甲胎蛋白异质体

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1、甲胎蛋白异质体甲胎蛋白异质体( Variants of AFP or molecular heterogenetic of AFP )是一种单链糖蛋白，含糖量约为4%左右。不同组织细胞合成的AFP,其糖链结构有所不同，对植 物凝集素的结合能力也不相同，此种糖链结构不同的AFP称为AFP的亚型或变异体，也称为 AFP分子异质体。近年来对AFP异质进行了电泳、糖链结构及与植物凝集素结合能力等方面 进行了深入研究。有资料表明，AFP异质体存在着分子大小和电荷量的差异。淀粉胶电泳将 人肝癌血清AFP分为4种亚型;用SDS聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳发现AFP可分为分子量72kD 和kD两种成分；等电聚焦结合

2、交叉免疫电泳可使胎儿AFP分成10种等电点不同的异质体。 这表明AFP异质体存在着电泳不无一性，这与其一级结构差异有关。其C末端结构基本相 同，N末端至少有3种不同结构，这能否产生AFP电泳异质性有待于证实。AFP结构中的糖 链主要由甘露糖、半乳糖、N 乙酰葡萄糖和唾液酸，并以寡糖单位的形式组成。AFP异质 体糖链结构的差异主要表现在分支结构的不同，刀豆素A (ConA)结合型和非结合型AFP异 质体的糖链结构模型差异表现在一个分支中有无一GLcNAc-Gal-NeuNAc结构。对人肝癌AFP 糖链结构电泳研究发现，其寡糖分为中性(N)、酸性(A1,)三种成分。进一步研究证实 N两分支末端均由

3、半乳糖组成，亠两分支末端分别为半乳糖和N 乙酰神经氨酸，则均为N 乙酰神经氨酸。卵黄囊肿瘤的AFP其ConA亲和性组占50%左右，肝癌腹水中与LCA结合 的AFP糖链中具有与Asn连接的N 乙酰基葡萄糖胺残基，而在非结合型异质体的糖链中无 此成分。根据AFP与外源性凝集素(Lectin)结合能力的差异，可分为不同的变异体。采用扁 豆凝集素(LCA) /刀豆素A亲和电泳或层析技术能将AFP分为LCA / ConA非结合型AFP (AFP N L/AFP NC)和 LCA / ConA 结合型 AFP (AFP R L/AFP RC)两种。新的 Lec tin 的应用，使AFP在糖链结构上异质体达

4、9种之多。AFP异质体的命名方法为：从阴极开始在 LCA亲和电泳上AFP的条带依次为L、L、L ；在E PHA亲和电泳上AFP的条带依次为P、1231P、P、P、P ;用 ConA 时按 AFPC、C 命名；alloA 时按 AFPA、A、A 命名。AFPL、L 完全23451212323不能分离，存在中间成分时按afpl2、l3命名，afpp4、p5分离不充分时命名为afpp4+afp P。因此，AFP对不同的Lec tin反应所表现的异质体不同，故可用于疾病的鉴别诊断。5AFP异质体亲和交叉免疫电泳检测法【原理】根据AFP对刀豆素（ConA）或小扁豆凝集素（LCA）结合能力的不同，可区别原

5、发性肝 细胞癌与非原发性肝癌引起的AFP 升高，提高AFP对肝癌的诊断价值。此法原理是将检样于 含LCA的琼脂糖凝胶中电泳，与LCA结合型AFP在电泳时被阻留，而非结合型AFP则向阳极 侧泳动。然后，与首次电泳的方向垂直，在含抗AFP的琼脂糖胶中作第二次电泳。此时被首 次电泳分离的AFP异质体，将分别于含抗AFP的凝胶板中形成沉淀峰,根据峰的大小即可了 解结合型或非结合型AFP所占的比例。【试剂】1. 小扁豆凝集素（LCA）。2. 抗AFP血清：同ELISA法。3. L琼脂糖：琼脂糖加L巴比妥缓冲液100ml,沸水浴中使溶，加入Na%使达L,按 需要量分装后密塞，4C保存。4125IAFP。【

6、试剂】1. 小扁豆凝集素（LCA）。2. 抗AFP血清：同ELISA法。3. L琼脂糖：琼脂糖加L pH巴比妥缓冲液100ml,沸水浴中使溶，加入Na%使达L, 按需要量分装后密塞，4C保存。4.125IAFP。【操作】1. 将L琼脂糖融化后，在6cmX12cm洁净玻板之一侧浇注2cmX12cm （厚）凝胶条（约 需凝胶液），凝固后于距内缘23mm处切割一X10cm的槽。2. 用巴比妥缓冲液将LCA稀释成2mg/ml （20C可保存1个月），取80|1丨加入冷至 56C的已融化琼脂糖凝胶1ml中，混匀后浇注于上述槽中。待凝固后，于此胶条上距阴极端 处打一直径的孔，距此孔处打第二个孔（第二份检样

7、）。3. 两孔内各加一份待测血清，加样量510|!丨。以L溴酚蓝为指示剂，10V/cm稳压 电泳，至白蛋白泳出4cm时关闭电源。4. 将抗AFP血清按效价与融化并冷至56C的琼脂糖胶液混合（琼脂糖最终浓度为L,抗AFP达最适浓度），并浇注玻板的其余部分（4cmX12cm）,约需含抗血清胶液，使凝固。5. 于LCA胶条下处空白凝胶内切割一 X10cm的细槽，槽内注入混有L溴酚蓝5|!丨的 125-AFP 20|1丨（约6万7万cpm）。如混入融化的L琼脂糖胶液中浇注更好。10V/cm 稳压电泳，电泳方向与第一次电泳垂直。至白蛋白泳出4cm时终止。6. 电泳结束后，用滤纸覆盖于凝胶板表面，置37C

8、干燥后，于暗室覆盖X光底片，室 温曝光48h，显影，定影后观察。【结果判断】将X光胶片置坐标纸上，以峰两侧水平线作基线，峰形下总面积（小格数）为100%， 各所占面积（小格数）与总面积的百分比即AFP异质体的百分比。AFP异质体亲和电泳免疫印迹法【原理】将含AFP的待检血清置于含LCA的琼脂糖凝胶中电泳。LCA结合型AFP泳动速度慢，而 CA非结合型AFP泳动速度快，形成前后2条区带。用吸附有抗人AFP抗体的硝酸纤维素（NC） 膜进行免疫印迹，再依次与酶标记抗人AFP抗体和酶底物反应则显色。NC膜上可呈现2条 着色区带，透明后用光密度计扫描，得出结合型与非结合型AFP所占百分比。【试剂】1.

9、小扁豆凝集素（LCA）。2. 马抗人AFP抗体。3 .兔抗人 AFP-HRP。4. 结合马抗人AFP抗体的硝酸纤维素膜（简称马抗人AFP-NC膜）；将NC膜剪裁成与 凝胶板相同大小，浸于最适稀释浓度的马抗人AFP抗体溶液中，5mi n后取出，电吹风吹干, 4C保存，4周内稳定。5洗涤液：150mmol/L NaCl 溶液，含 Tween-20。操作】1用25mmol/L Tris-巴比妥缓冲液（pH ）配制10g/L琼脂糖凝胶（内含LLCA）,浇 注玻板。凝胶厚度为，长8cm,宽度视标本数而定，一般为1cm宽/每份标本。在负极侧处, 切一条7mm长、1mm宽的加样槽，槽内加待检血清4|1丨。电

10、压15V/ cm，电泳45min。电泳 毕,取下琼脂糖凝胶板。2. 将马抗人AFP-NC膜先用蒸馏水浸湿，仔细地覆盖于琼脂凝胶板上，再在NC膜上加 数层滤纸，上面置10g/cm2的重物。约经30min,凝胶板上AFP电泳区带即转印至NC膜上。3. 将免疫印迹的NC膜浸入用20g/L牛白蛋白溶液最佳稀释的兔抗人AFP-HRP溶液中， 37C，经1h后取出。NC膜用洗涤液洗3次。最后将NC膜浸入酶底物溶液（DAB + Hf2）中， 待显现出二条棕黄色区带后,用蒸馏水冲洗数次,终止反应。4. 在阴极侧的区带为LCA结合型AFP；阳极侧的区带为LCA非结合型AFP, NC膜在空 气中干燥后，用十氢萘透

11、明，用光密度计在波长490nm扫描，打印出二条区带的百分数。【参考值】阴性【临床意义】1. AFP是一种糖蛋白，其寡糖链有多样性，AFPV与植物血凝素中的小扁豆以集素（Lens culinaris agglutinin, LCA）亲和力不同，而分为LCA亲和的（LCAR）和与LCA非亲和（LCA-N）的两部分，原发性肝癌的AFP糖链中存有异质体。2. AFPV检测能鉴别良恶性肝病，如LCRRM25%者多数（80%以上）为原发性肝癌。 LCAN高者为良性肝病，如急慢性肝炎，肝硬化等。3. 对病程预后的判断：如肝癌切除后，AFPV随AFP转阴而消失，若AFP未转正常， 但甲胎异质体含量明显下降的患者复发的危险性少，而AFP含量下降，AFPV含量相对恒定 者,则术后容易复发。