PCR常见问题分析报告及对策

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1、有用标准文档问题 2：非特异性扩增现象：条带与估量的大小不全都或者非特异性扩增带缘由：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高PCR 常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题 1：无扩增产物现象：正比照有条带，而样品则无缘由:1. 模板:含有抑制物，含量低2. Buffer 对样品不适宜3. 引物设计不当或者发生降解4. 反响条件：退火温度太高，延长时间太短对策:1. 纯化模板或者使用试剂盒提取模板 DNA 或加大模板的用量2. 更换 Buffer 或调整浓度3. 重设计引物避开链间二聚体和链内二级构造或者换一管引物4. 降低退火温度、延长延长时间3. 酶量过多4. Mg

2、2+浓度偏高5. 退火温度偏低现象：产物在凝胶上呈 Smear 状态。缘由：1.模板不纯2.Buffer 不适宜3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2浓+度偏高6. 循环次数过多对策：1. 重设计引物或者使用巢式 PCR2. 适当降低模板或引物浓度3. 适当削减酶量4. 降低镁离子浓度5. 适当提高退火温度或使用二阶段温度法6. 削减循环次数问题 3：拖尾6.循环次数过多对策：1. 纯化模板2. 更换 Buffer3. 适当提高退火温度4. 适量用酶5. 适当降低 dNTP 和镁离子的浓度6. 削减循环次数问题 4：假阳性现象：空白比照消灭目的扩增产物缘由：靶序列或扩增产物的交*污

3、染对策：1. 操作时应留神轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2. 除酶及不能耐高温的物质外，全部试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3. 各种试剂最好先进展分装，然后低温贮存PCR 产物的电泳检测时间一般为 48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48h 后带型不规章甚致消逝。假阴性，不消灭扩增条带PCR 反响的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR 循环条件。查找缘由亦应针对上述环节进展分析争论。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq 酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丧失过

4、多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不消灭扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜任凭更改。酶失活：需更换酶，或旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需留意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR 失败或扩增条带不 抱负、简洁弥散的常见缘由。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看OD 值，更要留意引物原液做琼脂糖凝胶电

5、泳，确定要有 引物条带消灭，而且两引物带的亮度应大体全都，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止屡次冻融 或长期放冰箱冷藏局部，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特 异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。反响体积的转变：通常进展PCR 扩增承受的体积为 20ul、30ul、50ul。或

6、 100ul，应用多 大体积进展 PCR 扩增，是依据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后，再做大体积时，确定要模索条件，否则简洁失败。物理缘由：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延长温度，这也是 PCR 失败的缘由之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成

7、功的。假阳性消灭的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带全都，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不适宜：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进展PCR 扩增 时，扩增出的PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，简洁消灭假阳 性。需重设计引物。靶序列或扩增产物的穿插污染：这种污染有两种缘由：一是整个基因组或大片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应留神轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，全部试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本 前，反响管和试剂用紫外线照耀，以破坏存在的

8、核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有确定的同源性。可相互拼接，与引物互补后，可扩 增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消退。消灭非特异性扩增带PCR 扩增后消灭的条带与估量的大小不全都，或大或小，或者同时消灭特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的消灭，其缘由：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR 循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易消灭非特异条带而另一来源的酶 则不消灭，酶量过多有时也会消灭非特异性扩增。其对策有：必要时重设计引 物。减低酶

9、量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，削减循环次 数。适当提高退火温度或承受二温度点法(93变性，65左右退火与延长)。消灭片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时消灭涂抹带或片状带或地毯样带。其缘由往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP 浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：削减酶量，或调换另一来源的酶。削减 dNTP 的浓度。适当降低 Mg2+浓 度。增加模板量，削减循环次数。克隆 PCR 产物的最优条件是什么？最正确插入片段：载体比需试验确定。1：1插入片段：载体常为最正确比，摩尔数比 1：8 或 8：1 也行。应测定比值范围。连接用 5ul 2X

10、连接液, 50ng 质粒 DNA,1Weiss 单位的 T4 连接酶，插入片段共 10ul。室温保温 1 小时，或 4oC 过夜。在这 2 种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温 1 小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需 4oC 过夜。PCR 产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积存了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。假设没有回收到目的片段，还需要作什么比照试验？ A涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，说明氨苄失效，或

11、污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。 B转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul 质粒 1:100 稀释,1ul 用于 100ul 感受态细胞转化。用SOC 稀释到 1000ul 后，用 100ul铺板。培育过夜，产生1000 个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板 DNA 的总量。铺板DNA 的总量是转化反响所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用 SOC 稀释到 1000u 后含 10 ng DNA，用 1/10 铺板，共用 1 ng DNA。转化率为：1000 克隆 X103 次方 ng /铺板 1 ng DNA ug=106 次方c

12、fu/ ug 转化 pGEM-T 应用 108 次方cfu/ ug 感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。C） 如用 pGEM-T 正比照，或 PCR 产物，产生20-40 蓝斑用指定步骤 108 次方cfu/ ug 感受态细胞，说明载体失去 T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA 连接酶M1801，M1804，M1794质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的 T4 DNA 连接酶替换。D） 用 pGEM-T 或 pGEM-T Easy 载体，连接 pGEM-T 正比照，转化高频率感受态细胞108 次方cfu/ug,依据指定的试验步骤，可得 100 个菌落，其中 60%

13、 应为白斑，如产生20-40 蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。比照试验结果好，却没有回收到目的片段，试验出了什么问题？ A连接用室温保温 1 小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需 4oC 过夜。B） 插入片段带有污染，使 3-T 缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T 正比照混合，再连接。如降低了比照的菌落数，插入片段需纯化，或重制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使 pGEM-T 或 pGEM-T Easy 载体 3-T 缺失。C） 插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受 UV 过度照耀，时有发生。UV 过度照耀会产生嘧啶二聚体，不利于连接，D

14、NA 必需重纯化。D带有修复功能的耐热 DNA 聚合酶的扩增产物末端无A，后者是 pGEM-T 或 pGEM-T Easy 载体克隆所需。加 Taq DNA 聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy 载体技术资料TM042。E高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如觉察插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如 SURE 细胞PCR 疑难解答当 PCR 结果不甚满足时，首先检查以下几方面并遵照执行： 将 PCR 反响的试管与反响板紧贴。当酶反响混合物以 70“热启动”开头循环时，切记在参与酶后略微振荡一下，由于在 0.2-ml 的 P

15、CR 管中不能均匀传热。不要任凭削减 dNTP 的用量，它是一个系统的因素，必需与其它成份保持平衡。对于有问题的 PCR 反响，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq 酶前的体系进展预变性，后加模板进展正常PCR 扩增。没有扩增产物：在供给 MgCl2 缓冲液中，以 0.25mmol/L 为梯度增加MgCl2 浓度；无 MgCl2 的缓冲液以 0.5 mmol/L 为梯度增加 MgCl2 浓度。泳道中消灭模糊条带，假设 DNA 模板中存在 RNA，则按上述提示浓度补加 MgCl2，由于在 PCR 反响中可能缺少游离的 Mg2+。检查退火温度和变性条件，假设有需要的话，可降低退火温

16、度。检查模板和引物的用量。增加循环次数和/或模板 DNA 的用量。泳道中消灭模糊条带：削减循环次数或模板 DNA 的用量。提高退火温度，但不要超过 68。重设计引物或设计更长的引物。其他值得留意的条件：建议使用 0.2-ml 薄壁管。厚壁管在 92时不能有效地使模板变性。最正确反响体积为 50ml，推举用 30ml 矿物油掩盖对盖子加热的PCR 仪可以不加。大多数反响中，0.75ml0.51ml的酶量在大多数状况下可以得到满足的结果。建议使用 1.75mmol/L MgCl2350mmol/L dNTP 或 2.25mmol/L MgCl2500mmol/L dNTP 组合的混合物。然而要得到

17、最正确结果，优化Mg2+的浓度是必需的。基因组DNA 模板的质量显著影响PCR 反响。因此推举使用琼脂糖凝胶电泳来检测 DNA 的长度。DNA 片段长度可以超过 50kb，传统的基因组 DNA 能扩增片段至 10kb。要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的 DNA。请查阅高分子量 DNA 提取操作过程相关文献。降低二级构造和引物二聚物形成的可能性。进展长片段 PCR 扩增时，引物长度一般为 2434 个核苷酸，溶点在 6068间。使用这类引物可提高 PCR 反响的退 火温度来增加反响的特异性。这点格外重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。变性：第一步变性在 94下进展 2

18、 分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间94下进展 20-30 秒，除非模板中富含 GC，则 95下变性 30 秒。这可以防止 DNA 脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA 片段终长度超过 12 kb 时，应当尽可能的降低变性温度。延长：68-72下进展延长操作。循环延长：尽量承受循环延长的条件，假设 PCR 仪无此功能，则必需增加延长的时间，例如在扩增 10kb 片断时，延长时间用 10 分钟替代原来的 8 分钟。长片断 PCR 系统扩增的片断其 3-末端带有一个突出的A，因此建议承受 T/A 克隆。假设要进展平端可隆，可用Klenow 酶和 T4 DNA 多聚酶将PCR 产物补平后再进

19、展。测序时因酶的混合物带有 35外切酶活性，用 Sanger 方法进展测序不能产生均一的染色体带型。引物设计：一般长度 20-30bp； 至少 50%的 GC 含量；避开引物二聚体和二级构造；引物对的 Tm 值应当接近。也可以以下图示提示找到解决问题的突破口：PCR 试验操作程序1. 在无菌的 0.5ml 或 0.2ml 离心管中按以下操作程序加样：反响物 加样挨次 体积(l) 终浓度去离子水 1 29.410Buffer B 2 5 14dNTP 混合物 3 5 各 200mol/LMgCl24 3 1.5mmol/L有义引物 5 2.6 0.25mol/L反义引物 6 2.6 0.25mo

20、l/L模板 7 2 0.1gTaqDNA 聚合酶 8 0.4 1unit2. 用微量可调加样器和一次性 Tip 向每一管中加 50l 矿物油。每加一管换一次 Tip。3. 振荡每只管，然后短暂离心。4. 将管放到预热的热循环中，按以下程序开头循环： 预变性 94 4 分钟 1 次变性 94 1 分钟退火 37-65 1 分钟延长 72 1 分钟循环 30 次终延长 72 7 分钟 1 次保存 45. 将 PCR 产物进展琼脂糖凝胶电泳，分析结果。电泳条件：60-80V,15-20 分钟。6. 紫外检查电泳结果。四、争论1. 假阴性，不消灭扩增条带PCR 反响的关键环节有模板核酸的制备，引物的质

21、量与特异性，酶的质量，PCR 循环条件。查找缘由亦应针对上述环节进展分析争论。模板：模板中含有 Taq 酶抑制剂，在提取制备模板时丧失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不消灭扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性比照的 DNA 模板协作检查模板质量。酶失活：需更换酶，或旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不抱负、简洁弥散的常见缘由。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的

22、浓度不仅要看OD 值，更要留意引物原液做琼脂糖凝胶电泳，确定要有引物条带消灭，而且两引物带的亮度应大体全都，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止屡次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。反响体积的转变：通常进展 PCR 扩增承受的体

23、积为 20ul、30ul、50ul、或 100ul，应用多大体积进展PCR 扩增，是依据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后，再做大体积时，确定要模索条件，否则简洁失败。物理缘由：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能消灭假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率， 退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延长温度，这也是 PCR 失败的缘由之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互

24、补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。2. 假阳性消灭的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带全都，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不适宜：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进展 PCR 扩增 时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短， 简洁消灭假阳性。需重设计引物。靶序列或扩增产物的穿插污染：这种污染有两种缘由：一是整个基因组或大片段的穿插污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应留神轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，全部试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反响

25、管和试剂用紫外线照耀，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有确定的同源性。可相互拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR 方法来减轻或消退。3. 消灭非特异性扩增带PCR 扩增后消灭的条带与估量的大小不全都，或大或小，或者同时消灭特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的消灭，其缘由：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR 循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易消灭非特异条带而另一来源的酶则不消灭，酶量过多有时也会消灭非特异性扩增。其对策有：

26、必要时重设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，削减循环次数。适当提高退火温度或承受二温度点法(93变性，65左右退火与延长)。4.消灭片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时消灭涂抹带或片状带或地毯样带。其缘由往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP 浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：削减酶量，或调换另一来源的酶。削减 dNTP 的浓度。适当降低 Mg2+浓度。增加模板量，削减循环次数。PCR 常见问题的精辟总结-耶鲁大学Troubleshooting for PCR and multiplex PCRCOMPONENTVOLUMEFIN

27、AL CONCENTRATION1.autoclaved ultra-filtered water (pH 7.0)20.7 L-Troubleshooting discussion is based on the PCR protocol as described in the table below. All reactions are run for 30 cycles.2.10x PCR Buffer*2.5 L1x3.dNTPs mix (25 mM each nucleotide)0.2 L200 M (each nucleotide)4.primer mix (25 pmoles

28、/ L each primer)0.4 L0.4 M (each primer)5.Taq DNA polymerase (native enzyme)0.2 L1 Unit/25 L6.genomic DNA template (100 ng/ L)1.0 L100 ng/25 L* The 10x PCR buffer contains: 500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl (pH 8.3); 15 mM MgCl(the final concentrations of these ingredients in the PCR mix2are: 50 mM KCl; 1

29、0 mM Tris-HCl; 1.5 mM MgCl2).QUESTIONSSOLUTIONS1. I get (many) longer unspecificDecrease annealing time products. What can I do?Increase annealing temperatureDecrease extension timeDecrease extension temperature to 62-68 CIncrease KCl (buffer) concentration to 1.2x-2x, but keep MgCl2 concentration a

30、t 1.5-2mM.Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant.Take less primerTake less DNA template Take less Taq polymeraseIf none of the above works: check the primer for repetitive sequences (BLAST align the sequence with the databases) and change the primer(s)Combin

31、e some/all of the above2. I get (many) shorter unspecificIncrease annealing temperature products. What can I do?Increase annealing timeIncrease extension timeIncrease extension temperature to 74-78 CDecrease KCl (buffer) concentration to 0.7-0.8x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mMIncrease MgCl

32、2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constantTake less primerTake less DNA template Take less Taq polymeraseIf none of the above works: check the primer for repetitive sequences (BLAST align the sequence with the databases) and change the primer(s)Combine some/all of the above3

33、. Reaction was working before, Make sure all PCR ingredients are taken in the reaction (buffer, but now I can”t get any product.template, Taq, etc)Change the dNTP solution (very sensitive to cycles of thawing and freezing, especially in multiplex PCR)If you just bought new primers, check for their r

34、eliability (bad primer synthesis ?)Increase primer amount Increase template amountDecrease annealing temperature by 6-10 C and check if you get any product. If you don”t, check all your PCR ingredients. If you do get products (including unspecific ones) reaction conditions as described above.Combine

35、 some/all of the above4. My PCR product is weak. Is thereGradually decrease the annealing temperature to the lowest possible. a way to increase the yield?Increase the amount of PCR primerIncrease the amount of DNA template Increase the amount of Taq polymeraseChange buffer (KCl) concentration (highe

36、r ifproduct is lower than 1000bp or lower if product is higher than 1000bp)Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 g/ L final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerol.Check primer sequences for mismatches and/or increase the primer length by 5 nucleotidesCombi

37、ne some/all of the above5. My two primers have veryAn easy solution is to increase the length of the primer with low different melting temperatures Tm. If you need to keep the size of the product constant, add a few (Tm) but I cannot change their bases at the 3” end. If size is not a concern, add a

38、few bases at locus. What can I do to improve PCReither the 3” or the 5” end of that primer.amplification?6. I have a number of primer pairsVery likely, yes.I would like to use together. CanTry amplify all loci seaprately using the same PCR program. If one I run a multiplex PCR with them?.of the prim

39、er pairs yields unspecific products, keep the cycling How?conditions constant and change other parameters as mentioned above(#1 and #2).Mix equimolar amounts of primers and run the multiplex reaction either in the same cycling conditions or by decreasing only the annealing temperature by 4 C.If some

40、 of the loci are weak or not amplified, read below !7. How many loci can I amplify inDifficult to say. The author has routinely amplified from 2 to 14 multiplex PCR at the same time? loci.Literature describes up to 25 loci or so.8. One or a few loci in my multiplexThe first choice should be increasi

41、ng the amount of primer for the reaction are very weak or“weak“ loci at the same time with decreasing the amount of primer invisible. How can amplify them?for all loci that can be amplified. The balance between these amountsis more important than the absolute values used !.Check primer sequences for

42、 primer-primer interactions9. Short PCR products in myIncrease KCl (buffer) concentration to 1.2x-2x, but keep MgCl2 multiplex reaction are weak. Howconcentration at 1.5-2mMcan I improve their yield?Decrease denaturing timeDecrease annealing time and temperature Decrease extension time and temperatu

43、reIncrease amount of primers for the “weak“ loci while decreasing the amount for the “strong“ loci.Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 g/ L final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerolCombine some/all of the above10. Longer PCR products in myDecrease KCl

44、 (buffer) concentration to 0.7-0.8x, but keep MgCl2 multiplex reaction are weak. Howconcentration at 1.5-2mMcan I improve their yield?Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant.Increase denaturing time Increase annealing time Decrease annealing temperatureIncrea

45、se extension time and temperatureIncrease amount of primers for the “weak“ loci while decreasing the amount for the “strong“ lociAdd adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 g/ L final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerolCombine some/all of the above11. All pro

46、ducts in my multiplexDecrease annealing time in small steps (2 C) reaction are weak. How can IDecrease extension temperature to 62-68 C improve the yield?Increase extension timeIncrease template concentration Increase overall primer concentration Adjust Taq polymerase concentrationChange KCl (buffer

47、) concentration, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mMIncrease MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant.Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 g/ L final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerolCombine some/all of the above12.

48、 Unspecific products appear inIf long: increase buffer concentration to 1.2-2x, but keep MgCl2 my multiplex reaction. Can I getconcentration at 1.5-2mMrid of them somehow?If short: decrease buffer concentration to 0.7-0.9x, but keep MgCl2concentration at 1.5-2mMGradually increase the annealing tempe

49、rature Decrease amount of templateDecrease amount of primer Decrease amount of enzymeIncrease MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constantAdd adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 g/ L final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSOor glycerolIf no

50、thing works: run PCR reactions for each (multiplexed) locus individually, using an annealing temperature lower than usual. Compare the unspecific products for each locus tested with the unspecific products seen when running the multiplex PCR. This may indicate which primer pair yields the unspecific products in the multiplex reaction.Combine some/all of the above(Note: primer-primer interactions in multiplex PCR are usually translated into lack of some amplification products rather than the appearance of unspecific products)