膀胱替代和组织工程(专家论坛-修改版)

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1、作者简介：曾晓勇，副主任医师，美国泌尿外科学会会员、欧洲泌尿外科学会会员。中国组织工程研究与临床康复、现代泌尿生殖肿瘤等杂志编委。2004-2006年在美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）Clark泌尿外科中心做博士后研究。主要从事泌尿道的组织工程重建的基础和临床研究。主持或参与多项国家自然科学基金和省部级课题，在中外学术期刊发表论文40余篇。此外在膀胱肿瘤、前列腺炎等领域也有较深入的研究。 1 基金项目：国家自然科学基金（30700171）;华中科技大学医工、医理交叉基金（2006）通讯作者 杨为民（wmyang）膀胱替代的组织工程策略 曾晓勇1 杨为民1摘要 组织工程学是应用细胞生物学和生物

2、材料学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物的一门新兴科学。近年来，组织工程学的蓬勃发展为膀胱替代提供了崭新的思路。尤其进入21世纪以来，随着干细胞研究的深入和新的生物材料不断出现，使应用组织工程技术再造的新膀胱从实验室走向临床成为可能。本文就组织工程膀胱替代的基础研究和临床应用的发展和现状进行了概述。关键词 膀胱替代 组织工程Tissue engineering- approaches of bladder replacement Zeng Xiaoyong, Yang Weimin（1Department of Urology, Tongji Hosp

3、ital ,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,430030,China）Abstract Tissue engineering (TE) is an emerging multidisciplinary field involving cell biology, medicine, biomaterials that is to restoring, maintaining, or enhancing tissue and organ function. The prosper

4、ous advancement of TE in recent decades provided a new approach to bladder replacement. In the 21st century, particularly, it will be a great possibility that regenerating a neo-bladder via TE-approach transforms from bench to clinic, with booming researches of stem cells and new biomaterials. The b

5、asic research and clinical development regarding bladder replacement via TE are summarized in this article.Keyword: bladder replacement ; tissue engineering临床上利用胃肠道行膀胱替代至今已有100多年的历史。除空肠外，从胃到直肠的消化道各段均被人们尝试用于新膀胱或尿流输出道的构建。然而由于胃肠粘膜分泌与吸收等难以克服的因素引起的并发症如肠粘液分泌、电解质紊乱、结石形成等等，始终困扰着这项古老的膀胱替代技术。近年来，组织工程学(Tissue

6、Engineering)的兴起为膀胱替代提供了一种新的思路。组织工程一词最早是由美国国家科学基金委员会于1987年正式提出和确定的。它是应用细胞生物学和工程材料学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物的一门科学1。上个世纪后叶，组织工程学的诞生和迅速发展被誉为现代医学继细胞生物学和分子生物学之后的第三个具有里程碑意义的重大事件, 它是一门由生命科学、材料科学和工程技术学相结合交叉的边缘学科。其基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种具有优良细胞相容性并可以被机体降解吸收的生物材料上面形成复合物，然后将细胞生物材料复合物植入人体组织、器官的病损

7、部位，在作为细胞生长支架的生物材料逐渐被机体降解吸收的同时，细胞不断增殖、分化，形成新的并且其形态、功能方面与相应组织、器官一致的组织，从而达到修复创伤和重建功能的目的。它是继细胞生物学和分子生物学之后，生命科学领域又一新的发展里程碑，标志着传统医学将走出器官移植的范畴，步入制造组织和器官的新时代, 从而着眼从根本上解决组织和器官病损或缺损所致的功能障碍或因此引起的器官移植所具有的免疫排斥、供体器官缺乏等诸多问题。组织工程学技术方面的研究主要集中在以下三个方面: 细胞生长调节因子：寻找并提取组织分泌产生的生化物质, 这些由组织分泌或产生的生化物质(如生长因子、细胞活素、抗体类物质) 来源于有活

8、性的细胞, 将提取的此类生化物质或某些功能蛋白质成份种植在适当的基质中, 使机体损失的某些组织及功能成功的得到修复或恢复；种子细胞：分离功能细胞制成代用品, 机体内接种一群结构相似, 功能相关的细胞, 以代替缺失组织和器官的某些特定功能；细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM ) 及可降级的细胞支架材料的研究。组织工程的研究几乎涵盖各个机体重要的组织器官，如骨、软骨、骨骼肌、平滑肌、肌腱、心脏瓣膜、血管、角膜、皮肤等等2-4。泌尿道（尿道、膀胱、输尿管）的重建也是组织工程较多涉及的领域之一3,5。组织工程的膀胱替代的研究由来已久，早在1917年neuboff 就应用筋膜

9、行狗的膀胱扩大术实验，而真正意义的膀胱的组织工程重建只是近10余年的事情。总结近年的研究成果，膀胱组织工程重建的基本策略主要有以下几个：1. 复合肠代膀胱术复合肠代膀胱术（Composite enterocystoplasty）是对传统的肠代膀胱术的改良，其主要设计思路是在体外培养扩增正常的人尿路上皮细胞（normal human urothelial, HNU ）,并种植在可降解的膜状细胞支架上，然后将HNU和膜的复合体移植于准备行膀胱替代的去粘膜肠管的内层，构建覆有尿路上皮的肠管以行膀胱替代术。作为种子细胞的HNU可来源于自体、同种异体或异种组织，以自体组织为首选6。传统上认为尿路上皮细胞

10、普遍存在培养老化问题，因而难以在体内长久保持增殖活力和功能。Scriven 等研制的角化细胞无血清培养基初步解决了这个问题，采用他的方法可运用1 cm2 活检的尿路上皮标本，8周内获得可覆盖4202 m2 面积的细胞量7。Sugasi 等进一步发现体外培养的上皮细胞具有和天然上皮同样的尿液屏障作用，适合组织工程新膀胱的要求8。Scriven 等设计了薇荞网（Vicryl mesh,Vicryl 为临床常用的可吸收缝线的材料），用以作为承载、移植HNU的细胞支架9。Fraser 最近应用这种方法将体外扩增的HNU移植到去粘膜和去管化的的狗的子宫，以此行膀胱扩大术，结果显示，在术后3个月，与对照组

11、相比，新膀胱具有较好的顺应性和较大的容量。组织学检查也显示新膀胱内面有光滑的尿路上皮生长。但也存在的较明显的问题：有的区域未见尿路上皮生长；由于不完全的去粘膜化，有的区域仍有子宫粘膜生长。这提示未来的研究仍是尿路上皮粘膜在异源器官的生存问题10。2. 无细胞的材料替代用天然或人工合成的生物材料直接行膀胱替代是膀胱组织工程替代的一种较早期的探索，所用的生物材料一般分为两种：天然材料和人工合成材料。对这些材料理论上基本的要求是惰性材料、较好的生物相容性、无免疫源性和适当的柔韧性。2.1 天然材料各种自体的、同源的、同种异源的天然材料曾用于膀胱替代的实验研究，包括皮肤、残余膀胱、大网膜、腹膜、冻干脑

12、脊膜、心包膜、戊二醛处理过的羊膜等等。大多的动物实验显示，这些材料普遍存在免疫排斥、结石形成、移植物皱缩、尿瘘等，此外，受体的残余的膀胱组织细胞也很难长入这些材料。胶原属于细胞外基质的固有充分，经预先脱细胞和交联反应处理的胶原组织显示较好的柔韧性和组织相容性，理论上较符合组织工程膀胱的要求，但经过实际应用发现交联的胶原不利于宿主细胞的长入和生长，也延缓了其在体内的生物降解，这大大增加了结石形成的可能11,12。小肠粘膜下组织（small intestine submucosa，SIS）和膀胱无细胞基质（bladder acellular matrix，BAM）是两种新型的组织工程膀胱替代材料，

13、最近的研究显示两者均具有较好的生物相容性，是较有前途的膀胱替代天然材料。SIS取自猪的小肠粘膜下基质组织，经脱细胞、去免疫处理制备而成，目前已经商品化（OaSIS），SIS是一种取材于猪小肠的一种异体组织。其在制作时通过去除小肠的粘膜层、浆膜层以及肌层,从而形成一层厚0. 1 cm 的膜状组织。其中含有胶原成分以及一些促进组织再生的生长因子,因其与细胞外基质十分接近,而有利于细胞的粘附和生长,其最大优点是没有免疫原性13-15。SIS 很早开始便应用于膀胱扩大的研究。 Kropp等先后在鼠及狗的身上用SIS 补片进行了扩大膀胱术。术后在补片处的组织学上可见到正常膀胱的三层组织(上皮、肌层、浆膜

14、层) ,且与正常的膀胱组织难以区分。这提示SIS 可以作为应用于扩大膀胱术的一种材料15。与此同时，Vaught等的研究结果也显示应用SIS重建的新膀胱有以下特点: 有收缩能力; 在组织上可见胆碱能、嘌呤原、- 肾上腺素能受体; 再生组织受胆碱能、嘌呤原神经支配。这些特点与正常组织相似,从而进一步支持用SIS 作为扩大膀胱材料的理论。在初步实验获得成功后,Badylak 对SIS 促进组织重生的速率及其过程进行了实验,提示SIS 作为膀胱扩大的材料不仅促进组织快速重生,而且有非常快的降解速率,这样避免了在其降解之前发生严重的急、慢性炎症反应。此外,与传统肠段进行膀胱扩大的比较两者在短期内效果相

15、近,但长期前者明显优于后者。BAM来源于猪的膀胱组织，是经处理的脱细胞的膀胱粘膜下基质组织，与SIS相比，更适合作为膀胱替代的材料，经大量实验研究具有以下特点：具有良好的细胞相容性，适合作为多种“种子细胞”的支架，支持细胞的粘附、生长与增殖；BAM移植物组织反应较小，很少发生组织皱缩、变型，不会形成严重的结缔组织包裹；BAM 移植物具有良好的柔韧性，能耐受一定的张力，适合膀胱作为储尿容器的特点；BAM 来源较广泛，制备简单，适合临床的需求。动物来源的材料有潜在的传播病原体的危险。Klaus 等对最常用的猪源性BAM移植物进行了关于猪内生性逆转录病毒（PERV）是否可以跨物种传播的研究。他们将猪

16、源性BAM移植到羊体内，采用PCR、RT-PCR、免疫组织化学、电镜以及DNA序列测定等方法，检测PERV在羊体内和BAM移植中基因和抗原蛋白的表达，结果未发现PERV。这说明经过化学脱细胞处理的猪BAM移植物可有效阻止异源病毒的跨物种传播，在人类使用是安全的17。2.2 人工合成材料人工合成的高分子可降解的生物材料也可作为一种膀胱替代材料。常用于组织工程的聚合物材料有聚乳酸（poly-L-lactic acid, PLA）,聚羟基乙酸（poly- glycolic acid, PGA, 聚已内酯（poly(epsilon-caprolatone), PCL）以及它们之间的共聚物等。这些人工合

17、成的高分子聚合物都是常用的组织工程材料，具有高度的生物相容性和生物降解能力，有的已通过美国食品与药物管理局认证，可用于医用生物材料入外科缝线等。单独应用这些材料进行膀胱替代的研究较少，它们一般和细胞结合，作为细胞的基质支架支持细胞的膀胱重建作用。与天然材料相比，其生物相容性较差，其相对优势在于可根据实际需要以较简单的方法改变或修饰材料的理化性能，调控其降解时间和机械性能。3. 结合细胞的“功能性”材料人们曾期待无细胞的的材料能诱导移植受体的细胞长入材料，随着材料的逐步降解以形成以移植受体细胞为主的组织替代，而作为膀胱壁的主要成分平滑肌细胞自然的生长极为缓慢，所以这种设计思路在膀胱替代是很难实现

18、的。目前人们逐渐转向在另外一种“种子细胞”+“细胞支架（细胞外基质）”的组织工程策略，即在体外分离、扩增种子细胞（自体平滑肌细胞、干细胞、尿路上皮细胞等），并将其种植在天然的或人工合成的细胞支架之上小肠复合体，然后再将细胞-材料的复合体植入缺损处的组织和器官。人们把这种结合功能性细胞的材料形象地称为“活”的材料。1995年Atala用PLA 作为动物体外膀胱移行上皮细胞的生长支架, 并将体外培养的细胞- PLA 活性复合物移植于异种动物的膀胱缺损区获得成功, 其用PLA 制成人工细胞支架, 从实验兔的膀胱中提取移行上皮细胞, 经过胶原酶及其它化学试剂处理后, 此细胞种植于人工细胞 支架上, 再

19、将细胞- PLA 复合物置于生长液中培养4 天后, 移植于异种动物鼠的膀胱缺损区, 观察到60 天内兔的膀胱移行上皮仍然存活, 随时间延长, PLA 支架逐步降解吸收而为鼠自体膀胱的移行上皮及平滑肌细胞取代, 从而证明; PLA支架除起着支持兔的膀胱移行上皮生长外, 还能对鼠的自体膀胱细胞再生修复起着框架作用。1997 年, 美国波士顿儿童医院已用这一方法成功的为10 只羊羔植入了新膀胱, 并计划在不远的将来, 将一个从胎儿细胞中培养出来的膀胱植入人体18。在应用天然材料作为细胞支架进行膀胱再生方面，目前也取得了一定的进展。Yoo 等曾应用取自狗膀胱的平滑肌细胞和尿路上皮细胞作为种子细胞，以异

20、体狗的BAM作为细胞支架构建组织工程膀胱，结果显示术后12个月后，膀胱容量可恢复到术前的99%，以后在积累一定的实验基础之后，他们用这种方法进行了早期的临床实验。他们对7例患有脑脊膜膨出合并有低张、高压的神经源膀胱的患者取膀胱活检，或其平滑肌细胞和膀胱上皮细胞进行体外培养和扩增，然后将其种植于BAM，形成细胞BAM的复合体，体外培养3-4 d, 将其植入体内行膀胱扩大，术后平均随访近4年，膀胱功能较以前均有不同程度的改善，未发现有酸碱失衡、代谢紊乱、结石形成等并发症20。这一研究成果被著名的美国泌尿外科专家Chung 誉为具有里程碑意义的进展。以后Brown等也曾单独应用BAM 进行膀胱替代，

21、膀胱在术后22周基本恢复正常容量。他们将自体的平滑肌细胞和尿路上皮细胞种植于BAM 进行膀胱替代，发现移植的细胞可向基质深层生长，并伴有明胶酶活性的增强，他们认为BAM 内可能含有重要的诱导因子刺激移植细胞的粘附和增殖，并能促进平滑肌细胞与尿路上皮细胞之间的信号传导和相互作用21。4. 新的组织工程材料与种子细胞近来，越来越多的研究已显示纳米级纤维在形态上更接近于细胞生理的纳米级微环境，功能上因其具有较大的比表面积和丰富的空隙，适合接种大量的组织工程用的细胞且有利于细胞间的营养与信号交换，此外还有细胞导向作用等优点。因而纳米纤维被认为与以往的多聚物海绵等微米级材料相比更适合组织工程的要求22。

22、美国加州大学洛杉矶分校的Rodriguez 教授的小组应用静电纺丝技术制备纳米级的PLGA（PLA和PGA的共聚体）纤维膜，然后将脂肪源的干细胞在体外分化成功能性的平滑肌细胞后种植其上，修复兔模型的膀胱缺损，术后12周后，随者PLGA的降解，缺损处由移植的平滑肌细胞替代，并具有一定的方向性，膀胱的容量也恢复到术前的80%。结果提示纳米级的细胞支架能较好地支持干细胞的增殖和分化。干细胞是机体内特殊的细胞群落，具有强大的自我更新和定向分化能力5，目前成为最有应用前途的组织工程“种子细胞”的来源。干细胞按其来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞2种。与胚胎干细胞相比，成体干细胞更符合实际临床组织工程应用的

23、要求。其主要特点有：可取材于自体组织，不存在免疫源性；较少的基因突变发生；取材相对方便；不存在伦理问题等等。目前各种成体干细胞已广泛应用于膀胱替代的组织工程，如骨髓干细胞（bone marrow stem cells，BMSC）、脂肪源干细胞（adipose derived stem cells, ADSC）、神经鞘干细胞(neural crest stem cells,NCSC)等等。在以上这些研究中，不乏令人兴奋的进展。Chung 近来将未分化的BMSC种植于SIS，然后将细胞-材料复合物用来修复大鼠的膀胱缺损模型，经过3个月的随访发现移植处形成3层的细胞混合体，其中包括膀胱上皮细胞和平滑

24、肌细胞，免疫组化和RT-PCR显示这些细胞表达尿路上皮标记物骨架蛋白8和19，同时也表达平滑肌标记物肌球蛋白重链（MHC）。而作为对照组的单独SIS的移植则没有这些变化，进一步的细胞示踪显示这些细胞并非来源于干细胞的跨系分化，而来源于周围正常膀胱组织细胞的长入，这提示，未分化的干细胞的移植可能刺激宿主膀胱细胞的再生和增殖23。Rodriguez 等应用ADSC在体外预分化成平滑肌细胞后，在植入大鼠的膀胱缺损，经细胞示踪研究发现大约20%的细胞可在体内保持平滑肌的分化表型，参与膀胱的功能性修复24。目前普遍认为干细胞的稳定的、高比率的定向分化仍是亟待解决的问题，也是未来膀胱组织工程的研究重点之一

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