实验六微生物的生理生化反应

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1、实验六实验六微生物的生理生化反应微生物的生理生化反应实验内容实验内容大分子物质的水解试验大分子物质的水解试验n淀粉水解试验淀粉水解试验糖发酵试验糖发酵试验n葡萄糖发酵葡萄糖发酵n乳糖发酵乳糖发酵IMViCIMViC试验试验n吲哚试验吲哚试验n甲基红试验甲基红试验n伏伏-普试验普试验n柠檬酸盐试验柠檬酸盐试验一、大分子物质的水解试验一、大分子物质的水解试验目的要求目的要求n证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统；从而说明不同微生物有着不同的酶系统；n掌握进行生物大分子水解试验的原理和方法。掌握进行生物大分子水

2、解试验的原理和方法。基本原理基本原理n大分子物质淀粉、蛋白质和脂肪必须通过胞外酶水大分子物质淀粉、蛋白质和脂肪必须通过胞外酶水解成较小的化合物后，才能被微生物吸收利用。解成较小的化合物后，才能被微生物吸收利用。实验器材实验器材n菌种菌种枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，变形杆菌枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，变形杆菌n培养基培养基固体淀粉培养基固体淀粉培养基n溶液或试剂溶液或试剂卢戈氏碘液卢戈氏碘液n仪器或其他用具仪器或其他用具无菌平板，接种针无菌平板，接种针淀粉水解试验淀粉水解试验大肠大肠杆菌杆菌变形杆菌变形杆菌枯草芽孢枯草芽孢杆菌杆菌37 均均倒倒 匀匀置置 铺铺培培 满满养养 平平24h 板板滴滴入入少少

3、量量碘碘液液，菌苔周围出现无色透明圈：说明淀粉已被水解，阳性；菌苔周围出现无色透明圈：说明淀粉已被水解，阳性；透明圈大小表明胞外淀粉酶活力的高低。透明圈大小表明胞外淀粉酶活力的高低。实验结果实验结果n记录实验结果：记录实验结果：“+”表示阳性；表示阳性；“-”表示阴性。表示阴性。思考题思考题你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？二、糖发酵试验二、糖发酵试验目的要求目的要求n了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用；作用；n掌握通过糖发酵鉴别不

4、同微生物的方法。掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。基本原理基本原理n糖类是绝大多数细菌的碳源和能源，但是，不糖类是绝大多数细菌的碳源和能源，但是，不同种细菌对不同糖的分解性能和产物并不一致。同种细菌对不同糖的分解性能和产物并不一致。有些细菌能分解某种糖产酸和产气，有些细菌有些细菌能分解某种糖产酸和产气，有些细菌只产酸不产气，有些细菌则不能分解。只产酸不产气，有些细菌则不能分解。实验器材实验器材n菌种菌种大肠杆菌，普通变形杆菌大肠杆菌，普通变形杆菌n培养基培养基葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各管各3 3支（内装有倒置的德汉氏小管）支（内装有倒置的

5、德汉氏小管）n仪器或其他用具仪器或其他用具试管架，接种环试管架，接种环操作步骤操作步骤取葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各取葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支支分别接种普通变形杆菌、大肠杆菌分别接种普通变形杆菌、大肠杆菌第第3支不接种（对照支不接种（对照,老师提供）老师提供）6支试管支试管37培养培养24-48h观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡产生观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡产生产酸：溴甲酚紫指示剂由紫色（产酸：溴甲酚紫指示剂由紫色（pH6.8）黄色（黄色（pH5.2）糖发酵试验左侧阳性结果右侧阴性结果实验结果实验结果n记录实验结果：记录实验结果：“+”

6、表示产酸或产气；表示产酸或产气；“-”表示不产酸表示不产酸或不产气。或不产气。思考题思考题假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？什么结果？三、三、IMViC试验试验目的要求目的要求n了解了解IMViC反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。实验器材实验器材n菌种菌种大肠杆菌，产气肠杆菌大肠杆菌，产气肠杆菌n培养基培养基蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基基n溶液或试剂溶液或试剂甲基红指示剂，甲基红指示剂，4

7、0%KOH，5%-萘酚，乙醚，吲哚试剂等。萘酚，乙醚，吲哚试剂等。1、吲哚试验、吲哚试验基本原理基本原理n检测细菌代谢色氨酸产生吲哚的能力。检测细菌代谢色氨酸产生吲哚的能力。n有些细菌能产生有些细菌能产生色氨酸酶色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸；吲哚和对二甲基氨基苯甲醛结合，生吲哚和丙酮酸；吲哚和对二甲基氨基苯甲醛结合，形成形成红色的玫瑰吲哚红色的玫瑰吲哚。操作步骤操作步骤分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于蛋白胨水培养基分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于蛋白胨水培养基37培养培养2d加加0.5mL醚，充分摇动，静置醚，充分摇动，静置1-3min；乙醚上升后，沿管壁

8、徐徐加入乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚试剂滴吲哚试剂若在乙醚和培养物之间产生红色环状物若在乙醚和培养物之间产生红色环状物阳性反应阳性反应2、甲基红（、甲基红（M.R）试验）试验基本原理基本原理n检测细菌是否能检测细菌是否能分解葡萄糖产酸分解葡萄糖产酸，如甲酸、乙酸、乳，如甲酸、乙酸、乳酸等。酸等。n当细菌代谢糖产生酸时，培养基中的甲基红指示剂由当细菌代谢糖产生酸时，培养基中的甲基红指示剂由橘黄色（橘黄色（pH6.3）变为红色（）变为红色（pH4.2）。）。操作步骤操作步骤分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于葡萄糖蛋白胨水培养基分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于葡萄糖蛋白胨水培养基37培养培养2d加入

9、甲基红指示剂加入甲基红指示剂2滴滴培养基变为红色培养基变为红色阳性；培养基变为黄色阳性；培养基变为黄色阴性阴性3、伏、伏-普（普（V.P）试验）试验基本原理基本原理n测定细菌发酵葡萄糖产生测定细菌发酵葡萄糖产生非酸性或中性末端产物非酸性或中性末端产物的能的能力，如丙酮酸。力，如丙酮酸。n某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合、脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇；乙酰甲丙酮酸缩合、脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇；乙酰甲基甲醇在碱性条件下被氧化为二乙酰；二乙酰与蛋白基甲醇在碱性条件下被氧化为二乙酰；二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成胨中精氨酸

10、的胍基作用，生成红色化合物红色化合物，即为，即为VP试验阳性。试验阳性。操作步骤操作步骤分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于葡萄糖蛋白胨水培养基分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于葡萄糖蛋白胨水培养基37培养培养2d加入加入5-10滴滴40%KOH，再加入等量的，再加入等量的5%-萘酚，用力振荡萘酚，用力振荡置于置于37温箱中保温温箱中保温15-30min若培养物呈红色若培养物呈红色伏伏-普反应阳性普反应阳性4、柠檬酸盐试验、柠檬酸盐试验基本原理基本原理n检测细菌利用柠檬酸盐的能力。检测细菌利用柠檬酸盐的能力。n有些细菌可利用柠檬酸钠作为碳源，如产气肠杆菌；有些细菌可利用柠檬酸钠作为碳源，如产气肠杆菌；而

11、有些细菌则不能利用柠檬酸盐，如大肠杆菌。细菌而有些细菌则不能利用柠檬酸盐，如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基的合物，使培养基的pH升高，当加入升高，当加入1%溴麝香草酚蓝溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基指示剂时，培养基由绿色变为深蓝色由绿色变为深蓝色。操作步骤操作步骤分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于柠檬酸盐斜面培养基分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于柠檬酸盐斜面培养基37培养培养2d观察斜面培养基上有无细菌生长和变色观察斜面培养基上有无细菌生长和变色培养基变为蓝色培养基变为蓝色阳性；培养基变为绿色阳性；培养基变为绿色

12、阴性阴性实验结果实验结果n记录实验结果：记录实验结果：“+”表示阳性反应；表示阳性反应；“-”表示阴性反应。表示阴性反应。思考题思考题讨论讨论IMViCIMViC试验在医学检验上的意义。试验在医学检验上的意义。解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？指示剂，而不用丙酮酸？为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏菌为阴性？这个试验与伏-普试验最初底物与最终普试验最初底物与最终产物有何异同处？为什么会出现不同？产物有何异同处？为什么会出现不同？