基因和体外重组和转化课件

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1、外源外源DNA载体载体DNA重组分子重组分子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞扩增或表达扩增或表达表达表达连接连接转化或转导转化或转导电穿孔或显微注射电穿孔或显微注射受体细胞受体细胞1 DNA片段的体外连接片段的体外连接2 重组体导入细菌细胞重组体导入细菌细胞3 重组噬菌体重组噬菌体DNA的体外包装与转导的体外包装与转导4 重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染n n重组过程中，需要考虑的因素：重组过程中，需要考虑的因素：（1 1）连接效率高、易于筛选；）连接效率高、易于筛选；（2 2）便于回收外源基因；）便于回收外源基因；（3 3）在载体的启动子控制之下，并置于正

2、确）在载体的启动子控制之下，并置于正确的阅读框之中，以便表达。的阅读框之中，以便表达。n n基因的重组基因的重组是依赖于限制性内切酶、是依赖于限制性内切酶、DNADNA连连接酶和修饰酶的作用，分别对外源基因和载接酶和修饰酶的作用，分别对外源基因和载体进行适当切割和修饰后，将外源基因和载体进行适当切割和修饰后，将外源基因和载体巧妙地连接在一起。体巧妙地连接在一起。1 DNA片段的体外连接片段的体外连接一、粘性末端的连接一、粘性末端的连接二、平末端二、平末端的连接的连接三、三、PCR产物的连接产物的连接四、四、体外连接应注意的事项体外连接应注意的事项五、体外连接的结果五、体外连接的结果体体外外连连

3、接接DNA连接酶连接酶：由大肠杆菌基因组由大肠杆菌基因组DNA编码，以编码，以NAD+作为能源辅助因子。作为能源辅助因子。；只能连接粘性末端T4 DNA连接酶：连接酶：由大肠杆菌由大肠杆菌T4噬菌体噬菌体DNA编编码，以码，以ATP作为能源辅助因子。作为能源辅助因子。1970年：容易制备，而且可以连接平末端年：容易制备，而且可以连接平末端DNA分分子及单链子及单链DNA(RNA)分子，所以在基因克隆中应分子，所以在基因克隆中应用广泛。用广泛。连接酶连接酶一、粘性末端的连接一、粘性末端的连接利用粘性末端利用粘性末端单链间的碱基互的碱基互补，并用，并用DNA连接酶把相互靠近的连接酶把相互靠近的5端

4、磷酸端磷酸与与3-OH连到连到一起。一起。1.两段两段DNA的连接的连接依靠粘性末端依靠粘性末端2.DNA片断与载体的连接片断与载体的连接依靠粘性末端依靠粘性末端3.载体体与载体的连接与载体的连接二、平末端（二、平末端（blunt end）的连接）的连接5端与端与3端并列靠近的时间太短，不容易端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。被连接酶连接。1.直接连接直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的效率很低，只有粘性末端的1%。5 5 5 5 3 3 3 3-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3-OH-PP-HO-5 3 1972年

5、，斯坦福大学的年，斯坦福大学的P.Labban和和P.Kaiser提出。提出。（1）同聚物加尾法）同聚物加尾法 2.人工加尾形成人工加尾形成“粘性末端粘性末端”末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶能在没有模板的情能在没有模板的情况下给况下给DNA的的3-OH端端加上脱氧核苷酸。加上脱氧核苷酸。原理：原理：分别给载体和插入片断加上分别给载体和插入片断加上互补的互补的核苷酸。核苷酸。加尾加尾碱基互补碱基互补缺点缺点：优点优点：能把任何能把任何片段连接片段连接起来起来不能把不能把插入片插入片段再切段再切下来。下来。非酶切位点非酶切位点用用T4 DNA连接酶连到平端连接酶连到平端DNA上，然上，然

6、后再用酶切，形成一个人工粘性末端。后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物）衔接物(linker)连接连接 linker用化学合成法合成的一段用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限的特定限制性内切酶识别位点序列的制性内切酶识别位点序列的平端双链平端双链。GGAATTCC CCTTAAGGEcoRI linker：linker的作用的作用 缺点：缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段切下完整的插入片段2）能给载体连接上）能给载体连接上Polylinker:优点：优点

7、：（3）DNA接头接头(adapter)连接法连接法1978年康内尔大学的年康内尔大学的吴瑞吴瑞教授发明。教授发明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5 BamHI adapter用用T4DNA连接酶连到连接酶连到DNA分子的两分子的两端，直接成为人工粘性末端。端，直接成为人工粘性末端。adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。切位点序列）。adapter的作用的作用Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG-GGC

8、CCTAG-P5 5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5 接头自我连接接头自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与影响与DNA片段的连接。片段的连接。优点：优点：连上后就能用。连上后就能用。缺点：缺点：先用小牛肠先用小牛肠碱性磷酸酶碱性磷酸酶（CIP）处理接头，）处理接头，水解掉其水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。端的磷酸，防止自我连接。（以后再用（以后再用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶加上磷酸。）加上磷酸。）防止自我连接防止自我连接碱性磷酸酶处理质粒载体碱性

9、磷酸酶处理质粒载体n n为了提高连接效率，一般采取提高为了提高连接效率，一般采取提高的浓度，增加重组子比例。这样就会出现的浓度，增加重组子比例。这样就会出现自生连接问题，自生连接问题，为此通常选择为此通常选择对质对质粒载体用碱性磷酸酶粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其处理，除去其末末端的磷酸基，防止环化，端的磷酸基，防止环化，通过接反应后形通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。成的缺口可在转化细胞后得以修复。载体自连及去磷酸化示意图载体自连及去磷酸化示意图常用碱性磷酸酶常用碱性磷酸酶BAPBAP（大肠杆菌）大肠杆菌）大肠杆菌）大肠杆菌）CIP(CIP(小牛肠小牛肠小牛肠小牛肠)分子量分子量

10、分子量分子量 80,00080,000温度温度温度温度 60 60 65 65最适最适最适最适PH8.0PH8.0热稳定性好，热稳定性好，热稳定性好，热稳定性好，100 100 暂时性失活，暂时性失活，暂时性失活，暂时性失活，室温放置可恢复活性，苯酚完全失室温放置可恢复活性，苯酚完全失室温放置可恢复活性，苯酚完全失室温放置可恢复活性，苯酚完全失活活活活分子量分子量分子量分子量 100,000100,000温度温度温度温度 37 37 最适最适最适最适PH10.0PH10.0附近（高底物浓度）附近（高底物浓度）附近（高底物浓度）附近（高底物浓度）PH 8.0PH 8.0附近（低底物浓度）附近（低

11、底物浓度）附近（低底物浓度）附近（低底物浓度）65653030分钟处理分钟处理分钟处理分钟处理9999的活性不可的活性不可的活性不可的活性不可逆失活，随具体条件改变有变动，逆失活，随具体条件改变有变动，逆失活，随具体条件改变有变动，逆失活，随具体条件改变有变动，完全失活苯酚处理完全失活苯酚处理完全失活苯酚处理完全失活苯酚处理5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5 接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5GATCCCGG-OH HO-GG

12、CC5 5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5 CIP处理处理-OHHO-Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P 5GATCCCGG-HO-GGCC CCGG-OH-GGCCCTAG5 5HO-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5 缺口缺口缺口缺口HO-OHCIP处理处理T4 ligase虽然有缺口，但仍然能与虽然有缺口，但仍然能与DNADNA片断连接。片断连接。连接体系连接体系载体载体载体载体DNA 50 DNA 50 ngng 0.5ul 0.5ul目的目的目的目的DNA 19 DNA 19 ngng?

13、ulul双蒸水双蒸水双蒸水双蒸水?ulul 5ul5ul连接反应液（连接反应液（连接反应液（连接反应液（22）5ul5ul总体积总体积总体积总体积 10ul10ul用加样器柔和吹打混匀用加样器柔和吹打混匀用加样器柔和吹打混匀用加样器柔和吹打混匀,16,16连接连接连接连接2 2小时。小时。小时。小时。附注：载体和目的基因的摩尔比为附注：载体和目的基因的摩尔比为附注：载体和目的基因的摩尔比为附注：载体和目的基因的摩尔比为1:31:350ng:5.4kb=6.3ng:0.7kb50ng:5.4kb=6.3ng:0.7kb6.3ng*3=19ng6.3ng*3=19ng1.1.1.1.载体和插入片段

14、的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为变化范围可为变化范围可为变化范围可为8 8：1 1到到到到1 1：1616，但通常的变化范围是，但通常的变化范围是，但通常的变化范围是，但通常的变化范围是3 3：1 1到到到到1 1：3 3。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用10-50ng10-50ng的载体的载体的载体的载体

15、DNADNA。2.2.平末端连接在平末端连接在平末端连接在平末端连接在2222保温保温保温保温4-164-16小时，粘性末端在小时，粘性末端在小时，粘性末端在小时，粘性末端在2222保温保温保温保温3 3小小小小时，或时，或时，或时，或1616保温保温保温保温1616小时。大多数连接反应用小时。大多数连接反应用小时。大多数连接反应用小时。大多数连接反应用T4DNAT4DNA连接酶，连接酶，连接酶，连接酶，但大肠杆菌的但大肠杆菌的但大肠杆菌的但大肠杆菌的DNADNA连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接酶可用于粘性末端的连接，平

16、末端连接时用此酶，活力较低。连接时用此酶，活力较低。连接时用此酶，活力较低。连接时用此酶，活力较低。3.3.载体和插入片段的纯度应较高，溶解的溶剂最好使用灭菌载体和插入片段的纯度应较高，溶解的溶剂最好使用灭菌载体和插入片段的纯度应较高，溶解的溶剂最好使用灭菌载体和插入片段的纯度应较高，溶解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而不是的双蒸水而不是的双蒸水而不是的双蒸水而不是TETE，毕竟毕竟毕竟毕竟TETE中含有离子，可能影响连接中含有离子，可能影响连接中含有离子，可能影响连接中含有离子，可能影响连接反应。反应。反应。反应。连接反应中值得注意的几个问题连接反应中值得注意的几个问题三、三、PCR产物的连接产

17、物的连接1.在引物的在引物的5端设计酶切位点端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；符合载体的多克隆位点；（1）设计原则）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构）带酶切位点的引物的结构3端端1520bp与模板互补；与模板互补；5端端610bp是某个内切酶的识别序列。是某个内切酶的识别序列。（5端多余的端多余的35bp属属保护碱基保护碱基）避免与所扩增的避免与所扩增的DNADNA片断内部酶切位点重复。片断内部酶切位点重复。引物引物1GCAGAATTC 互补序列互补序列模板模板EcoRI位点位点5-3 GCAGAATTC 互补序列互补序列5-3 3 模板模板GCAGAATTC 互补序列互补序列 PCR产

18、物产物5-3 3 复性复性延伸延伸模板模板模板模板3 3 GCTAGCCGG 互补序列互补序列模板模板BamH I 位点位点-5 3-5 复性复性延伸延伸模板模板模板模板3 3 GCTAGCCGG 互补序列互补序列-5 3-模板模板5 GCTAGCCGG PCR产物产物 互补序列互补序列-5 3-引物引物2带酶切位点的带酶切位点的PCR产物产物GCAGAATTC PCR产物产物5-3 GCTAGCCGG PCR产物产物-5 3-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点位点BamHI位点位点AATTC PCR产物产物5-3 GCTAG PCR产物产物-5 3-GCEcoRI BamHI

19、两头各有一个粘性末端！两头各有一个粘性末端！2.与与T载体直接连接载体直接连接（1）PCR产物两个产物两个3端一般都有一个端一般都有一个ATaq DNA聚合酶的特性：在聚合酶的特性：在DNA双双链的链的3端再加上一个多余的核苷酸端再加上一个多余的核苷酸（优先加（优先加A）。）。（2）T载体的两个载体的两个3端人为地各加一个端人为地各加一个T利用利用Taq DNA聚合酶，当原料中只聚合酶，当原料中只有有dTTP时，被迫在平端载体上添加时，被迫在平端载体上添加T！AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶聚合酶载体载体PCR产物产物TATA四、四、DNA体外连接应注意的事项体外连接应注意的事项1

20、.插入片断与载体的酶切位点互补插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。尽量避免平端连接。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切）用相同的酶切（2）用同尾酶切）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生都产生GATC4个碱基的粘性末端。个碱基的粘性末端。2.DNA插入的方向正确插入的方向正确（1）用双酶切）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3.插入基因的开放阅读框（插入

21、基因的开放阅读框（ORF）正确）正确（1）DNA定向插入定向插入（2）起始密码）起始密码尤其当尤其当载体上有载体上有ATG起始密码的时候，起始密码的时候，更要注意。更要注意。ATGGAATTC载体载体ATGCGGAATTCT插入片断插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTC T重组重组但移码突变！但移码突变！4.防止载体自身环化连接防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的载体切口的5磷酸被除去，不能自我连磷酸被除去，不能自我连

22、接。但可以与插入片断以单链连接。接。但可以与插入片断以单链连接。5 3 载体载体插入片断插入片断五、载体和外源五、载体和外源DNA插入片段的连接结果插入片段的连接结果1.载体自身环化连接载体自身环化连接2.载体之间互相连接载体之间互相连接3.插入片段互相连接插入片段互相连接4.一个载体与几个插入片段重组一个载体与几个插入片段重组五、载体和外源五、载体和外源DNA插入片段的连接结果插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组几个载体与一个插入片段重组7（能存活）（能存活）（能存活）（能存活）（不能存活）（不能存活）（能存活）（能存活）（能存活）（能存活）19721972年，美国斯坦福大学的年

23、，美国斯坦福大学的年，美国斯坦福大学的年，美国斯坦福大学的伯格伯格伯格伯格（P.BergP.Berg）等人于把一种）等人于把一种）等人于把一种）等人于把一种猿猴猿猴猿猴猿猴病毒病毒病毒病毒的的的的DNADNA与与与与 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA用同一种限制性内切酶切用同一种限制性内切酶切用同一种限制性内切酶切用同一种限制性内切酶切割后，再用割后，再用割后，再用割后，再用DNADNA连接酶把这两种连接酶把这两种连接酶把这两种连接酶把这两种DNADNA分子连接起来，于分子连接起来，于分子连接起来，于分子连接起来，于是产生了一种新的重组是产生了一种新的重组是产生了一种新的重组是产生了一种新

24、的重组DNADNA分子。分子。分子。分子。19731973年，年，年，年，科恩科恩科恩科恩（S.CohenS.Cohen）等人把一段外源）等人把一段外源）等人把一段外源）等人把一段外源DNADNA片段与片段与片段与片段与质质质质粒粒粒粒DNADNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入转入转入转入大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。，第一次完整地建立起了基因克隆体系。，第一次完整地建立起了基因克隆体系。，第一次完整地建立起

25、了基因克隆体系。n n美国总统国家科学奖美国总统国家科学奖 中国科学院爱因斯坦讲席教授、美国国家科学院院士、美国斯坦福大学教授斯坦利中国科学院爱因斯坦讲席教授、美国国家科学院院士、美国斯坦福大学教授斯坦利科恩科恩(Stanley N.Cohen)n nStanley CohenStanley Cohen教授发明该专利时的笔记照片教授发明该专利时的笔记照片教授发明该专利时的笔记照片教授发明该专利时的笔记照片-重组重组重组重组DNADNA专利专利专利专利 从批准该专利到从批准该专利到该专利该专利1997年年12月月2日失效的日失效的17年年中，该专利一共中，该专利一共许可了许可了468家公司家公司

26、，两所大学共获得两所大学共获得了许可费收入约了许可费收入约2.55亿亿美元。美元。2 重组体导入细菌细胞重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备一、感受态大肠杆菌的制备二、重组二、重组DNA导导入大肠杆菌入大肠杆菌1.热休克法热休克法2.电转化法电转化法4.体外包装的噬菌体外包装的噬菌体的转导体的转导重重组组体体导导入入细细菌菌细细胞胞3.农杆菌介导法农杆菌介导法重组体的转化重组体的转化受体细胞受体细胞重组体的转化重组体的转化 由流动镶嵌模型发展而来的生物膜结构模型由流动镶嵌模型发展而来的生物膜结构模型由流动镶嵌模型发展而来的生物膜结构模型由流动镶嵌模型发展而来的生物膜结构模型 黑膜试验黑膜

27、试验不同分子通过无膜蛋白的人工脂双层不同分子通过无膜蛋白的人工脂双层1.目的目的增加受体菌增加受体菌细胞膜的通细胞膜的通透性。透性。一、感受态大肠杆菌的制备一、感受态大肠杆菌的制备 原核细胞的转化（细菌转化）1)1)受体细胞的选择受体细胞的选择限制缺陷型限制缺陷型限制缺陷型限制缺陷型:避免修饰和降解避免修饰和降解避免修饰和降解避免修饰和降解重组缺陷型：重组缺陷型：重组缺陷型：重组缺陷型：避免重组整合避免重组整合避免重组整合避免重组整合转化亲和型：转化亲和型：转化亲和型：转化亲和型：较高的可转化性较高的可转化性较高的可转化性较高的可转化性遗传互补型：遗传互补型：遗传互补型：遗传互补型：利于筛选利

28、于筛选利于筛选利于筛选感染缺陷型：感染缺陷型：感染缺陷型：感染缺陷型：防止感染防止感染防止感染防止感染实验中使用的受体细胞为大肠杆菌实验中使用的受体细胞为大肠杆菌DH5 alphaDH5 alpha菌株。菌株。使用丧失了使用丧失了限制体系限制体系的大肠杆菌。的大肠杆菌。如如K12系列的大肠杆菌。系列的大肠杆菌。2.菌种菌种用用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理制备原理CaCl2诱导转化特殊处理特殊处理受体细胞受体细胞细胞膜特性细胞膜特性改变改变CaCl2处理受体细菌受体细菌50-100mmol/LCaCl2 感受态感受态细菌细菌重组体重组体转

29、转入细菌入细菌4.制备过程制备过程培养大培养大肠杆菌肠杆菌OD600至至0.5On ice 5-10 min4离心离心3000g 10min收集收集菌菌用冰冷的用冰冷的50mMCaCl2重悬重悬4离心离心收集菌收集菌4离心离心收集菌收集菌分装、分装、-70 冻存冻存用冰冷的用冰冷的50mMCaCl2重悬重悬On ice 30 min用冰冷的用冰冷的50mMCaCl2重悬（重悬（15%甘油）甘油）3离心离心3重悬重悬2冰浴冰浴CaCl2法制备感受态细胞流程法制备感受态细胞流程将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，将宿主菌在琼脂培养基平板上

30、划线，37373737培养培养培养培养1616161620202020小时。小时。小时。小时。挑取单菌落转入挑取单菌落转入挑取单菌落转入挑取单菌落转入10ml 10ml 10ml 10ml LBLBLBLB培养基培养基培养基培养基（100ml-100ml-100ml-100ml-胰蛋白胨胰蛋白胨胰蛋白胨胰蛋白胨1g1g1g1g，酵母提取液，酵母提取液，酵母提取液，酵母提取液0.5g0.5g0.5g0.5g，NaClNaClNaClNaCl 1g 1g 1g 1g，dHdHdHdH2 2 2 2O O O O）中，）中，）中，）中，37 37 37 37 振荡培养过夜。振荡培养过夜。振荡培养过夜

31、。振荡培养过夜。从中吸取从中吸取从中吸取从中吸取1ml1ml1ml1ml转入转入转入转入50ml LB50ml LB50ml LB50ml LB培养基中培养基中培养基中培养基中37373737振荡培养，振荡培养，振荡培养，振荡培养，测测测测ODODODOD600600600600达达达达0.40.40.40.40.60.60.60.6。培养物在冰浴中放置培养物在冰浴中放置培养物在冰浴中放置培养物在冰浴中放置10101010分钟。分钟。分钟。分钟。取取取取1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml加入预冷的加入预冷的加入预冷的加入预冷的EppendorfEppendorfEppendorfEppe

32、ndorf管中，于管中，于管中，于管中，于5000rpm5000rpm5000rpm5000rpm下下下下室温室温室温室温离心离心离心离心2-52-52-52-5分钟。分钟。分钟。分钟。弃上清，加入弃上清，加入弃上清，加入弃上清，加入1ml1ml1ml1ml用冰预冷的用冰预冷的用冰预冷的用冰预冷的0.05M 0.05M 0.05M 0.05M CaClCaClCaClCaCl2 2 2 2 ，混匀，置冰上混匀，置冰上混匀，置冰上混匀，置冰上10101010分钟。分钟。分钟。分钟。5000rpm 45000rpm 45000rpm 45000rpm 4离心离心离心离心10101010分钟，弃上清

33、，加分钟，弃上清，加分钟，弃上清，加分钟，弃上清，加100ul 0.05M 100ul 0.05M 100ul 0.05M 100ul 0.05M CaClCaClCaClCaCl2 2 2 2重悬，置冰重悬，置冰重悬，置冰重悬，置冰浴备用或于浴备用或于浴备用或于浴备用或于4444短期保存。短期保存。短期保存。短期保存。若欲将制备的感受态细胞长期保存，将制备的细胞重悬于含有若欲将制备的感受态细胞长期保存，将制备的细胞重悬于含有若欲将制备的感受态细胞长期保存，将制备的细胞重悬于含有若欲将制备的感受态细胞长期保存，将制备的细胞重悬于含有15151515甘油的甘油的甘油的甘油的0.05M 0.05M

34、 0.05M 0.05M CaClCaClCaClCaCl2 2 2 2 中，放入中，放入中，放入中，放入-80-80-80-80冰箱或液氮中冻存。冰箱或液氮中冻存。冰箱或液氮中冻存。冰箱或液氮中冻存。转化转化-热激发热激发n n取制备好的感受态细胞，置于冰浴上；取制备好的感受态细胞，置于冰浴上；取制备好的感受态细胞，置于冰浴上；取制备好的感受态细胞，置于冰浴上；n n向感受态细胞中加入连接产物（不超过转化体系的向感受态细胞中加入连接产物（不超过转化体系的向感受态细胞中加入连接产物（不超过转化体系的向感受态细胞中加入连接产物（不超过转化体系的1/101/101/101/10体积），柔和混匀后冰

35、浴上放置体积），柔和混匀后冰浴上放置体积），柔和混匀后冰浴上放置体积），柔和混匀后冰浴上放置30min30min30min30min；n n将连接体系放入将连接体系放入将连接体系放入将连接体系放入42424242水浴中热激水浴中热激水浴中热激水浴中热激90sec90sec90sec90sec；迅速转入冰迅速转入冰迅速转入冰迅速转入冰浴浴浴浴2min2min2min2min；n n加入加入加入加入0.8ml LB0.8ml LB0.8ml LB0.8ml LB培养基，培养基，培养基，培养基，37373737振荡培养振荡培养振荡培养振荡培养45min45min45min45min；n n取适量培养

36、物涂布于取适量培养物涂布于取适量培养物涂布于取适量培养物涂布于Amp+LBAmp+LBAmp+LBAmp+LB固体培养基，放入固体培养基，放入固体培养基，放入固体培养基，放入37373737培养箱中培养。培养箱中培养。培养箱中培养。培养箱中培养。转化示意图转化示意图1.1.0 0的的的的CaClCaCl2 2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时低渗溶液中，使细胞膨胀，同时低渗溶液中，使细胞膨胀，同时低渗溶液中，使细胞膨胀，同时CaCa2+2+使细胞膜使细胞膜使细胞膜使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分磷脂层形成液晶结构，使得位于外

37、膜与内膜间隙中的部分磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；受态；受态；受态；2.2.加入加入加入加入DNADNA，CaCa2+2+又与又与又与又与DNADNA结合形成结合形成结合形成结合形成羟基羟基羟基羟基-磷酸钙磷酸钙磷酸钙磷酸钙复合物，复合物，复合物，复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；并粘附在细菌细胞膜的外表面上；并粘附在细菌细胞膜的外表面上；并粘附在细菌细胞膜的外表面上

38、；3.3.经短暂的经短暂的经短暂的经短暂的4242热脉冲处理后，细菌热脉冲处理后，细菌热脉冲处理后，细菌热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生细胞膜的液晶结构发生细胞膜的液晶结构发生细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动剧烈扰动剧烈扰动剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，随之出现许多间隙，致使通透性增加，随之出现许多间隙，致使通透性增加，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNADNA分分分分子便趁机进入细胞内。子便趁机进入细胞内。子便趁机进入细胞内。子便趁机进入细胞内。二、重组二、重组DNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌（1）转化（）转化（transformation)大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获质粒质粒

39、DNA的过程。的过程。（2）转染（）转染（transfection)大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获噬菌体噬菌体DNA的过程。的过程。1.外源外源DNA导入细菌的几种方法导入细菌的几种方法（3）转导（）转导（transduction)借助借助噬菌体噬菌体把外源把外源DNA导入细菌的过程。导入细菌的过程。每每 gDNA转化成功的细菌克隆数。转化成功的细菌克隆数。3.转化方法转化方法 2.转化率转化率简单简单，但转化效率不高，但转化效率不高（1）热休克法（）热休克法（heat shock）转化效率高转化效率高（2）电转化法）电转化法10ng载载体体DNA100 L感感受态菌受态菌 On ice混混合，静置

40、合，静置10分钟分钟42C 1分钟分钟加入加入1mL LB培养基培养基37摇摇1小时小时10-100 L转化转化液涂含抗菌素液涂含抗菌素的平板的平板吸附吸附DNA摄入摄入DNA（1）热休克法）热休克法电击法电击法(Gene transfer by electroporation)（2）高压电穿）高压电穿孔转化法孔转化法LB培养受体菌至培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴冰浴15分钟，分钟，2C离心集菌离心集菌冰冷的水冰冷的水重悬菌体重悬菌体2C离心离心集菌集菌冰冷的水冰冷的水重悬菌体重悬菌体2C离心离心收集菌体收集菌体少量冰冷少量冰冷的水重悬的水重悬分装成分装成 50-300 L 电转仪

41、调为电转仪调为2.5kV,25 F 脉冲控制器脉冲控制器200-400 0.5 g质粒质粒DNA On ice混合混合加入加入1mLSOC培养液培养液37C中速震中速震荡荡60分钟分钟10-100 L转化液涂转化液涂含抗菌素的平板含抗菌素的平板转化转化电转化法步骤：电转化法步骤：4.平板培养平板培养基培养细菌基培养细菌10-100 L转转化液化液涂于含抗涂于含抗菌素的平菌素的平板板37过夜过夜用氯化钙化学转化转化环形重组质粒环形重组质粒 质粒自我连接质粒自我连接:干扰因素干扰因素线性载体或线性载体或DNADNA片断进入细菌会被降解。片断进入细菌会被降解。环形质粒数环形质粒数（1）重组质粒）重组

42、质粒 5.影响转化率的因素影响转化率的因素生长状态生长状态制备感受态菌必须使用制备感受态菌必须使用对数生长期对数生长期的菌。的菌。必须在冰冷的条件下制备。必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在储存感受态菌要在-70以下以下CaCl2处理处理使用感受态菌时必须迅速融化使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞）感受态细胞 （competent cells)把重组的噬菌体把重组的噬菌体 DNA或或Cosmid质粒质粒DNA包装成具有感染能力的包装成具有感染能力的 噬菌体颗粒

43、。噬菌体颗粒。（1）体外包装（）体外包装（in vitro packaging）（2）转导（）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的通过受体菌细胞表面的 DNA接受器位接受器位点（点（receptor site)，使带有外源基因的，使带有外源基因的重组体重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。注入受体大肠杆菌进行扩增。3 重组重组 噬菌体噬菌体DNA的体外包装与转导的体外包装与转导cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，感染细菌后，在在32下培养细菌时能够保下培养细菌时能够保持溶源性。持溶源性。但当温度升高到但当温度升高到4445时，就

44、会导致时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857基因突变的基因突变的 噬菌体噬菌体 但由于该噬菌体的但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。所以细菌还不裂解。cI857其它基因其它基因溶源状态（溶源状态（DNA不转录、不翻译）不转录、不翻译）DNA阻遏阻遏 蛋白蛋白阻遏阻遏 蛋白蛋白4445 DNA转录、翻译合成外壳蛋白转录、翻译合成外壳蛋白32 噬菌体噬菌体1外壳蛋白基因外壳蛋白基因E发生了无义突变，不发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合

45、成其它外壳能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（蛋白（尾部蛋白尾部蛋白）。）。在在cI857基因突变的基因突变的 噬菌体的基础上，噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型选择两种外壳蛋白的突变型 噬菌体。噬菌体。（4）互补型噬菌体互补型噬菌体 外壳蛋白基因外壳蛋白基因D发生了无义突变，不发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（成其它外壳蛋白（头部头部、尾部蛋白）。、尾部蛋白）。噬菌体噬菌体2(5)体体外外包包装装过过程程 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每体菌发生溶

46、菌，形成噬菌斑。（每 g DNA能形成能形成106噬菌斑）。噬菌斑）。（6）转导转导 74 重组克隆载体导入真核细胞重组克隆载体导入真核细胞一、导入酵母细胞一、导入酵母细胞二、导入植物细胞二、导入植物细胞三、导入哺乳动物细胞三、导入哺乳动物细胞外外源源基基因因导导入入真真核核细细胞胞转化率高的菌株；转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。不育的菌株（不会与其他酵母接合）。一、导入酵母细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择菌株选择如：如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31（1

47、）利用原生质球进行转化）利用原生质球进行转化 2.酵母的转化方法酵母的转化方法 酵母酵母原生质球原生质球感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因插入外源基因 的酵母载体的酵母载体PEG（聚乙二醇）使（聚乙二醇）使细胞壁细胞壁具有通透性，允具有通透性，允许许DNA进入。进入。CaCl2使使细胞膜细胞膜具有通透性，允许具有通透性，允许DNA进入。进入。转化转化n原生质球原生质球(Spheroplast)指指细胞壁细胞壁未被全部去掉未被全部去掉的细菌细胞，它呈圆球状，可以人为地通过溶菌的细菌细胞，它呈圆球状，可以人为地通过溶菌酶或青霉素处理革兰氏阴性细菌而获得。酶或青霉素处理革兰氏阴性

48、细菌而获得。n该类菌细胞壁肽聚糖虽被除去，但外壁层中该类菌细胞壁肽聚糖虽被除去，但外壁层中脂多脂多糖、糖、脂蛋白脂蛋白仍然保留仍然保留，外壁的结构尚存。所以，外壁的结构尚存。所以，原生质球较之原生质球较之原生质体原生质体对外界环境具一定抗性，对外界环境具一定抗性，并能在普通并能在普通培养基培养基上生长。上生长。酵母酵母0.1mol/L LiCl处理处理插入外源基因的酵母载体插入外源基因的酵母载体感受态感受态40%PEG 4000（2）利用）利用Li+盐进行转化盐进行转化叶盘叶盘消毒消毒切取切取土壤农杆土壤农杆菌浸泡菌浸泡看护培养基看护培养基愈伤组织愈伤组织分化幼苗分化幼苗二、导入植物细胞二、导

49、入植物细胞1.叶盘法（叶盘法（leaf disk)植物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维素酶纤维素酶和果胶酶和果胶酶DNA混合入电混合入电击缓冲液击缓冲液电转仪1-2kV,3-25 F电击电击愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗分化分化2.电击法（电击法（electroporation)又称又称高速微型子弹射击法（高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)DNA1.2 m钨弹头钨弹头 吸附吸附特制手枪特制手枪射击植物射击植物装入装入3.基因枪法（基因枪法（gene gun）基因枪法基因枪法(Biolistic-bombardment)支撑板支撑板4.农杆菌农杆菌（ag

50、robacterium）介导）介导（1）原理：）原理：三、导入哺乳动物细胞三、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法HEPES4-羟乙基哌嗪乙磺酸羟乙基哌嗪乙磺酸;N-(2-羟乙基羟乙基)哌嗪哌嗪-N-2-乙烷磺乙烷磺酸酸缓冲盐水缓冲盐水（将（将1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2HPO4.2H2O、0.2g葡聚糖葡聚糖(glucan or dextran)和和1g HEPES溶解在溶解在90ml的蒸馏水，用的蒸馏水，用0.5M NaOH调节至所需调节至所需pH值，再用蒸馏水定容至值，再用蒸馏水定容至100ml即可。）即可。）与含有氯化钙和与含有氯化钙和DNA的

51、溶液缓的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉的沉淀。淀。依据不同的细胞类型，平皿上最多依据不同的细胞类型，平皿上最多能有能有10%的细胞能吸收的细胞能吸收DNA沉淀。沉淀。（2）特点：）特点：脂质体有商业试剂盒（如脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。）。2.脂质体（脂质体（lipofectin）载体法）载体法脂类包埋脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。，通过细胞膜进入细胞。直接把外源直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。使其整合到染色体上。3.显微注射法显微注射法(microinjection)二乙氨乙基（二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。4.DEAE-葡萄糖传染法葡萄糖传染法葡聚糖葡聚糖葡聚糖葡聚糖+DNA吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNADNA可可以进入到细胞核里。以进入到细胞核里。DEAE-dextran细胞细胞外源外源DNA预处理预处理摄入摄入DEAE-dextran外源外源DNA细胞细胞混合混合DEAE-dextran对细胞有毒对细胞有毒!5.病毒（病毒（virus）介导）介导外源基因外源基因导入细胞导入细胞的方法的方法7