残留溶剂GC检查方法的设计验证

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1、残 留 溶 剂 GC检 查 方 法 的 设 计 与 验 证毛细管检查方法高 青北 京 市 药 品 检 验 所 一、检测器二、溶媒三、供试品溶液的配制四、顶空瓶中样品体积五、色谱柱六、温度七、进样方式八、提高灵敏度九、提高分离度十、未知峰归属十一、方法验证 一、检测器FID（ 火 焰 电 离 ） 、 NPD（ 热 表 面 电 离 ） 和ECD（ 化 学 电 离 ） ， 应 用 范 围 分 别 为 有 机 物 、氮 /磷 化 合 物 、 电 负 性 物 质 （ 卤 代 烃 ） 。多 数 情 况 下 ， 三 氯 甲 烷 、 DMF、 DMSO均 用 FID检 测 ， 但 需 采 取 一 些 措 施

2、提 高 检 测 灵 敏 度。四氯化碳则必须用ECD检测器。 以 下 三 点 注 意 ：FID 质 量 型 检 测 器 ， 对 有 机 物 均 有 响 应 ， 只是 对 难 电 离 的 卤 代 烃 和 氮 /磷 化 合 物 灵 敏 度 比ECD、 NPD检 测 器 低 很 多 。ECD 半 选 择 性 的 检 测 器 ， 对 多 种 类 型 化 合 物均 有 响 应 。 如 果 含 有 其 他 非 卤 代 烃 溶 剂 ， 应进 行 系 统 适 用 性 试 验 考 察 分 离 度 。 如 果 采 用 FID检 测 器 ， 同 时 又 采 用 填 充 柱 测 定三 氯 甲 烷 ， 灵 敏 度 达 不

3、 到 限 度 要 求 。 二、溶媒选 择 原 则 ： 溶 解 样 品 ， 并 对 色 谱 柱 无 损 坏L例 如 直 接 进 样 不 能 含 GC不 能 分 析 的 无 机 盐 顶 空 进 样 ：首 选 水 ， 其 次 DMF、 DMSO、 不 挥 发 酸 碱 溶 液 ， 不 可使 用 盐 酸 溶 液 和 氨 水 ， 可 选 择 在 80 90 C加 热 能溶 解 样 品 的 试 剂 。 温 度 太 高 爆 瓶如 待 查 成 分 为 苯 、 甲 苯 、 三 氯 甲 烷 等 水 溶 性 不 好 的溶 剂 ， 可 采 用 混 合 液 ， 即 先 用 少 量 乙 醇 或 甲 醇 溶 解待 查 溶 剂

4、 再 用 水 稀 释 。当 待 测 溶 剂 在 有 机 相 中 的 分 配 系 数 明 显 大 于 水 相（ 例 如 三 氯 甲 烷 ） ， 对 顶 空 进 样 来 说 采 用 有 机 相 如DMF为 溶 剂 不 是 很 好 的 选 择 （ K大 ， 灵 敏 度 低 ） ； 如果 样 品 也 只 能 在 有 机 相 中 溶 解 ， 建 议 采 用 混 合 液 。 直 接 进 样 ：水 、 合 适 的 有 机 溶 媒 或 混 合 液 。 对 于 非 极 性色 谱 柱 ， 水 对 柱 有 影 响 ， 会 缩 短 柱 的 使 用 寿命 。 助 溶 方 式 ：有 报 道 加 5%SDS助 溶 。顶 空

5、 小 平 加 盖 后 可 超 声 加 热 助 溶 三 、 供 试 品 溶 液 的 配 制不 可 超 声 或 加 热 助 溶 ， 以 免 残 留 溶剂 挥 发 ； 如 果 顶 空 进 样 ， 样 品 置 顶 空 瓶封 盖 之 后 可 以 超 声 或 加 热 溶 解 。大 颗 粒 样 品 不 可 以 研 磨 取 样 ， 只 能 取 原态 样 品 （ 或 冷 冻 粉 碎 ） 。 顶 空 进 样 方 式 要 求 对 照 品 配 制 与 供 试 品配 制 方 法 应 绝 对 一 致 ， 否 则 顶 空 瓶 中 气液 平 衡 状 态 有 差 异 （ 基 质 效 应 ） 。对 照 品 配 制 最 好 采 用

6、 标 准 加 入 法 。 四、顶空瓶中样品体积顶空样品瓶中的样品体积（Vs）对分析结果影响很大，因为它直接决定了相比。CgCo/（K）其中Vg/Vs，KCs/Cg，当K时，样品体积改变对灵敏度影响很小。 当K时，影响很大。例如，分析水中的二氧六环和环己烷（三氯甲烷），60C平衡，两者的K分别为642、0.04。当样品体积由1ml增加至5ml，二氧六环的峰面积只提高了1.3，而环己烷却提高了452。根据实际经验来说，20ml顶空瓶样品装量为5ml比较适当。 五、色谱柱残 留 溶 剂 检 查 大 多 需 要 较 高 的 分 离 度 和 检 测灵 敏 度 ， 通 常 采 用 毛 细 管 色 谱 柱

7、。 填 充 柱 口径 大 ， 造 成 溶 剂 峰 扩 散 ， 检 测 灵 敏 度 低 。实 践 证 明 ， 使 用 非 极 性 至 中 等 极 性 色 谱 柱 ，配 合 适 当 柱 温 梯 度 可 分 离 大 部 分 有 机 溶 剂 。通 常 当 待 查 溶 剂 数 目 仅 两 、 三 种 时 ， 可 用 极性 较 强 的 色 谱 柱 ， 出 峰 快 ， 分 析 时 间 短 ； 当溶 剂 数 目 较 多 时 ， 还 是 优 选 非 极 性 至 中 等 极性 柱 分 离 较 好 。 非极性柱弱极性柱中低极性柱中等极性柱商品名DM-1, DB-1, HP-1, SPB-1, BP-1, SE-30

8、,Rtx-1, ZB-1, AT-1,CP-Sil5CB等DM-5, DB-5,HP-5, SPB-5, BP-5, SE-52,Rtx-5, ZB-5, PE-5,SE-54,CP-Sil8CB等DM-35, DB-35, HP-35,SPB-35, BP-35, Rtx-35, ZB-35, 等DM-1701, HP-1701,SPB-7, ZB-1701,Rtx-1701, CP-Sil19CB等化学成分100二甲基聚硅氧烷5%苯基-甲基聚硅氧烷35%苯基65%甲基聚硅氧烷14%氰苯基86%甲基聚硅氧烷 中等/强极性极性柱极性柱商品名 DB-225, HP-225,SP-225, BP-

9、225,DB-23，Rtx-225,AT-225, OV225等DB-WAX, HP-INNOWAX,DB-WAXetr,CP-WAX,ZB-WAX DB-FFAP, HP-FFAP,CP- FFAP，OV-3501等化学成分50氰丙基甲基聚硅氧烷聚乙二醇（PEG）硝基对苯二酸改性的聚乙二醇 六、温度色 谱 柱 ： 初 温 应 接 近 样 品 中 最 轻 组 分 的 沸 点 ，而 终 温 则 取 决 于 最 重 组 分 的 沸 点 ， 升 温 速 率则 要 依 样 品 的 复 杂 程 度 。进 样 口 ： 一 般 接 近 沸 点 最 高 的 组 分 ， 但 要 低于 易 分 解 组 分 的 分

10、 解 温 度 。 常 用 的 条 件 是250C。检 测 器 ： 原 则 是 避 免 流 出 色 谱 柱 的 组 分 冷 凝 。FID检 测 器 通 常 设 置 为 300C。 顶 空 瓶 平 衡 温 度 ： 温 度 越 高 ， 蒸 汽 压 越 高 ， 顶 空 气体 的 浓 度 越 高 ， 分 析 灵 敏 度 越 高 。 待 测 组 分 的 沸 点越 低 ， 对 温 度 越 敏 感 。 但 温 度 的 改 变 只 影 响 分 配 系数 K， 并 不 影 响 相 比 。 例 如 水 溶 液 中 的 甲 醇 、 甲 乙 酮 、 甲 苯 、 正 己 烷和 四 氯 乙 烯 ， 80C平 衡 温 度 与

11、 40C平 衡 温 度 相 比 ，甲 醇 在 顶 空 气 体 中 的 浓 度 增 加 5.15倍 ， 甲 乙 酮 浓 度增 加 2.61倍 ， 甲 苯 只 增 加 25%， 而 正 己 烷 和 四 氯 乙烯 ， 分 别 增 加 2.6%和 10.4%。 实 际 工 作 中 往 往 是 在 满 足 灵 敏 度 的 条 件 下 ， 选择 较 低 的 平 衡 温 度 。 过 高 的 温 度 可 能 导 致 某 些 组 分的 分 解 和 氧 化 。 一 般 采 用 高 沸 点 溶 剂 时 ， 样 品 比 较稳 定 的 情 况 下 ， 推 荐 80C左 右 的 平 衡 温 度 。 七、进样方式作 为 残

12、 留 溶 剂 检 查 ， 顶 空 进 样 有 许 多 优 越 性 ，不 需 要 对 样 品 进 行 特 殊 处 理 ， 不 用 担 心 样 品中 不 挥 发 组 分 对 GC分 析 的 影 响 。 直 接 进 样 对仪 器 要 求 低 ， 由 于 部 分 实 验 室 不 具 备 顶 空 进样 器 ， 该 方 法 的 应 用 也 具 普 遍 性 。 进 样 方 式 选 择 需 注 意 的 几 点 ： 对 于 待 测 溶 剂 在 溶 解 样 品 的 溶 剂 中 溶 解 度 小（ 分 配 系 数 小 ） 的 情 况 下 ， 例 如 三 氯 甲 烷 在水 溶 液 中 ， 采 用 顶 空 进 样 方 式

13、 测 得 的 灵 敏 度将 大 于 直 接 进 样 ； 反 之 ， 例 如 甲 醇 与 水 互 溶性 好 ， 直 接 进 样 的 灵 敏 度 将 大 于 顶 空 进 样 。测 定 二 氯 甲 烷 、 三 氯 甲 烷 等 卤 代 烃 时 ， 如 果溶 剂 为 水 ， 直 接 进 样 容 易 造 成 FID检 测 器 灭 火 ，此 时 优 选 顶 空 进 样 。 无 论 是 采 用 细 口 径 或 粗 口 径 ， 均 可 选 择不 分 流 进 样 ， 提 高 灵 敏 度 。 当 然 ， 采 用不 分 流 进 样 也 要 考 虑 溶 媒 性 质 ， 挥 发 性太 大 的 溶 媒 对 色 谱 柱 污

14、染 较 大 。直 接 进 样 要 考 虑 样 品 性 质 。顶 空 进 样 体 积 可 达 到 2ml气 体 ， 而 直 接进 样 只 能 1至 3ul液 体 。 八、提高灵敏度对 于 限 度 要 求 很 严 格 的 溶 剂 ， 或 贵 重 样 品取 样 量 有 限 制 时 ， 或 检 测 器 对 该 溶 剂 灵 敏 度低 的 情 况 下 ， 采 取 一 些 措 施 提 高 灵 敏 度 是方 法 成 败 的 关 键 。溶 剂温 度不 分 流 进 样顶 空 瓶 体 积 利 用 盐 析 作 用 ， 即 在 水 溶 液 中 加 入 无 机 盐（ 硫 酸 钠 ） 来 改 变 挥 发 性 组 分 的 分

15、 配 系 数 。常 用 高 浓 度 ， 甚 至 用 饱 和 浓 度 。 盐 析 作 用 对极 性 组 分 的 影 响 远 大 于 对 非 极 性 组 分 的 影 响 。 例 如 在 水 溶 液 样 品 溶 剂 中 加 入0.01mol/L氯 化 钠 溶 液 可 使 甲 醇 、 乙 醇 灵 敏 度提 高 5倍 （ 这 种 方 法 不 常 用 ） 。 在 有 机 溶 液 中 加 入 水 ， 可 以 减 少 有 机 物 在 有机 相 中 的 溶 解 度 ， 增 大 其 在 顶 空 气 体 中 的 含量 （ 常 用 ） 。 例 如 采 用 FID检 测 器 测 定 三 氯 甲 烷 ， DMF为 溶 媒

16、 ， 顶 空 进 样 1ml气 体 ， 分 流 比 5： 1， 限度 浓 度 的 对 照 品 溶 液 检 不 出 峰 。 改 为 ： 水 为 溶 媒 ， 三 氯 甲 烷 用 少 量 乙 醇溶 解 ， 水 稀 释 至 刻 度 ， 顶 空 进 样 2ml气 体 ， 不分 流 进 样 ， 结 果 限 度 浓 度 的 对 照 品 溶 液 可 检出 很 明 显 的 色 谱 峰 ， 灵 敏 度 可 达 到 限 度 的 五 十 分 之 一 。 九 、 改 善 分 离 度v程 序 升 温v增 大 分 流 比 十 、 未 知 峰 归 属对 于 供 试 品 色 谱 图 中 出 现 的 未 知 峰 ， 应 进 行确

17、 认 。 首 先 分 析 是 否 为 样 品 裂 解 峰 ， 其 次 核实 是 否 为 应 控 制 溶 剂 ， 可 采 用 双 柱 定 性 方 式 。 十一、方法验证方 法 的 线 性 范 围 主 要 由 检 测 器 的 特 性决 定检 测 限 由 检 测 器 、 方 法 决 定回 收 率 加 样 回 收 率 重 复 性 、 中 间 精 密 度 和 重 现 性 药 检 所 残 留 溶 剂 方 法 复 核 内 容 、常 见 问 题 及 处 理 一 、 复 核 内 容灵 敏 度用 申 报 方 法 检 验 所 提 供 样 品 ， 比 较 结 果 二 、 常 见 问 题 及 处 理 措 施灵 敏 度

18、低 ， 限 度 溶 液 不 出 峰 （ 源 于 检 测 器 或方 法 ）分 离 度 不 好 ； 样 品 出 峰 并 与 溶 剂 峰 不 能 达 到基 线 分 离 ； 图 谱 基 线 不 好 杂 峰 多 （ 柱 温 、 色谱 柱 或 进 样 方 式 ）溶 媒 不 合 适供 试 品 配 制 方 法 不 当较 大 未 知 峰 应 进 行 归 属复 核 结 果 不 合 格 方 法 评 价 一 、 首 先 关 注 待 测 溶 剂 有 哪 些 ？是 否 有 下 述 三 类 溶 剂 ：卤 代 烃 （ 三 氯 甲 烷 、 四 氯 化 碳 ）氮 /磷 化 合 物 （ DMSO、 DMF）限 度 小 的 溶 剂

19、（ 苯 、 四 氢 呋 喃 等 限 度 小 于0.0X ）如 果 有 上 述 物 质 应 警 惕 方 法 的 灵 敏 度 是 否 能 达到 检 测 限 度 要 求 。 二 、 是 否 使 用 了 专 属 检 测 器 ？FID： 有 机 物ECD： 卤 代 烃 （ 三 氯 甲 烷 、 四 氯 化 碳 等 ）NPD： 氮 /磷 化 合 物 （ DMF、 DMSO等 ） 同 时 具 备 上 述 三 种 检 测 器 的 实 验 室 不 多 。 请 注 意下 述 三 点 ： 四 氯 化 碳 必 须 用 ECD！ 不 可 用 FID 填 充 柱 检 查 前 述 三 类 物 质 ， 灵 敏 度 低 使 用

20、ECD进 行 分 离 度 试 验 应 考 虑 非 卤 代 烃 ！ 三 、 溶 媒根 据 原 料 溶 解 性 ， 溶 媒 是 否 能 溶 解 样 品 ？ 水 、 DMF、 DMSO、 不 挥 发 酸 碱 溶 液 ， 不 可 使 用 盐 酸液 和 氨 水 ， 顶 空 进 样 可 选 择 在 8090 C加 热 能 溶 解样 品 的 试 剂 。其 次 溶 媒 是 否 能 溶 解 待 测 溶 剂 ？ 苯 、 甲 苯 、 三 氯 甲 烷 等 水 溶 性 不 好 的 溶 剂 ， 可 先用 少 量 乙 醇 或 甲 醇 溶 解 待 查 溶 剂 再 用 水 稀 释 。前 述 三 类 溶 剂 如 果 顶 空 进

21、样 应 选 择 K小 的 溶 媒 ！不 主 张 使 用 污 染 性 大 、 毒 性 大 的 溶 媒 ！ 四 、 供 试 品 制 备不 可 研 磨 样 品 ， 必 须 原 态 取 样不 可 超 声 、 不 能 加 热 溶 解 样 品样 品 置 顶 空 瓶 中 压 盖 后 可 以 超 声 、 加 热样 品 与 对 照 品 配 制 方 法 一 致 ， 避 免 基 质 效 应前 述 三 类 溶 剂 取 样 量 尽 可 能 大 ， 至 少 0.1g/ml 五 、 进 样 方 式进 样 方 式 首 选 顶 空 ， 基 线 干 净卤 代 烃 直 接 进 样 容 易 灭 火 六 、 限 度ICH限 度 并 不 是 最 高 要 求建 议 三 类 溶 剂 根 据 实 际 情 况 尽 量 提 高 限 度总 量 应 控 制 七、方法验证方 法 的 线 性 范 围 主 要 由 检 测 器 的 特 性决 定检 测 限 由 检 测 器 、 方 法 决 定回 收 率 加 样 回 收 率 重 复 性 和 重 现 性 前 者 容 易 实 现 ， 后 者更 重 要 ， 是 方 法 验 证 必 须 考 察 的 。 请 提 宝 贵 意 见 ！