为 新 包 装 ， 称 量 时 使 用

17、 干烤 处 理 的 称 量 勺 。 所 有 操 作 均 应 在 冰 浴 中 进 行 ，低 温 条 件 可 减 低 RNA酶 的 活 性 。 要 尽 可 能 早 地 去 除 细 胞 内 蛋 白 ， 加 入RNase抑 制 剂 ， 力 争 在 提 取 的 起 始 阶 段 对RNase活 力 进 行 有 效 地 抑 制 。 如 何 抑 制 内 源 性 RNase的 活 性 ？ RNase抑 制 物 ：（ 1） 低 特 异 性 RNase抑 制 物 ： 不 同 类 型 的 低 特 异 性 RNase抑 制 物 均 可 不 同程 度 地 抑 制 Raise的 活 性 ， 其 中 包 括DEPC 皂 土

18、(bentonite):Al2O34SiO2H2O复 合 硅 酸 盐 (Macaloid) 肝 素氧 钒 基 核 苷 复 合 物多 胺 （ 2） 去 除 蛋 白 质 的 物 质 ：蛋 白 质 变 性 剂 ： 酚 、 氯 仿 ； 尿 素蛋 白 酶 K去 污 剂 ： SDS、 十 二 烷 酰 肌 氨 酸 钠 (sarkosyl)、脱 氧 胆 酸 钠 (DOC)是 阴 离 子 去 污 剂解 偶 剂 (胍 类 )： 盐 酸 胍 、 异 硫 氰 酸 胍 是 一 类强 力 的 蛋 白 质 变 性 剂 ， 可 溶 解 蛋 白 质 ， 并 使 蛋白 质 二 级 结 构 消 失 ， 细 胞 结 构 降 解 ，

19、核 蛋 白 迅速 与 核 酸 分 离 ， 所 以 又 称 解 偶 剂 。 （ 3） RNase的 特 异 抑 制 剂 RNase阻 抑 蛋 白 (RNasin)： 这 是 一 类 从 大 鼠 肝 或 人 胎 盘 中 提 取 出 来 的酸 性 糖 蛋 白 质 。 RNasin能 与 RNase非 共 价 结 合从 而 抑 制 它 们 的 活 力 ， RNasin是 RNA酶 的 一 种非 竞 争 性 抑 制 剂 。 抑 制 效 果 较 好 ， 被 广 泛 用 于体 外 翻 译 体 系 、 mRNA反 转 录 合 成 cDNA及 体 外 转录 实 验 。 RNA的 提 取 方 法 （ 见 有 关

20、实 验 指 南 ） n 13) Precipitate pure RNA by the addition of 20ul 3M sodium acetate, 100mM acetate, pH 5.2 and 500ul absolute ethanol. Incubate at -20C for 20 minutes. n 14) Pellet RNA by centrifugation at maximum speed in a microfuge for 10 minutes. n 15) Wash the RNA once in 70% ethanol and vacuum dry.

21、 n 16) Dissolve RNA in appropriate buffer i.e. DEPC-treated, sterile TE, pH 8 or 0.5% SDS if no enzymic manipulation of the RNA is needed. SDS is an inhibitor of ribonucleases. n RNA quality can be assessed by electrophoresis under denaturing conditions using agarose/formaldehyde gels and the MOPS b

22、uffer system. step while precipitating the genomic DNA and SDS in an insoluble white, rubbery precipitate. Spin at top speed 1 min. n 6. Transfer supernatant to new tube, being careful not to pick up any white flakes. Precipitate the nucleic acids with 0.5mL of isopropanol on ice for 10 minutes and

23、centrifuge at top speed for 1 minute.n 7. Aspirate off all the isopropanol supernatant. Dissolve the pellet in 0.4 ml of TE buffer (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.5). Add 10ul of RNAse A solution (20 mg/ml stock stored at -20 C), vortex and incubate at 37 C for 20 to 30 minutes to digest remaining R

24、NA. n 8. Extract proteins from the plasmid DNA using PCIA (phenol/chloroform/isoamyl alcohol) by adding about 0.3 ml. Vortex vigorously for 30 seconds. Centrifuge at full speed for 5 minutes at room temperature. Note organic PCIA layer will be at the bottom of the tube. n 9. Remove upper aqueous lay

25、er containing the plasmid DNA carefully avoiding the white precipitated protein layer above the PCIA layer, transferring to a clean 1.5 ml epindorf tube. n 10. Add 100 ml of 7.5 M ammonium acetate solution and 1 ml of absolute ethanol to precipitate the plasmid DNA on ice for 10 minutes. Centrifuge

26、at full speed for 5 minutes at room temperature. n 11. Aspirate off ethanol solution and resuspend or dissolve DNA pellet in 50ul of DNA. Dissolve 5uL in 995ul of water, and spec (blank spectrophotometer to water). The absorbance at 260 nm multiplied by ten is the concentration of the DNA in units of mg/ml for a 1 cm pathlength cuvette (i.e. 50 mg/ml/OD 260nm). Fig.2. egl4 gene was amplified by RT-PCR图 2. RT-PCR扩 增 基 因1. 内 切 葡 萄 糖 苷 酶 基 因2. DNA 标 准 分 子 量