单克隆抗体与抗体工程

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1、单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程1一：细胞融合一：细胞融合1：细胞融合技术定义与应用价值：细胞融合技术定义与应用价值n细细胞胞融融合合（cell cell fusionfusion）又又称称体体细细胞胞杂杂交交（somatic somatic hybridizationhybridization）或或细细胞胞杂杂交交（cell cell hybridizationhybridization），是是指指在在离离体体条条件件下下用用人人工工方方法法将将不不同同种种生生物物或或同同种种生生物物不不同同类类型型的的单单细细胞胞通通过过无无性性方方式式融融合合成成一一个个杂杂合合细细胞胞的的技技

2、术术。利利用用细细胞胞融融合合技技术术使使不不同同的的细细胞胞融融合合成成一一个个新新的的杂杂合合细细胞胞，这这个个新新的的细细胞胞就就获获得得了了两两个个亲亲本本细细胞胞的的遗遗传传信信息息和和细细胞胞质质，从而具备有两个亲本细胞的优点。从而具备有两个亲本细胞的优点。2细胞融合技术的应用价值细胞融合技术的应用价值 n细胞融合能重新组合两个亲本细胞细胞融合能重新组合两个亲本细胞的优良遗传信息，是研究细胞间遗的优良遗传信息，是研究细胞间遗传信息传递、基因在染色体上定位、传信息传递、基因在染色体上定位、改良动物遗传特性、及创造新的符改良动物遗传特性、及创造新的符合人类需要的新的细胞系的极为有合人类

3、需要的新的细胞系的极为有效的手段。效的手段。3植物细胞融合与人造小鼠培育过程植物细胞融合与人造小鼠培育过程4细胞融合过程细胞融合过程三个阶段三个阶段n融合前准备融合前准备n细胞融合细胞融合n及融合后的细胞管理及融合后的细胞管理5融合前准备融合前准备 n主要包括细胞培养材料准备、选择主要包括细胞培养材料准备、选择免疫动物、抗原及免疫方案设计等；免疫动物、抗原及免疫方案设计等；6细胞融合细胞融合 n一个相对简单的过程，包括骨髓瘤细胞一个相对简单的过程，包括骨髓瘤细胞准备、脾细胞分离、融合操作等。准备、脾细胞分离、融合操作等。n用用于于细细胞胞融融合合的的融融合合剂剂可可以以是是病病毒毒、化化学试剂

4、，或采用电融合技术进行融合。学试剂，或采用电融合技术进行融合。n在在最最近近的的二二十十多多年年来来，细细胞胞融融合合技技术术有有了了长长足足的的发发展展，其其本本身身也也已已成成为为一一们们专专门门的的技技术术在在生生命命科科学学领领域域中中发发挥挥巨巨大大作作用。用。7融合后的管理融合后的管理 n对融合细胞进行筛选与克隆、优良对融合细胞进行筛选与克隆、优良细胞传代与保存等；细胞传代与保存等；8细胞融合的关键技术方法细胞融合的关键技术方法n1）动动物物选选择择、免免疫疫方方案案设设计计、免免疫疫途途径确定径确定n2）亲亲本本细细胞胞准准备备、融融合合技技术术（条条件件、物质手段、融合管理）电

5、融合技术物质手段、融合管理）电融合技术细细 胞胞 克克 隆隆：有有 限限 稀稀 释释 法法（limited limited dilution dilution technologytechnology）和和 软软 琼琼 脂脂 法法（soft agar cloning technologysoft agar cloning technology）n3）融合后细胞管理融合后细胞管理9细胞融合技术最有意义的成果之一就细胞融合技术最有意义的成果之一就是单克隆抗体的制备。是单克隆抗体的制备。n单克隆抗体在生物、农业、医疗、单克隆抗体在生物、农业、医疗、制药等众多领域得到极为广泛的制药等众多领域得到极为广

6、泛的应用；尤其是人源性单克隆抗体应用；尤其是人源性单克隆抗体制备技术的发展，使单克隆抗体制备技术的发展，使单克隆抗体具有更高的实用价值。具有更高的实用价值。10单克隆抗体技术1：抗体的结构与功能：抗体的结构与功能11抗体的结构抗体的结构12抗体的功能抗体的功能抗原结合活性和特异性（抗原结合活性和特异性（Fab）激活肌体免疫反应（激活肌体免疫反应（Fc）激活补体系统激活补体系统 介导介导ADCC、K、NK毒性反应毒性反应 与激活与激活Fc-R结合结合 13杂交瘤技术原理与过程杂交瘤技术原理与过程 14杂交瘤技术原理杂交瘤技术原理n利利用用两两种种细细胞胞突突变变株株，一一株株为为TK-TK-、H

7、GPRT+HGPRT+，另另一一株株为为HGPRT-HGPRT-、TK+TK+。在在一一般般培培养养条条件件下下，细细胞胞可可利利用用主主要要途途径径合合成成DNADNA，这这些些突突变变细细胞胞能能正正常常生生长长。当当主主要要途途径径被被氨氨基基碟碟呤呤阻阻断断时时，这这两两株株细细胞胞不不能能增增殖殖；如如将将这这两两株株细细胞胞融融合合，则则只只有有异异核核体体杂杂交交瘤瘤细细胞胞能能在在HATHAT培培养养基基上上存存活活，因因为为两两种种细细胞胞相相互互补补充充了了另另一一种种细细胞胞缺缺失失的的酶酶；而而未未融融合合的的细细胞胞或或自自身身融融合合的的同同核核体体细细胞仍然是而胞

8、仍然是而TK-TK-或或HGPRT-HGPRT-而被淘汰。而被淘汰。15杂交瘤技术过程杂交瘤技术过程16 单克隆抗体的改造与应用单克隆抗体的改造与应用171：单克隆抗体靶向技术与：单克隆抗体靶向技术与 靶向单抗应用靶向单抗应用 n单克隆抗体靶向制剂单克隆抗体靶向制剂利用抗体的利用抗体的特异性，将药物连接到抗体上，在特定特异性，将药物连接到抗体上，在特定的部位发挥作用的制剂。的部位发挥作用的制剂。n制备方法制备方法：与药物直接连接与药物直接连接McAb 小分子小分子 药物药物 大分子大分子 药物药物18应用：应用：特异性溶解血栓药物特异性溶解血栓药物抗肿瘤药物抗肿瘤药物其它药物其它药物192：人

9、源性单抗的制备方法：人源性单抗的制备方法 EBV转化技术转化技术 EBV转化转化-融合技术融合技术 嵌合抗体技术嵌合抗体技术 改型抗体技术改型抗体技术 噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术 20EBV转化技术转化技术21EBV转化转化-融合技术融合技术22嵌合抗体技术嵌合抗体技术n人-鼠嵌合抗体就是用人源性抗体的一部分代替鼠源性抗体的一部分，使之保留对抗原的特异性，又具备与补体和细胞结合的功能，并减少异源性蛋白的抗原性。n研究人员设想，用人源性基因代替鼠源性抗体基因中的Fc区。因为Fc区的主要功能是激活机体免疫反应，也是产生人抗鼠反应的部分。研究人员利用编码人抗体Fc区的DNA片段替换鼠源性的Fc

10、段DNA。23嵌合抗体技术嵌合抗体技术n嵌合改型抗体嵌合改型抗体 鼠源性抗原决定簇鼠源性抗原决定簇 鼠源性可变区鼠源性可变区n人鼠源性抗体高变区人抗体人鼠源性抗体高变区人抗体24改型抗体技术改型抗体技术n嵌合抗体由鼠可变区与人稳定区组合而成，因嵌合抗体由鼠可变区与人稳定区组合而成，因而仍有一定的免疫原性。而仍有一定的免疫原性。n为降低来自小鼠可变区中骨架区的免疫原性，为降低来自小鼠可变区中骨架区的免疫原性，WinterWinter等克隆出鼠源抗体中与抗原结合的三个等克隆出鼠源抗体中与抗原结合的三个互补决定区（互补决定区（CDRCDR）基因用以置换人抗体中相）基因用以置换人抗体中相应序列。应序列

11、。n由于这种抗体绝大部分为人源性，只有由于这种抗体绝大部分为人源性，只有CDRCDR区区来自小鼠，因而称为来自小鼠，因而称为CDRCDR移植抗体（移植抗体（CDR CDR grafted antibodygrafted antibody）。这种抗体在人体内免。这种抗体在人体内免疫性大为降低疫性大为降低 25改型抗体技术改型抗体技术 鼠源性基因 人源性基因26噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术n将从人或小鼠将从人或小鼠B B淋巴细胞中分离的淋巴细胞中分离的mRNAmRNA逆转录逆转录成成cDNAcDNA，用，用PCRPCR扩增编码轻链和重链的扩增编码轻链和重链的cDNAcDNA；n然后用限制性内切

12、酶酶解扩增的然后用限制性内切酶酶解扩增的cDNAcDNA片段，克片段，克隆到丝状噬菌体质粒载体中，与丝状噬菌体蛋隆到丝状噬菌体质粒载体中，与丝状噬菌体蛋白白基因连接成融合基因，经辅助噬菌体感染基因连接成融合基因，经辅助噬菌体感染大肠杆菌后，携带有表达载体的大肠杆菌就会大肠杆菌后，携带有表达载体的大肠杆菌就会释放外壳上带有抗体片段的噬菌体；释放外壳上带有抗体片段的噬菌体；n再用再用ELISAELISA或免疫亲和层析法筛选出特异性抗或免疫亲和层析法筛选出特异性抗体体。27噬噬菌菌体体抗抗体体库库技技术术B B淋巴细胞淋巴细胞分离的分离的mRNAmRNA逆转录成逆转录成cDNAcDNAPCRPCR扩

13、增编码轻扩增编码轻链和重链的链和重链的cDNAcDNA限制性内切酶酶解限制性内切酶酶解克隆到丝状噬菌克隆到丝状噬菌体质粒载体中体质粒载体中感染大肠杆菌感染大肠杆菌释放外壳上带有抗释放外壳上带有抗体片段的噬菌体体片段的噬菌体筛选出特异性抗体筛选出特异性抗体283：免疫学研究中应用：免疫学研究中应用294：医学临床诊断与治疗中的应用：医学临床诊断与治疗中的应用 305：生物大分子分离纯化中的应用：生物大分子分离纯化中的应用31 细细胞胞融融合合技技术术最最有有意意义义的的成成果果之之一一就就是是单单克克隆隆抗抗体体的的制制备备。单单克克隆隆抗抗体体一一在在生生物物、农农业业、医医疗疗、制制药药等等

14、众众多多领领域域得得到到极极为为广广泛泛的的应应用用；尤尤其其是是人人源源性性单单克克隆隆抗抗体体制制备备技技术术的的发发展展，使使单单克克隆隆抗抗体体具具有有更更高高的的实实用用价价值值。选选择择HGPRT-HGPRT-、TK-TK-、不不分分泌泌抗抗体体的的骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞与与经经抗抗原原免免疫疫的的B B淋淋巴巴细细胞胞融融合合，用用HATHAT培培养养基基筛筛选选出出杂杂交交瘤瘤，再再经经有有限限稀稀释释法法或或软软琼琼脂脂法法克克隆隆抗抗体体分分泌泌阳阳性性杂杂交交瘤瘤，可可在在动动物物体体内内或或体体外外大大量量培培养养杂杂交交瘤瘤生生产产单单克克隆隆抗抗体体。由由于于鼠鼠源源性性单单抗抗在在应应用用上上有有其其固固有有的的局局限限性性，研研究究人人员员已已采采用用多多种种细细胞胞工工程程和和基基因因工工程程方方法法制制备备人人源源性性单单抗抗，以以进进一一步步提提高高单单克克隆隆抗抗体体的的实实用用价价值值。虽虽然然目目前前人人源源性性单单抗抗进进展展不不尽尽如如人人意意，但但是是，细细胞胞工工程程与与基基因因工工程程的的结结合合，必必将将会会使使单单克克隆隆抗抗体体进进入一个崭新的阶段。入一个崭新的阶段。32