生物选修一2.3分解纤维素的微生物的分离

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1、2.32.3分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离一、基础知识一、基础知识（一）纤维素和纤维素酶（一）纤维素和纤维素酶1 1、纤维素、纤维素纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。2 2、纤维素的分布、纤维素的分布 棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。但被利此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。但被利用的机会很少、效率低；用的机会很少、效率低；科学家正致力于研究，怎科学家正致力于研究，怎样

2、将农业废弃物、木材及生长样将农业废弃物、木材及生长更为迅速的草本植物，更为迅速的草本植物，转化为转化为种类繁多的生物燃料种类繁多的生物燃料（甚至是（甚至是航空燃油）。航空燃油）。纤维素生物燃料：纤维素生物燃料：最有希望替代石油能源最有希望替代石油能源 植物每年产生的纤维素超过植物每年产生的纤维素超过7070亿吨，其中亿吨，其中40%-60%40%-60%能被能被土壤中能产生土壤中能产生纤维素酶纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。的微生物所利用，不会大量积累。在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生的微生物，其原理也是产生

3、纤维素酶纤维素酶而分解纤维素，而而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。人没有分解纤维素的能力。3 3、纤维素酶、纤维素酶 纤维素酶是一种纤维素酶是一种复合酶复合酶，一般认为它至少包，一般认为它至少包括三种组分，即括三种组分，即C1C1酶、酶、CXCX酶和葡萄糖苷酶酶和葡萄糖苷酶，前两，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。二糖分解成葡萄糖。纤维二糖纤维二糖C1酶、酶、Cx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素P27P27：纤维素酶分解纤维素的实验：纤维素酶分解纤维素的实验取二支取二支20mL的试管的试管各加入一张滤

4、纸条各加入一张滤纸条各加入各加入pH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和和10ml在乙试管中加入在乙试管中加入1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失甲甲 乙乙讨论：讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？思考思考实验分析：实验分析：P27P27的小实验是如何的小实验是如何构成对照的？构成对照的？滤纸崩溃法滤纸崩溃法自变量是纤维素酶的有无：自变量是纤维素

5、酶的有无：一支试管中添加适量纤维素酶溶液，一支试管中添加适量纤维素酶溶液，另一支试管不添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶，（但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，（但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的否则会影响溶液的pHpH。）。）（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选 1 1、筛选方法：、筛选方法：刚果红染色法刚果红染色法，这种方法能，这种方法能够通过颜色反应直接对微生物进够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。行筛选。2 2、筛选原理：、筛选原理：刚果红刚果红是一种染料，它可以是一种染料，它可以与像纤维素这与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物样的多糖物质形成红

6、色复合物 ，但并不和纤维，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的透明圈透明圈 。这样我们可以通过。这样我们可以通过是否产生透明圈是否产生透明圈来来筛选纤维素分解菌。筛选纤维素分解菌。例例1 1：下列关于纤维素酶的说法，错误的是（：下列关于纤维素酶的说法，错误的是（）A.A.纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B.B.纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖纤维素酶可

7、把纤维素分解成葡萄糖C.C.纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D.D.葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖D二、实验设计二、实验设计（一）分离分解纤维素的微生物实验流程（一）分离分解纤维素的微生物实验流程土壤土壤取样取样选择选择培养培养梯度梯度稀释稀释将样品涂将样品涂布到鉴别布到鉴别培养基培养基挑选挑选菌落菌落什么样什么样的环境的环境取样取样?培养的目的培养的目的?选择培养基的特选择培养基的特点点?挑选什挑选什么样的么样的菌落菌落?鉴别培养基的鉴别培养基的特点特点?如何鉴别如何鉴别?根据：根据：微生物微生物对生存环境的对生存环境的要求，到相

8、应要求，到相应环境中去找；环境中去找；目的：目的：增加纤维增加纤维素分解菌的浓度，素分解菌的浓度，以确保能够从样以确保能够从样品中分离到所需品中分离到所需要的微生物；要的微生物；刚果红染色法刚果红染色法本实验流程与尿素分解菌的分离实验流程有哪些异同？尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成的菌悬液直接涂布在选择培养基上的菌悬液直接涂布在选择培养基上;本课题通过本课题通过选择培养使细菌增殖后选择培养使细菌增殖后,再涂布在鉴别培养基上。再涂布在鉴别培养基上。其它操作基本基本共同。其它操作基本基本共同。分布环境分布环境1 1、土壤取样：、土壤取样：富含纤维素的环境中富

9、含纤维素的环境中富含纤维素的环境中富含纤维素的环境中 生物与环境的互相依存关系，在富含纤维生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。普通环境。原因原因（二）操作步骤（二）操作步骤实例实例讨论讨论 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约一般应将滤纸埋于深约10cm10cm左右的土壤中

10、。左右的土壤中。树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。枯枝败叶等。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？纸应该埋在土壤中多深？2 2、选择选择培养培养 增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。中分离所需要的微生物。目的：目的：制备选择培养基制备选择培养基操作：操作：将土样加入装有将土样加入装有30ml30ml选择培养基的锥形瓶选择培养基的锥形

11、瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养荡培养1 12 2天，直至培养液变浑浊。也可重复天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。选择培养。阅读资料二阅读资料二“选择培养基选择培养基”，回答以下几问题：，回答以下几问题：碳源（能源）碳源（能源）氮源、无机盐氮源、无机盐无机盐无机盐碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子氮素、生长因子氮素、生长因子水水提供主要的营养物质提供主要的营养物质提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对

12、照,或者将纤维素改为葡萄糖。或者将纤维素改为葡萄糖。A A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？为什么？是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）。是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）。目的是使纤维素分解菌增殖目的是使纤维素分解菌增殖,含量增多含量增多。B B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？具有，是如何进行选择的？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。只有能分解纤维素的微生物可以大

13、量繁殖。C C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？作用？分析分析“纤维素分解菌的选择培养基配方纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。说明：说明：在选择培养的条件下，可以使那些能够在选择培养的条件下，可以使那些能够适应适应这种营养条件的

14、微生物得到这种营养条件的微生物得到迅速繁殖迅速繁殖，而那些，而那些不不适应适应这种营养条件的微生物的繁殖被这种营养条件的微生物的繁殖被抑制抑制，因此，因此可以起到可以起到“浓缩浓缩”的作用。的作用。将细菌涂布在只将细菌涂布在只有尿素做氮源的有尿素做氮源的选择培养基上选择培养基上将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的纤维素粉做碳源的选择培养基上选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株增大菌株浓度增大菌株浓度比较：比较：本实验的流程与课题本实验的流程与课题2 2中的实验流程有哪些异同？中的实验流程有哪些异同？本实验流程与课题本实验流程与课题2 2的流程的区别如

15、下。课题的流程的区别如下。课题2 2是将土样制成的菌悬液直接涂布在是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题得到菌落。本课题通过通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。思考：思考：按照课题按照课题1 1的稀释操作方法，将选择培养后的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释的培养基进行等比稀释10101 110107 7倍。倍。3 3、梯度稀释、梯度稀释101102103104

16、1051064 4、将样品涂布到、将样品涂布到鉴别鉴别纤维素分解菌的培养基上纤维素分解菌的培养基上（1 1）制备鉴别培养基）制备鉴别培养基:(水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠)（2 2）涂布平板：）涂布平板：将稀释度为将稀释度为10104 410106 6的菌悬液各取的菌悬液各取0.1mL0.1mL滴加滴加在在鉴别鉴别纤维素分解菌的培养基上纤维素分解菌的培养基上,用涂布器将菌用涂布器将菌液涂布均匀液涂布均匀,在在3030倒置培养倒置培养。每个稀释度下需。每个稀释度下需涂布涂布3 3个平板个平板,还要注意还要注意设置对照设置对照。5 5、刚果红染色法、刚果红染色法 挑选产生挑选产生透明圈

17、透明圈的菌落，一般即为分解纤维的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。素的菌落。常用的刚果红染色法有两种：常用的刚果红染色法有两种：方法一：方法一：先先_，再加入刚果红进行颜色反应。，再加入刚果红进行颜色反应。方法二：方法二：在在_时就加入刚果红。时就加入刚果红。培养微生物培养微生物倒平板倒平板染色法染色法优点优点缺点缺点方法一方法一方法二方法二颜色反应基本颜色反应基本上是纤维素分上是纤维素分解菌的作用解菌的作用操作繁琐操作繁琐刚果红会使菌落之间刚果红会使菌落之间发生混杂发生混杂操作简便不操作简便不存在菌落混存在菌落混杂问题杂问题1.产生淀粉酶的微生物产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈也产生模糊透明

18、圈2.有些微生物能降解色有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。素，形成明显的透明圈。漂洗作用漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可用这方法可以判断酶活力的大小以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留液就可

19、以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强维素的能就强！在细菌分解尿素的化学在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增氨会使培养基的碱性增强，强，pH升高。在培养基升高。在培养基中加入酚红指示剂，如中加入酚红指示剂，如果果pH升高指示剂会变红升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解素被纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，后红色复合物无法形成，培养基上就会出现

20、以纤培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透维素分解菌为中心的透明圈明圈观察菌落周围是否有着观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿色的环带出现来鉴定尿素分解菌素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分透明圈来筛选纤维素分解菌解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法6 6、纯化培养、纯化培养 挑取产生挑取产生明显的透明圈的菌落，明显的透明圈的菌落，一般即为一般即为分解纤维素的菌落。分解纤维素的菌落。接种到接种到纤维素分解菌的纤维素分解菌的选择选择培养基上，在培养基上，在30300 0C C 37 370 0C C培养，可获得纯培养。培养，可获得纯培养。三、结果

21、分析与评价三、结果分析与评价对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。了分解纤维素的微生物。1 1、培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛、培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落选出菌落2 2、分离的结果是否一致、分离的结果是否一致由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取

22、土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。等不同的分离结果。为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行需要进行_实验，纤维素酶实验，纤维素酶的发酵方法有的发酵方法有_ _ 发酵和发酵和_ _ 发酵。发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的维素所产生的_ _ 含量进行定量测定。含量进行定量测定。四、课题延伸四、课题延伸发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶 液体液体 固体固体 葡萄糖葡萄糖 分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离纤维素

23、酶纤维素酶种类、作用、催化活力种类、作用、催化活力刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌沙场点兵沙场点兵1 1、利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下、利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是（列说法错误的是（）A.A.刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物 B.B.刚果红能与纤维二糖形成红色复合物刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C.C.刚果红不能

24、与葡萄糖形成红色复合物刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D.D.若培养基上产生了透明圈，则说明已筛若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌选出了纤维素分解菌B2 2、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点？（符合下列哪一生物学观点？（）A A、生物结构与功能相适应的观点、生物结构与功能相适应的观点 B B、生物结构与功能整体性观点、生物结构与功能整体性观点C C、生物与环境相适应的观点、生物与环境相适应的观点 D D、生物发展进化的观点、生物发展进化的观点C3 3、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（）土壤取样土壤取样 梯度稀释梯度稀释 选择培养选择培养 菌悬液涂布平板菌悬液涂布平板 挑选出单个菌落挑选出单个菌落A A、B B、C C、D D、B谢谢！谢谢！