聚丙烯酰胺凝胶电泳

《聚丙烯酰胺凝胶电泳》由会员分享，可在线阅读，更多相关《聚丙烯酰胺凝胶电泳（6页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳法1. 仪器装置通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。2. 试剂溶液A取三羟甲基氨基甲烷36.6g四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml,再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。溶液B取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。电极缓冲液(pH8.3)取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。溴酚蓝指示液取溴酚蓝0.1g加0.05m

2、ol/L氢氧化钠溶液3.0ml与90%乙醇5ml,微热使溶解，加20%乙醇制成250ml。(5) 染色液取0.25%(W/V)考马斯亮蓝G溶液2.5ml,加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。(6) 稀染色液取上述染色液2ml，加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。(7) 脱色液7%醋酸溶液。3. 操作(1)制胶取溶液A2ml,溶液B5.4ml,加尿素2.9g使溶解,再加水4ml,混匀,抽气赶去溶液中气泡，加0.56%过硫酸铵溶液2ml,混匀制成胶液,立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10x0.5cm)中,使胶层高度达6-7cm,然后徐徐滴

3、加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。(2)标准品溶液及供试品溶液的制备电泳将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50-100Ml，为防止扩散可加甘油或40%蔗糖溶液12滴及0.04%溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。调节起始电流使每管为1mA，数分钟后，加大电流使每管为23mA,当溴酚蓝指示液移至距玻璃管底部1cm处，关闭电源。(4) 染色和脱色电泳完毕，用装有长针头并吸满水的注射器,自胶管底部沿胶管壁将水压入，胶条即从管内滑

4、出,将胶条浸入稀染色液过夜或用染色液浸泡10-30分钟，以水漂洗干净，再用脱色液脱色至无蛋白区带凝胶的底色透明为止。(5) 结果判断将胶条置灯下观察，根据供试品与标准品的色带位置和色泽深浅程度进行判断。相对迁移率供试品和标准品的电泳区带有时可用相对迁移率(R)进行比较。实验二、血清蛋白的分离聚丙烯酰胺凝胶电泳法目的要求(1) 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。(2) 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N甲叉双丙烯聚酰胺(Bis)聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。

5、Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺(Ap),催化剂是四甲基乙二胺(TEMED)；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸胺，在紫外光照射下引发自由基团。采用不同浓度的Acr、Bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）有圆盘（disc）和垂直板（verticalslab）型之分，但两者的原理完全相同。由于垂直板形具有板薄，以冷却，分辨率高，操作简单，便于比较与扫描的优点，而为大多数实验室采用。试剂和器材一

6、、试剂分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:取lmol/L盐酸48mL，Tris36.3g，用无离子水溶解后定容至100mL。浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL,Tris5.98g，用无离子水溶解后定容至100mL。电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris6g,甘氨酸28.8g,用无离子水溶解后定容至1L。用时稀释10倍。30%AcrBis贮存液：30gAcr,0.8gBis,用无离子水溶解后定容至100mL，不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。TEMED；10%过硫酸铵（新鲜配制）；25%蔗糖溶液；0.05%溴酚蓝溶液；

7、7%冰乙酸溶液。染色液：称取考马斯亮蓝R2502.5g，冰乙酸92ml，甲醇454ml，加去离子水454ml使其完全溶解，过滤后置棕色瓶保存。脱色液：取甲醇50ml，冰乙酸75ml，加蒸馏水至1000ml。二、材料人或动物血清。三.器材DYCZ-24D型垂直板电泳槽；移液管1mL（，3），5mL（，4），0.5mL（，1），0.1mL（，2）；烧杯100mL（，2）；细长头的吸管；微量注射器。操作方法一、安装垂直板电泳槽1. 将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠；2用手将两块玻璃板夹住放入电泳槽内，玻璃室凹面朝外，插入斜插板；3用蒸馏水试验封口处是否漏水。二、制备凝胶板1分离

8、胶制备：取Acr-Bis储备液5.0mL,Tris-HCl缓冲液PH8.92.5mL,去离子水12.39mL,TEMED0.02mL置于小烧杯中混匀，再加入10%O.lmL过硫酸胺，用磁力搅拌器充分混匀2min。混合后的凝胶溶液,用细长头的吸管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约lcm。用吸管在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸馏水（约34cm）,用于隔绝空气，使胶面平整。分离胶凝固后，可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限。倒掉重蒸水，用滤纸吸去多余的水。2.浓缩胶制备：取Acr-Bis储备液1.0mL,Tris-HCl缓冲液（PH6.7）1.25mL,TEMED0.0

9、1mL,去离子水7.64mL,10%过硫酸胺0.1mL,用磁力搅拌器充分混匀。混合均匀后用细长头的吸管将凝胶溶液加到长短玻璃板的窄缝内（及分离胶上方），距短玻璃板上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。待浓缩胶凝固后，轻轻取出样品模槽板,用手夹住两块玻璃板,上提斜插板,使其松开,然后取下玻璃胶室去掉密封用胶框,用1%电泳缓冲液琼脂胶密封底部，再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽。插入斜插板，将电泳缓冲液加至内槽玻璃凹口以上，外槽缓冲液加到距平玻璃上沿3mm处。三、加样取0.1mL血清样品，0.1mL25%蔗糖溶液，0.05mL0.05%溴酚蓝溶液混合后，用微量注射器取5gL上述混合液，通过缓冲液，小心

10、将样品加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。四、电泳将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA。待样品进入分离较时，将电流调至2030mA。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。五、染色将凝胶放入考马斯亮蓝R250染色液中，使染色液没过胶板，染色30min左右。六、脱色弃去染色液，将凝胶置于脱色液中，并经常更换脱色液，直至背景蓝色褪去。如用50C水浴或脱色摇床，则可缩短脱色时间。脱色液经活性炭脱色后，可反复使用。注意事项(1)Acr和Bi

11、s均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩，纯化应在通风橱内进行。(2)玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。(3) 样品槽模板梳齿应平整光滑。(4) 用琼脂封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。(5) 切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。(6) 为防止电泳后区带拖尾，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的样品可用透析法或凝胶过滤法脱盐(7) 电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。思考题1.简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理，如何调节凝胶的孔径?2. 为什么样品会在浓缩胶中被压缩成层？3. 为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的40蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蓝各有何用途？4. 上下两槽电泳缓冲液电泳后，能否混合存放？为什么？5. 根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺垂直板电泳？哪些是关键步骤？