外源基因的原核表达

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1、2021年 1月 26日星期二 1 2021年 1月 26日星期二 2 外源基因表达的作用： 外源基因表达泛指 目的基因与表达载体重组后，导入合适的 受体细胞，并能在其中有效表达，产生目 的基因产物。外源基因的表达是研究和探 索基因功能、基因表达调控机制、编码蛋 白质的结构与功能的重要方法，也是制备 和生产新型蛋白质药物、诊断试剂必不可 少的手段。通过外源基因的表达可由宿主 细胞产生大量的目的蛋白。 2021年 1月 26日星期二 3 常用的原核外源表达系统 大肠杆菌表达系统 芽孢杆菌表达系统 链霉菌表达系统 蓝藻表达系统 2021年 1月 26日星期二 4 原核生物基因表达系统的特点： 1、

2、原核生物大多数为单细胞异养， 生长快，代谢易于控制，可通过发 酵迅速获得大量基因表达产物。 2、基因组结构简单，便于基因操作 和分析。 3、多数原核生物细胞内含有质粒或 噬菌体，便于构建相应的表达载体。 2021年 1月 26日星期二 5 原核生物基因表达系统的特点： 4、不具备真核生物的蛋白质加工系 统，表达产物无特定的空间构象。 5、内源蛋白酶会降解表达的外源蛋 白，造成表达产物的不稳定。 由于以上特点，近年来真核生物表 达系统发展很快，并构建了相应的 基因表达载体。 2021年 1月 26日星期二 6 大肠杆菌表达系统 大肠杆菌表达系统是基因表达技术 中发展最早，目前应用最为广泛的 经典

3、表达系统。属革兰氏阴性细菌。 其特点是： 遗传背景清楚 目的基因表达水平高 培养时间短 2021年 1月 26日星期二 7 大肠杆菌表达系统的主要不足 1、缺少真核生物的蛋白质翻译后修饰 和加工过程。 2、表达的蛋白质多以包含体形式存在， 需经复性才能恢复构象与活性 3、宿主本身杂蛋白质多，纯化步骤复 杂。 2021年 1月 26日星期二 8 大肠杆菌基因表达载体 理想的大肠杆菌表达载体的特征 1、稳定的遗传和复制能力，在无选 择压力下保存于大肠杆菌细胞内 2、具有显性的转化筛选标记 3、转录可以调控，抑制时本底转录 水平较低 4、转录的 mRNA能够在适当的位臵 终止且转录不影响载体的复制

4、5、具备适用于外源基因插入酶切位 点 2021年 1月 26日星期二 9 大肠杆菌基因表达载体构成 1、复制子：是一段包含起始位点和 反式因子作用区在内的 DNA片段。 其功能是通过复制使载体稳定存在 于大肠杆菌细胞。 2021年 1月 26日星期二 10 大肠杆菌基因表达载体 2、筛选标记：大肠杆菌经过转化后， 仅有少数细菌能获得携带外源基因 的质粒并稳定地传代，筛选标记可 有效地筛选出转化有外源基因的阳 性重组。 2021年 1月 26日星期二 11 大肠杆菌基因表达载体 3、启动子：是与 DNA依赖的 RNA 聚合酶相结合的一段 DNA序列。启 动子是调控外源基因转录的重要顺 式作用元件

5、，与 mRNA的合成有很 大关系，是表达载体不可缺少的元 件。 2021年 1月 26日星期二 12 大肠杆菌基因表达载体 4、终止子：在转录过程中能在特异 位点将转录终止的 DNA序列。有两 种类型 1、 因子型终止子 2、转录产物二级结构 2021年 1月 26日星期二 13 2021年 1月 26日星期二 14 大肠杆菌基因表达载体 4、终止子： 能在特异位点终止转 录的 DNA序列。终止子有两种类型 1、 因子 2、转录产物二级结构 2021年 1月 26日星期二 15 2021年 1月 26日星期二 16 2021年 1月 26日星期二 17 终止子的功能 （ 1）、能能有效控制目的

6、基因 mRNA的长度 （ 2）、提高 mRNA的稳定性 （ 3）、避免载体上其他基因的异常 表达 2021年 1月 26日星期二 18 大肠杆菌基因表达载体 5、核糖体结合位点：原核细胞 mRNA蛋白合成起始点上游的一段 非编码序列。能与 30S小亚基中 16S rRNA3末端的一段序列特异结合。 此序列富含嘌呤，核心序列为 SD序 列。 2021年 1月 26日星期二 19 大肠杆菌基因表达载体 6、密码子：密码子有简并性，多个 密码子为一个氨基酸进行编码，不 同生物在利用这些密码子时其利用 频率不同，不同的密码子会影响到 大肠杆菌的翻译速度。 2021年 1月 26日星期二 20 基因表达

7、的机制 基因工程技术的核心是基因表达技术。 迄今为止，已构件建了不同类型的表达 系统，可根据需要合理地选择适当的表 达系统。 外源基因在受体细胞中的表达包括： 1、 转录 2、 翻译 两个环节 2021年 1月 26日星期二 21 基因表达的机制 基因工程的核心问题： 有效表达 外源基因表达的关键步骤： 起始转录 基因表达的限速步骤： 转录起始的速率 构建表达系统时 首先要考虑的问题 是： 1、选择可调控的启动子 2、相关的调控序列 2021年 1月 26日星期二 22 目的： 在细胞生长的 初期 不表达或低 水平表达，当细胞增殖到一定的 密度 时，在某种特定的 诱导因子 的诱导下 启动转录

8、合成 mRNA。 启 动 子 原核生物启动子 真核生物启动子 诱导型 诱导型 组成型 组成型 2021年 1月 26日星期二 23 mRNA的延伸与稳定性： 有效表达的关键是：保持 mRNA的 1、 有效延伸 2、 正确终止 3、 mRNA在细胞中的稳定存在 2021年 1月 26日星期二 24 mRNA的有效延伸：导致 mRNA转 录提前终止的可能原因有和解决办 法 1、 衰减子 ：类似于简单的终止子， 在原核生物中一般位于 操纵子 的 启 动子 与 第一个结构基因 之间。在构 建表达载体时应 避免 该序列的存在。 2021年 1月 26日星期二 25 2、非特异终止： 防止非特异性终止 的

9、方法是在构建表达载体时加入 抗 终止的序列元件 。 2021年 1月 26日星期二 26 转录的正确终止也是外源基因有效 表达的重要因素，可以防止产生不 必要的转录产物，使 mRNA的长度 限制在一定的范围内，从而增加外 源基因表达的稳定性。 原核生物解决办法 真核生物解决办法 2021年 1月 26日星期二 27 mRNA在细胞中的稳定存在： mRNA在 受体细胞中的稳定存在直接决定翻 译产物的多少。解决办法 1、 原核生物：选择一个 RNase缺失 的工程菌株。 2、真核生物：提高 mRNA的正确加 工 2021年 1月 26日星期二 28 外源基因 mRNA的有效翻译 为使外源基因有效翻

10、译，在构建表 达体系时应考虑以下问题： 1、 AUG为首选起始密码子 2、 SD序列为与核糖体结合位点 3、 SD序列与起始密码子之间的距离为 3 9个碱基 4、在翻译起始区周围的序列不易形成 明显的二级结构 5、选择合适的终止密码子 2021年 1月 26日星期二 29 表达蛋白在细胞中的稳定性 常用的措施有： 1、构建融合蛋白表达系统 2、构建分泌蛋白表达系统 3、构建包涵体表达系统 4、选择蛋白水解酶基因缺陷受体系 统 2021年 1月 26日星期二 30 外源基因在大肠杆菌中表达产物在 细胞的位置：外源基因在大肠杆菌 中的表达产物可能存在于细胞质、 细胞周质和细胞外培养基中。其表 达形

11、式包括形成： 1、不溶性蛋白 2、可溶性蛋白 2021年 1月 26日星期二 31 大肠杆菌载体的表达方式 非融合表达载体 融合表达载体 带纯化标签表达载体 分泌型表达载体 表面展示表达载体 带分子伴侣表达载体 2021年 1月 26日星期二 32 1、非融合表达载体：应用此种载体 表达的蛋白质与天然状态下存在的蛋 白质在结构、功能和免疫原性等方面 基本或完全一致。目前上市的细胞因 子类产品多采用此类表达载体。 2、融合表达载体： 分子量较小 的蛋 白质常用此类载体进行表达。将 外源 蛋白基因 与 受体菌自身蛋白基因 重组 在一起，但不改变两个基因 阅读框 。 2021年 1月 26日星期二

12、33 在进行融合表达时，一般将 受体菌 蛋白位于 N端，而 外源 蛋白位于 C端。 外源蛋白与菌体自身蛋白以融合蛋 白的方式表达后其 稳定性 大大增加。 其原因为： 外源小分子蛋白上的酶 切位点暴露于分子的表面。 当以融 合蛋白的形式表达后，外源蛋白部 分在菌体自身蛋白的引导下正确折 叠，可最大程度上 封闭 酶切位点。 2021年 1月 26日星期二 34 带纯化标签的表达载体 ： 载体上具有 一段 特殊序列 ，该序列表达后可作为 纯化标签 。 目的基因与该序列 融合表 达 后， 用亲和层析的方法很方便的将 目的蛋白分离，切除标签序列后可得 到纯化的 目的蛋白 。 2021年 1月 26日星期

13、二 35 分泌型表达载体： 将 目的基因 与 信 号肽 融合表达， 表达蛋白 在 信号肽 的引导下成为 分泌蛋白 。 表面展示载体： 将 目的基因 克隆到 细菌 表面蛋白 的结构基因中，从而 达到 细菌表面 表达。 带分子伴侣的表达载体： 2021年 1月 26日星期二 36 2021年 1月 26日星期二 37 2021年 1月 26日星期二 38 2021年 1月 26日星期二 39 宿主菌 大肠杆菌 表达系统表达的基因一般 都是 异源基因 ，甚至是 真核生物 基 因，而在细胞内积累大量的异源蛋 白极易被降解。造成重组异源蛋白 在大肠杆菌中不稳定的原因有： 1、大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加

14、工和蛋白质 折叠系统 ； 2021年 1月 26日星期二 40 2、大肠杆菌不具备类似真核细胞 的 亚细胞结构 和表达 产物稳定因子 ； 3、大量的 异源重组蛋白 在大肠杆 菌细胞中形成 高浓度微环境 ，导致 蛋白质分子之间 的作用增强。 由于以上原因，为使外源基因 高效表达，必须构建作为基因表达 受体菌的 工程菌株 。 2021年 1月 26日星期二 41 常见的大肠杆菌表达系统 Lac和 Tac表达系统：以 lac操纵子 调控机制 为基础设计和构建的表达系统。通过对大 肠杆菌 tac I 基因诱变，获得能 过量 表达 lac I 阻遏蛋白 的基因突变体 lac Iq，使外源基因 的表达调控

15、在一定的水平。此外，目前还 构建了阻遏蛋白温度敏感型突变体 lac Iq(ts) 宿主菌和载体，使 lac和 tac启动子的转录受 温度的控制，在低温 (30oC)下基因的转录受 到抑制，在 (42oC)下基因的转录保持开放。 2021年 1月 26日星期二 42 常见的大肠杆菌表达系统 PL和 PR启动子表达系统：以 噬菌体 早期转录启 动子 PL和 PR构建的。在野生型 噬菌体 中， PL和 PR启动子的转录与否决定 噬菌体 进入 裂解循环 或 溶原循环 。 噬菌体 PE启动子控制的 cl基因表达产 物是 PL和 PR启动子转录的阻遏物，而其表达和在 细胞中的浓度取决于一系列宿主与 噬菌体

16、 因子之 间的复杂 平衡关系 。通过细胞因子调节 cl在细胞 中含量的途径很难操作，因此在构建表达体系时， 选用温度敏感突变体 cl1857(ts)的基因产物调控 PL 和 PR启动子的转录。 2021年 1月 26日星期二 43 常见的大肠杆菌表达系统 T7表达体系： 利用大肠杆菌 T7噬菌体 转录 系统元件 构建的，具有 很高表达 能力的表 达系统。 T7噬菌体 RNA聚合酶 能选择性地 激活 T7噬菌体 启动子的转录，这是一种活 性很高的 RNA聚合酶 ，其合成 mRNA的速 率相当于大肠杆菌 RNA聚合酶 的 5倍。在大 肠杆菌宿主细胞中，受 T7噬菌体 启动子控 制的基因在 T7噬菌

17、体 RNA聚合酶 存在下进 行高表达。 2021年 1月 26日星期二 44 常见的大肠杆菌基因表达受体菌株 菌株 基因型 启动子 BL 21 hsd S gal T 7噬菌体 HMS174 recA1 hsdR rif T 7噬菌体 M5279 lacZ trpA rpsL 噬菌体 PL RB791 W3110 lacIq L8 lac,tac 2021年 1月 26日星期二 45 大肠杆菌高效表达目的基因策略 对表达相关元件进行优化 提高稀有密码子 tRNA的表达作用 提高外源基因表达产物的稳定性 优化发酵过程 提高外源基因 mRNA的稳定性 2021年 1月 26日星期二 46 表达相关

18、元件的优化 主要包括与表达相关的 启动子 序列 和决定 mRNA翻译 的 SD序列 。具体方 法为组合 强启动子 和 强终止子 ；增 加 SD序列 中与核糖体 16SrRNA互补 配对的 碱基序列 ；调整 SD序列 与起 始密码 ATG之间的距离及碱基的种 类；防止核糖体结合位点附近序列 转录后形成 发卡结构 。 2021年 1月 26日星期二 47 表达质粒的优化和设计 构建表达质粒时首先要考虑使目标 基因的翻译起始密码 ATG 与 SD 序列之 间的距离和碱基组成处于一个适当的范围 内。 2021年 1月 26日星期二 48 核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻 译效率有显著影响，具

19、体表现为： SD 序列 UAAGGAGG 的翻译效率要 比 AAGGA 高 3 6倍 翻译起始密码 ATG 与 UAAGGAGG 的最适距离是 6 8 个碱基长度，与 AAGAA 的最适距离是 5 7 个碱基长度 ATG 与 UAAGGAGG 至少相隔 3 4 个碱基，与 AAGAA 至少相隔 5 个碱基； mRNA 的翻译才能进行 ATG 与 SD 序列之间的碱基组成为 A， T 碱基丰富时， mRNA 翻译效率较高。 2021年 1月 26日星期二 49 核糖体结合位点本身和附近的序列决定 了目标基因 mRNA 5 端的二级结构 ， 研 究表明讨 mRNA 5端形成的 “ 茎环 ” 结 构

20、阻碍了 mRNA 与核糖体 30S 亚基的结 合 ， 从而抑制了翻译的起始 。 2021年 1月 26日星期二 50 尽量提高核糖体结合位点本身和附近 的序列中 A/T 碱基的含量，降低 mRNA 5 端形成的 “茎环” 结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意 的事项。 在必要的情况下，还可通过定点 突变， PCR 等技术改变个别关键的碱 基来破坏 mRNA 5 端的 “茎环” 结 构 。 2021年 1月 26日星期二 51 把目标基因设计成多顺反子结构， 在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件 后加上第二个 SD 序列和目标基因， 一起插入表达载体。这一方法通常适 用于目标基因 5 端序列容

21、易形成二级 结构，而又不宜改变其序列的情形下 2021年 1月 26日星期二 52 表达质粒的优化和设计 在构建表达质粒时，充分利用各个基 因的结构特征和特点，注意引入翻译增强 子序列 能提高 mRNA 翻译效率的特殊核苷 酸序列，称为翻译增强子 。 2021年 1月 26日星期二 53 提高稀有密码子 tRNA的表达作用 简并密码子 的使用频率不同与相应 tRNA在细胞中的丰度有关。过多使 用低丰度 tRNA时，会因 tRNA耗尽而 影响翻译。可将外源基因中同义密码 子进行 点突变 ，成为受体菌中常用密 码子而提高表达能力。 2021年 1月 26日星期二 54 共表达大肠杆菌稀有密码子 t

22、RNA 基因 表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因 。 现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有： 编码 Arg 的密码子 AGA、 AGG、 CGA、 CGG 编码 Pro 的密码子 CCC、 CCU、 CCA 编码 Cys 的密码子 UGU、 UGC; 编码 Gly 的密码子 GGA、 GGG 编码 Leu 的密码子 CUA、 CUC 编码 Ile 的密码子 AUA 编码 Ser 的密码子 UCA、 AUG、 UCG、 UCC 编码 Thr 的密码子 ACA 四、高效表达目标基因的战略和技 术 2021年 1月 26日星期二 55 共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因 由

23、于同义密码子的使用频率与细胞 内对应的 tRNA 的丰度有正比关系稀有密 码子对应的 tRNA 的丰度很低 ， 有可能在 翻译过程中发生中止和移码突变 。 2021年 1月 26日星期二 56 解决这一问题的办法： 1、通过基因突变把稀有密码子改变 为其他使用频率高的同义密码子。 2、在表达系统中共表达稀有密码子 tRNA 基因，以提高大肠杆菌细胞 内稀有密码子 tRNA 的丰度 2021年 1月 26日星期二 57 提高外源基因表达产物的稳定性： 大肠杆 菌中含有多种 蛋白水解酶 ，在外源基因表 达产物的诱导下，其蛋白水解酶的活性可 能会 增加 。因此必需提高外源蛋白在大肠 杆菌细胞内的 稳

24、定性 。常用的方法有： 1、将外源基因的表达产物转运到细胞周 质或培养基中； 2、选用某些蛋白水解酶缺陷株； 3、对外源蛋白中水解酶敏感的序列进行修 饰或改造； 4、在表达外源蛋白的同时，表达外源蛋白 的稳定因子。 2021年 1月 26日星期二 58 提高外源基因 mRNA的稳定性： 大肠杆 菌的核酸酶系统能专一性地识别外源 DNA或 RNA并对其进行降解。为了保 持外源 mRNA在宿主细胞内的稳定性， 可采取两种措施： 1、尽可能减少核酸外切酶对外源基因 mRNA的降解； 2、改变外源基因 mRNA的结构，使之 不易被酶降解。 2021年 1月 26日星期二 59 提高目标基因 mRNA

25、和目标基因产物 的稳定性 由于大肠杆菌防御体系的自身保 护作用，大肠杆菌中的核酸酶和蛋白 水解酶能够降解目标基因 mRNA 和目 标基因产物，这种降解作用程度对不 同的基因或蛋白质而言是不同的，具 有一定的专一性和选择性 。 2021年 1月 26日星期二 60 提高目标蛋白的稳定性的措施主要有： 1、利用蛋白转运系统把目标蛋白最终累积在周 质空间，或分泌到培养基中 2、采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为 宿主菌。 3、对分子量较小的目标基因进行融合表达或串 联聚合表达。 4、共表达能提高特定目标蛋白稳定性的辅助因 子，如分子伴侣基因。 5、对蛋白质序列中的蛋白水解酶敏感区域和识 别位点进

26、行改造。 6、在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。 2021年 1月 26日星期二 61 但必须指出的是 ， 由于目标蛋白本身的性质和用途的不同 ， 上述几种 方法在使用上是受到一定的限制的 。 主要表现为： 大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的较运和分泌效率一般比较低 ， 不 能满足大规馍制备的需要 。 蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛 ， 生长速率慢 ， 使高密度发 酵比较困难 。 融合表达使目标蛋白的构象与天然状态不一样 ， 导致生物比活力降低 ， 甚至没有活性 。 融合蛋白和串联聚合蛋白需要用酶或化学的方法切割出单体目标蛋白 。 酶法成本比较高且加入的酶蛋白还必须分离去除 。 化学法

27、比酶法成本低 ， 但不少裂解试剂有毒性 。 对蛋白质序列进行改造需要有基本的蛋白质结构数据 ， 而目前这方面 的数据库还不完整 。 2021年 1月 26日星期二 62 优化发酵过程： 工艺的优化 生物学因素的优化 2021年 1月 26日星期二 63 工艺的优化 扩大培养的条件优化 反应器的优化 2021年 1月 26日星期二 64 生物学因素的优化 溶氧量 pH值 温度 培养基成分 培养基的混合情况 2021年 1月 26日星期二 65 四、高效表达目标基因的战略和技 术 高密度发酵和工程化宿主细胞 大肠杆菌高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺 步骤。其目的是在单个菌体对目

28、标基因的表达水平基本不变的前提下，通 过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。 目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培养、连续培养三种 2021年 1月 26日星期二 66 构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌 高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高 ， 培养基中的溶氧饱和度往 往比较低 ， 氧气的不足导致菌体生长速率降低和乙酸的累积 ， 乙酸的存在对 目标基因的高效表达有明显的阻抑作用 。 这是高密度发酵工艺研究中最迫切 需要解决的问题 。 虽然在发酵过程中可 采取通氧气 ， 提高搅拌速度 ， 控制补料速度 等措 施来控制溶氧饱和度 ， 减少乙酸的产生 。 但从实际应用上看 ， 这

29、些措施都有 一定的滞后效应 ， 难以做到比较精确的控制 。 因此 构建出产乙酸能力低的工 程化宿主菌 ， 是从恨本上解决问题的途径之一 。 2021年 1月 26日星期二 67 芽孢杆菌表达系统 芽孢杆菌是对人畜无害的革兰氏阳性 土壤微生物。细菌细胞壁内不含内毒 素，能分泌大量蛋白到胞外，目前已 成为一些重要工业酶制剂的生产菌种。 2021年 1月 26日星期二 68 1、多为非致病性微生物 2、培养条件简单，生长迅速 3、表达产物能分泌到细胞外的 培养基中，且多数表达产物具 有天然构象和生物学活性 4、遗传背景比较清楚，便 于进行遗传操作 5、培养发酵技术比较成熟 2021年 1月 26日星

30、期二 69 芽孢杆菌表达系统的不足 1、芽孢杆菌分泌的蛋白酶量大、种 类多，对外源基因表达产物的稳定 性形成很大威胁 2、载体不稳定，易造成外源基因的 丢失 2021年 1月 26日星期二 70 芽孢杆菌表达载体 复制子 ：目前广泛应用于芽孢杆菌表 达载体的复制子有： 1、来源于 金色葡萄球菌 的复制子如 pUB110、 pC194和 pE194等质粒表 达载体。 2、来源于 小芽孢杆菌 的复制子如 pHY481、 pWT481等。 2021年 1月 26日星期二 71 芽孢杆菌表达载体 启动子 ：在利用 芽孢杆菌 表达体系时， 必需使用 芽孢杆菌 能够识别的启动子。 芽孢杆菌 含有多种转录

31、起始识别因子 ()，在 芽孢杆菌 中已鉴定的 已达十 种。启动子可被特异的 因子识别。 芽孢杆菌 启动表达具有明显的时序性， 与菌体的 生长周期 和 生理代谢 活动密 切相关。 2021年 1月 26日星期二 72 表达载体 ： 1、 自主复制质粒 芽孢杆菌的自主复 制质粒大多为 无抗性标志 的隐蔽质粒。 带有抗性标志的自主复制质粒主要来 自其它 革兰氏阳性菌 ，如金黄色葡萄 球菌如 pUB110、 pC194和 pE194， 并在 这些质粒的基础上构建了双标记质粒 等载体。自主复制质粒不稳定，在复 制过程中易发生丢失。 2021年 1月 26日星期二 73 2、整合质粒： 在 大肠杆菌质粒

32、的基 础上增加一个 芽孢杆菌 的 抗性标志 ， 以及 待整合的目的基因 。因其没有 芽孢杆菌的复制子，不能自主复制， 整合到芽孢杆菌染色体后，随细胞 复制而复制。 3、噬菌体： 105 、 SP 及其它 噬 菌体 均可作为芽孢杆菌的表达载体。 其中 105 是一种温和 噬菌体 。 2021年 1月 26日星期二 74 宿主菌： 野生型芽孢杆菌 能分泌大 量的 胞外蛋白酶 ， 影响外源基因表 达产物的稳定性，因此在构建 芽孢 杆菌表达系统 宿主菌时要将蛋白酶 基因进行 突变 ， 使其 灭活或将活性 降低 。 目前应用较多的宿主菌主要 有 枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和 地衣芽孢杆菌 等 。 202

33、1年 1月 26日星期二 75 枯草芽孢杆菌 能分泌 6种 不同的 胞外 蛋白酶 ，即 枯草杆菌蛋白酶、胞外 蛋白酶、金属蛋白酶、杆菌肽酶及 中性蛋白酶 A和 B。对其中 3 5种 胞 外蛋白酶基因 进行 突变 ，可将 胞外 蛋白酶 的活性降低至原来的 1； 若 将 6种胞外蛋白酶基因 全部突变 ，则 胞外蛋白酶 活性可降至原来的 0.3% 左右 。 2021年 1月 26日星期二 76 短小芽孢杆菌表达体系的优点： 1、能对许多蛋白质进行 分泌表达 2、胞外蛋白酶活性较低 3、短小芽孢杆菌分泌胞外蛋白酶 的同时还能产生 蛋白酶抑制剂 ，不 同短小芽孢杆菌分泌抑制剂的能力 不同，使胞外蛋白酶的

34、活性差异很 大 2021年 1月 26日星期二 77 4、 细胞壁 的结构由三层组成，最 外两层为 蛋白层 ，内层为 肽聚糖 。 细胞壁的结构 与细胞的 生长周期 有 关。在 生长稳定前期 ， 细胞壁 的外 层和中层蛋白开始从细胞表面 脱落 ， 分泌型蛋白开始表达；进入 稳定期 后， 细胞壁 的蛋白层 全部脱落 ， 细 胞壁 蛋白仍然表达导致 细胞壁蛋白 在培养基中大量 累积 。 2021年 1月 26日星期二 78 5、利用细胞壁蛋白基因的 启动区 、 操纵区 、 翻译起始区 和 蛋白质信号 肽序列 等元件表达外源基因，可使 外源基因在小芽孢杆菌表达系统中 获得 高效分泌表达 。 2021年

35、 1月 26日星期二 79 芽孢杆菌中高效表达的策略 1、提高表达质粒在细胞中的稳定性： 以 金黄色葡萄球菌 为基础构建的 一系 列质粒 在进行 滚环复制 时会产生许多 单链 DNA，这些 单链 DNA的存在会对 质 粒 DNA造成影响，在没有选择压力的情 况下易发生丢失；某些表达 质粒载体 还含有 染色体 DNA同源序列 ，在 细胞 分裂 的过程中可发生 同源交换 ，导致 质粒 的消失。 2021年 1月 26日星期二 80 2、构建新型的表达质粒 ：通过消除 表达载体 中与 宿主菌染色体 DNA的 同 源序列 3、构建整合型质粒 ：利用质粒中与 染色体 的 同源序列 构建 整合型质粒 ，

36、使目的基因整合到 染色体 上 4、灭活芽孢杆菌胞外蛋白酶 2021年 1月 26日星期二 81 链霉菌表达系统 链霉菌是一类好氧、丝状的革兰氏 阳性细菌，广泛存在于土壤中，能 够产生多种生理活性物质。链霉菌 的染色体为线状结构，在中间含有 复制起始点和共价结合的末端蛋白， DNA不稳定，有时会出现缺失而环 化，但对细菌生长没有严重影响。 2021年 1月 26日星期二 82 链霉菌表达系统的特点； 1、为非致病性细菌，不产生内毒 素 2、可进行外源蛋白的分泌表达 3、可进行高密度培养，具有丰富 的次级代谢途径和初、次级代谢调 控体系，表达外源蛋白的时间较长 4、链霉菌在传统发酵工业中应用 历史

37、悠久，有良好的工业化基础 2021年 1月 26日星期二 83 链霉菌表达载体 启动子：链霉菌基因启动子的结构 表现为多样性，至少存在三类链霉 菌基因启动子： 1、与大肠杆菌基因 10区和 35区类似 的启动子， 10区碱基序列通常为 5TAGPuPuT3， 35区碱基序列 为 5TTGCPu3，这种启动子序列可被大肠 杆菌 RNA聚合酶识别，这类启动子一般 在细菌对数生长期启动相关基因的转录。 2021年 1月 26日星期二 84 2、仅与大肠杆菌基因 10区类似的 启动子。 3、与大肠杆菌基因 10区与 35区 序列均不相同的启动子。 终止子：链霉菌基因终止子结构具 有较长的不完全互补反向

38、重复序列， 能形成发卡结构，在多数情况下不 含寡聚 T序列，转录终止位点位于终 止子结构下游的邻近区域 2021年 1月 26日星期二 85 核糖体结合位点：链霉菌基因核糖 体结合位点的序列类似于其他原核 生物的 SD序列： 5(a/g)GGAGG3 相对于其他革兰氏阳性细菌而言， 链霉菌基因中核糖体序列的保守性 略低，与起始密码之间的距离为 5 12个碱基。链霉菌基因转录起始位 点与编码区之间的距离变化也较大， 从数个 bp到几百个不等。 2021年 1月 26日星期二 86 密码子：链霉菌对编码蛋白质的密 码子具有明显的偏爱性。对数十种 链霉菌蛋白质的密码子进行统计发 现，编码蛋白质的碱基

39、序列中 GC 的平均含量高达 73，密码子的第 一、第二和第三位碱基的 GC含量 分别为 66、 53和 93。有些简 并密码子的使用频率不足 2。 2021年 1月 26日星期二 87 链霉菌表达载体 1、高拷贝载体：普遍采用的是 pIJ101，在链霉菌中的拷贝数为 40 800。通常加入硫链丝霉素、红 霉素、紫霉素和新霉素作为抗性选 择性标记。 pIJ702是 pIJ101的衍生 质粒，含有 mel(酪氨酸酶 )和 tsr基因 作为选择性标记。外源基因可插入 灭活 mel基因，因不产生黑色素而非 常方便使用。 2021年 1月 26日星期二 88 2、低拷贝载体：由 SCP2*衍生的 质粒

40、 pIJ922和 940等，可接受较大 的外源基因，但只有 1 2个拷贝。 3、穿梭质粒载体：可在大肠杆菌 中完成构建和复制，在链霉菌细胞 中进行表达。 4、噬菌体载体 2021年 1月 26日星期二 89 宿主菌： 链霉菌基因表达系统的宿 主菌主要有变铅青链霉菌和天蓝色 链霉菌。天蓝色链霉菌是整个霉菌 中分子遗传学研究最清楚的菌株， 但有较强的修饰系统，因而在实际 应用中都是以变铅青链霉菌作为外 源基因表达的受体菌系统。 2021年 1月 26日星期二 90 变铅青链霉菌表达外源基因的优点 1、遗传背景清楚，不含内源性质粒 2、对外源 DNA无明显的修饰作用 3、能够高效表达链霉菌基因以外的

41、 其他基因； 4、具有高效的异源蛋白分泌系统， 并且其内源蛋白酶和外源蛋白酶合成 量低。 2021年 1月 26日星期二 91 在链霉菌中高效表达外源基因的策略 影响外源基因在链霉菌中表达的因素 包括： 启动子的特性 信号肽的序列 基因的结构 和发酵条件等 2021年 1月 26日星期二 92 启动子的影响：链霉菌 RNA聚合酶能 识别某些原核生物的启动子，但不能 识别真核生物基因的启动子，因此表 达真核生物基因时要采用链霉菌的启 动子。为高效表达要对其进行适当的 修饰和改造。如在启动子的 10区和 35区内插入 GC碱基对可明显提高 外源基因的转录效率；将 ermE启动 子中缺失 3个碱基对

42、，可使基因启动 转录的效率大大增加。 2021年 1月 26日星期二 93 信号肽序列：针对要表达的外源蛋 白对信号肽序列进行优化是实现外 源蛋白高效分泌表达的重要途径。 在信号肽 N区的电荷数增加或减少 可使分泌表达的效率成倍的增加或 降低；信号肽与目的蛋白的距离也 影响到外源蛋白的分泌。信号肽只 影响分泌与否而不影响表达的效率。 2021年 1月 26日星期二 94 基因结构的影响： 1、密码子的影响：应尽可能不出现 链霉菌中的稀有密码子。链霉菌中 翻译的起始密码子一般为 ATC或 GTC,终止密码为 TAA或 TAG。 2、 SD序列：不同的宿主其 SD序列 不同，针对不同的链霉菌对 S

43、D序列 进行改造或修饰以提高外源基因的 表达。 2021年 1月 26日星期二 95 3、终止子：选择合适的终止子可提 高 RNA聚合酶的利用率和增加 mRNA的稳定性 发酵条件：包括发酵工艺、培养基 组分、各种环境因素如温度、 pH值 和溶氧等一系列相关条件，这些条 件的确定须经实验反复摸索。 2021年 1月 26日星期二 96 蓝藻表达系统 蓝藻是近年来迅速发展起来的一种 很好的表达系统，蓝藻含有叶绿素 和藻胆色素，具有光合系统，进行 光合作用。蓝藻还具有原核生物的 特征，无细胞核及双层膜结构的细 胞器，染色体 DNA裸露，是典型的 原核生物。 2021年 1月 26日星期二 97 蓝藻

44、表达系统的特点 作为表达外源基因的受体菌兼具微 生物和植物的优点，表现为： 1、基因组为原核型，除了裸露的染 色体 DNA外，不含叶绿体 DNA和线 粒体 DNA，遗传背景简单，便于基 因操作和外源 DNA检测； 2、细胞壁为革兰氏阴性，便于外源 DNA的转化； 2021年 1月 26日星期二 98 3、营光合自养生长，培养条件简单， 只需光、 CO2、无机盐、水和适宜 的温度； 4、多种蓝藻含有内源质粒，为构建 蓝藻质粒载体提供了极好的条件； 5、蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻 无毒，经常作为食品或保健品的添 加剂。 2021年 1月 26日星期二 99 蓝藻外源基因表达载体 为使外源目的基因

45、的有效转化及表 达，已构建了一系列穿棱质粒表达 载体和基因整合平台系统，如： pZL、 pPKE2、 pPKET等。在这些 表达载体上组装了多种含有不同启 动子的基因表达盒。应用较多的有 噬菌体 PL和 PR启动子及蓝藻藻蓝蛋 白 cpcB2A2操纵子启动子和热休克 基因 groESL等。 2021年 1月 26日星期二 100 在蓝藻细胞中高效表达外源目的基 因的策略 1、构建在蓝藻细胞中稳定性好的 表达载体系统：现已构建了松驰质 粒复制起始点的穿梭质粒，在细胞 中有较高的基因拷贝数，提高了目 的基因高效表达的可能性。 2021年 1月 26日星期二 101 2、重组穿梭质粒在蓝藻细胞中通常

46、 是很不稳定的，在缺选择压力的培 养条件下很容易丢失，导致目的基 因表达的不稳定性。近年来以蓝藻 染色体 DNA的非必需序列区为基因 整合平台，构建相应的供体质粒表 达载体，通过同源重组将目的基因 整合到蓝藻染色体上保证其稳定。 2021年 1月 26日星期二 102 3、组装含强启动子的外源表达盒。 4、外源基因融合表达：近年来开发 了泛素融合表达系统。经蓝藻、大 肠杆菌及酵母细胞的实验证明，目 的基因泛素基因融合表达可大大提 高目的基因的表达量，并且几乎所 有泛素融合形式产生的蛋白质都是 具有活性的，同时，泛素还可被作 为分离标签。 2021年 1月 26日星期二 103 基因表达产物的检

47、测与分离纯化 外源基因 的 表达 包括 转录和翻译 两 个阶段。因此， 外源基因 表达产物 的检测过程就是对 特异性 mRNA和 蛋 白质 的检测。对 mRNA检测 的主要方 法为 Northern杂交法 ，检测 特异性 蛋白质 的方法包括 生化反应检测法、 免疫学检测法和生物学活性检测法 等。 2021年 1月 26日星期二 104 外源基因转录产物的检测 外源基因转移到受体细胞后可能有 的命运是： 1、外源基因与表达载体一起游离于 染色体外进行转录 2、外源基因整合到染色体上并进行 转录 3、外源基因整合到染色体上后不 转录，表现为基因沉默 2021年 1月 26日星期二 105 Nort

48、hern杂交检测 mRNA步骤： 1、提取总 RNA 2、分离 mRNA(利用亲和层析的原 理纯化 ) 3、制备 RNA探针。 (根据 mRNA序 列合成同源 DNA探针或以 cDNA探 针 ) 4、 Northern杂交 2021年 1月 26日星期二 106 报告基因 (reporter gene)是一种编码 可被检测的蛋白质或酶的基因，也就 是说，是一个其表达产物非常容易被 鉴定的基因。把它的编码序列和基因 表达调节序列相融合形成嵌合基因， 或与其它目的基因相融合，在调控序 列控制下进行表达，从而利用它的表 达产物来标定目的基因的表达调控， 筛选得到转化体。 报告基因的酶法检测 2021

49、年 1月 26日星期二 107 2021年 1月 26日星期二 108 作为报告基因，在遗传选择和筛选 检测方面必须具有以下几个条件： (1)已被克隆和全序列已测定； (2)表达产物在受体细胞中本不存 在，即无背景，在被转染的细胞中无 相似的内源性表达产物； (3)其表达产物能进行定量测定。 2021年 1月 26日星期二 109 报告基因的特点 1、表达产物及其功能在未转化的受 体细胞中不存在 2、报告基因的表达产物便于检测 2021年 1月 26日星期二 110 基因工程中使用的报告基因： 1、氯霉素乙酰转移酶 (CAT)：催化 乙酰辅酶 A中的乙酰基团转移到氯 霉素分子上而使氯霉素失活。

50、真核 生物细胞中不含 CAT，重组后细胞 产生氯霉素抗性。 CAT的活性可以 通过反应底物乙酰 CoA的减少或乙 氯霉素的增加表示。 2021年 1月 26日星期二 111 基因工程中使用的报告基因： 2、 -葡萄糖苷酯酶基因 (GUS)编码 产物催化 -葡萄糖苷酯类物质的水 解。大多数植物细胞、细菌细胞和 真菌中都不存在内源 GUS活性而广 泛用作转基因植物、细菌和真菌的 报告基因。 2021年 1月 26日星期二 112 以邻 硝基苯 D 半乳吡喃糖苷 (ONPG)为底物可用标准的比色法检 测酶活性，其检测动力学范围为 6个数 量级。氯酚红 D 半乳吡喃糖苷 (CPRG)是另一个可用比色法

51、检测酶活 性的底物，其灵敏度比 ONPG高近 10 倍。以 MUG和荧光素二半乳糖苷 (FDG)为底物则可用荧光法检测其活 性。 2021年 1月 26日星期二 113 3、荧光素酶：荧光素酶是能够催化不 同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无 内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有 细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和 Renilla荧光素酶。细菌荧光素酶对热敏 感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。 萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线性范 围宽达 7 8个数量级，是最常用于哺乳 细胞的报道基因，用荧光比色计即可检 测酶活性，因而适用于高通量筛选。 2021年 1月 26日星期二 114 荧光素酶报告基因有许多

52、优点： 非放射性； 比 CAT及其他报告基因速度快； 比 CAT灵敏 100倍； 荧光素酶在哺乳细胞中的半衰期为 3小时，在植物中的半衰期为 3 5小 时。由于半衰期短，故启动子的改变 会即时导致荧光素酶活性的改变，而 荧光素酶不会积累。 2021年 1月 26日星期二 115 4、分泌型碱性磷酸酶 (SEAP)： SEAP 是人胎盘碱性磷酸酶的突变体，无内 源性表达。 SEAP缺乏胎盘碱性磷酸 酶羧基末端的 24个氨基酸。其优点 是无需裂解细胞，只用培养介质即可 检测酶活性，便于进行时效反应试验。 以间硝基苯磷酸盐 (PNPP)为底物时 可用标准的比色法测定酶活性，操作 简单，反应时间短，价

53、格廉价，但灵 敏度低。 2021年 1月 26日星期二 116 5、荧光蛋白家族：荧光蛋白家族是 从水螅纲和珊瑚类动物中发现的相对 分子质量为 20 000 30 000的同源 蛋白。绿色荧光蛋白 (GFP)是应用最 多的发光蛋白。 GFP存在于发光水母 (AequoreaVictoria)中。用 395 Bin的 紫外线和 475 nm的蓝光激发， GFP 可在 508nm处自行发射绿色荧光， 无需辅助因子和底物。 2021年 1月 26日星期二 117 免疫学检测：是基因表达产物检 测中最常用的方法之一。以表达 产物作为抗原，通过与特异性抗 体发生反应来确定基因表达的情 况。主要方法有 1

54、、免疫沉淀法 2、酶联免疫吸附法 3、 Westhern印迹法 4、固相放射免疫法等 2021年 1月 26日星期二 118 免疫沉淀法的过程 1、对靶细胞进行放射性标记：通常 以同位素 35S标记靶蛋白，在培养基 中加入 35S 的蛋氨酸和半胱氨酸 的混合物，通过代谢过程使哺乳动 物培养细胞标记上放射性同位素。 2、细胞裂解释放靶抗原 3、靶蛋白的免疫沉淀 将抗靶蛋白 的特异性抗体加入到细胞裂解液中 形成抗原 -抗体复合物并回收。 2021年 1月 26日星期二 119 4、将回收的靶蛋白在反应试管中与 蛋白抗体，使之与靶蛋白结合并形 成沉淀。 5、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 2021年 1

55、月 26日星期二 120 酶联免疫吸附法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 1、 抗体制备： ELISA检测中的抗体包 括普通抗体和酶标记抗体，其中酶 标记的抗体又分为针对特异抗原的 酶标一抗和针对一抗的酶标二抗 2、抗体或抗原的包被：通过物理吸 附法和共价交联法等将抗原或抗体 固定在固相载体的表面 2021年 1月 26日星期二 121 3、免疫反应： 特异性抗原与固相抗 体结合形成抗原 -抗体复合物，再与 酶标抗体反应形成抗原 -抗体 -酶标抗 体复合物 4、特异性表达产物的检测：洗去未 发生反应的抗体，加入显色剂或荧光 底物，通过酶促反

56、应发生颜色或荧光 强度变化以确定抗原的量。 2021年 1月 26日星期二 122 Westhern印迹法 1、总蛋白质的提取 2、 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 3、蛋白质印迹 4、探针的制备 (针对目的蛋白的抗 体一抗它一般不进行标记，而 与一抗结合的二抗带特定的标记 ) 5、杂交检出 生物学活性检测 2021年 1月 26日星期二 123 基因表达产物的分离纯化 1、细胞破碎 2、离心 3、特异性表达蛋白的初步分离 4、柱层析 5、电泳分离 6、高效液相层析 2021年 1月 26日星期二 124 包涵体： 在一定条件下，外源基因 的表达产物在大肠杆菌中积累并致 密地聚集在一起形成无膜的裸露

57、结 构，称为 包涵体 。 包涵体主要存在 于细胞质中，主要由蛋白质组成， 并且大部分蛋白质为外源基因的表 达产物，他们具有正确的氨基酸序 列，但没有正确的空间结构，因此 包涵体不具备生物功能。 2021年 1月 26日星期二 125 包涵体及其性质 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累 某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚 在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结 构，这种 水不溶性 的结构称为 包涵体 （ Inclusion Bodies， IB）。 包涵体型异源蛋白的表达 2021年 1月 26日星期二 126 富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基 酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些 氨基酸

58、类似物所合成的蛋白质往往会丧失其 理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。 由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌 大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后 者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细 菌细胞内。 除此之外，包涵体中还含有少量的 DNA、 RNA和脂多糖等非蛋白分子 2021年 1月 26日星期二 127 以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点 包涵体表达形式的优点 在一定程度上保持表达产物的结构稳定 能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集 简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌 体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋

59、白从细 菌裂解物中分离出来 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白 。 包涵体型异源蛋白的表达 2021年 1月 26日星期二 128 以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点 包涵体表达形式的缺点 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过 有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具 有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标 产物的收率至关重要。 经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性， 有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋 ，尤其当目标蛋白分子中的 Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低， 一般不 超过 30% 复性处理

60、工艺可使目标蛋白的制备成本上升。 包涵体型异源蛋白的表达 2021年 1月 26日星期二 129 包涵体的变性与复性操作 包涵体的溶解与变性 包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的 二硫键 和 次级键。 在 人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。 能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括： 清 洗 剂 SDS、正十二醇肌氨酸，廉价， 但影响复性和纯化 促 溶 剂 盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜， 但常被自发 形成的氰酸盐污染， 后者能与多肽链中的氨基反应 混合溶剂 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用， 溶解力增强 极 端 pH 廉价，但许多蛋白质在极端 pH条件下发生修饰反应 包涵体型异源蛋白的表达 2021年 1月 26日星期二 130 包涵体的变性与复性操作 包涵体的复性与重折叠（ refolding） 包涵体的复性与重折叠的主要任务： 将多肽链中被拆开的 游离巯基 重新折叠 通过 次级键 的形成使蛋白质复性 包涵体型异源蛋白的表达