多聚核苷酸与核酸袁萍

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1、目 录 第 三 章 多聚核苷酸与核酸 Polynucleotides AND Nucleic Acids 目 录 多聚核苷酸 (Polynucleotides) 多聚核苷酸是 核苷酸 通过 3， 5-磷酸 二酯键连接的聚合物 ， 是核酸 (nucleic acid)分子中的基本形式 。 目 录 核酸的分类及分布 存在 于细胞核和 线粒体 分布于细胞核、细胞质、 线粒体 (deoxyribonucleic acid, DNA) (ribonucleic acid, RNA) 脱氧核糖核酸 核糖核酸 携带遗传信息，并通过复制传递 给下一代。 是 DNA转录的产物，参与遗传信 息的复制与表达。某些病

2、毒 RNA 也可作为遗传信息的载体 目 录 第一节 多聚核苷酸 Polynucleotides 目 录 一、多聚核苷酸就是核苷酸的多聚物 多个 核苷酸 （ nucleitide） 通过 3， 5-磷酸 二酯键 （ phosphodiester bond） 连接 、 形成的 链状聚合物 ， 即多聚核苷酸 （ polynucleotides） 。 目 录 3, 5-磷酸二酯键 （一） 3, 5-磷酸二酯键是核酸的基本结构键 目 录 5端 3端 C G A （二）多聚核苷酸 链有方向性 目 录 A G P 5 P T P G P C P T P OH 3 （三）书写方法 5 pApCpTpGpCpT

3、-OH 3 5 A C T G C T 3 目 录 目 录 （四）核酸分为核糖核酸和脱氧核糖核酸两类 RNA是单链多聚核糖核苷酸 DNA是单链或双链多聚脱氧核糖核酸 目 录 二、多聚核苷酸链在细胞内通过复制和 转录而合成 生物体内的 DNA链或 RNA链的合成是在包括 DNA 聚合酶或 RNA聚合酶在内的一组酶共同参与下完成的 。 这个合成过程以 dNTP或 NTP为原料 ， 以单链 DNA链为 模板 ， 逐步地完成从 5-末端到 3-末端的合成 。 以 DNA为模板合成 DNA链和 RNA链的过程分别称 为 复制 （ 第十六章 ） 和 转录 （ 第十七章 ） 。 目 录 三、多聚核苷酸链可在

4、体外经多种方式合成 （一） DNA聚合酶链反应是当前获得 DNA片段最 常用技术 （二）单链寡脱氧核糖核苷酸链可利用亚磷酰胺 三酯方法合成 （三）核糖核苷酸链可利用体外转录体系合成 目 录 （一） DNA聚合酶链反应是当前获得 DNA片 段最常用技术 DNA聚合酶链反应 （ DNA polymerase chain reaction， PCR） 是在体外条件下复制 DNA片段的方法 。 将专用的 DNA 聚 合 酶 （ DNA polymerase ） 、 dNTP 、 一对引物 （ primer） 及模板 DNA混合在一起 ， 经过多个升温解链 -降 温退火 -恒温延伸的循环过程 ， DNA

5、聚合酶将合成出与模板 完全相同的双链 DNA片段 。 每一个循环过程都将被复制的 DNA片段数目按指数增 长 ， 因此采用 PCR技术获得 DNA的过程 ， 又称为 体外扩增 （ in vitro amplification） 技术 ， 应用极广 （ 第二十三章 ） 。 目 录 （二）单链寡脱氧核糖核苷酸链可利用亚磷 酰胺三酯方法合成 该合成通常是在 DNA自动合成仪的固相载体上完成的 ， 连接一个核苷酸需要 4个步骤 。 然后 ， 通过氨水高温处理将 核苷酸链从固相载体上分离下来 。 利用 DNA自动合成仪合成的寡核苷酸 DNA单链一般为 几十个核苷酸 。 值得注意的是 ， 该方法中的合成方

6、向是从 3-末端向 5-末 端合成 。 用于基因检测的寡核苷酸 探针 （ probe） 以及用于 PCR反应的 引物 都是利用该方法得到的 。 目 录 （三）核糖核苷酸链可利用体外转录体系合成 利用 体外转录体系 （ in vitro transcription system） 合成 RNA（ 链 ） 是分子生物学常用技术 。 这种体外转录体系是现 代发展起来的体外转录 （ in vitro transcription） 技术 在 含有 RNA聚合酶 （ 转录酶 ） 、 必要的蛋白质因子 、 核苷三磷 酸等条件的体外无细胞体系中 ， 加入 DNA模板 ， 模仿体内转 录 、 生成 RNA的过程

7、 （ 第二十四章 ） 。 利用真核细胞核抽提物 （ nuclear extract） 建立再造体 系是当前生物技术商家提供体外转录商品试剂盒 （ kit） 的主 要来源 。 目 录 四、核苷酸的排列顺序就是多聚核苷酸 链的一级结构 定义 多聚核苷酸链的核 苷酸从 5-末端到 3-末端 的排列顺序 。 由于核苷酸间的差 异主要是碱基不同 ， 所 以也称为 碱基序列 。 5端 3端 C G A 目 录 第二节 DNA的结构和功能 Structure and Function of DNA 目 录 一、 DNA的二级结构是右手双螺旋 目 录 （一） DNA的碱基组成遵循 Chargaff法则 Cha

8、rgaff 规则 不同种属生物的 DNA碱基组成不同； 同一个体不同器官、不同组织的 DNA具 有相同的碱基组成； 对于一个特定的组织的 DNA，其碱基组 份不随其年龄、营养状态和环境而变化； 腺嘌呤与胸腺嘧啶的摩尔数相等，鸟嘌 呤与胞嘧啶的摩尔数相等。 A = T G C 目 录 不同生物来源的 DNA碱基组分的相对比例 来源 A G C T A/T G/C G+C 嘌呤 /嘧啶 大肠杆菌 26.0 24.9 25.2 23.9 1.09 0.99 50.1 1.04 结核杆菌 15.1 34.9 35.4 14.6 1.03 0.99 70.3 1.00 酵母 31.7 18.3 17.4

9、 32.6 0.97 1.05 35.7 1.00 猪 29.8 20.7 20.7 29.1 1.02 1.00 41.4 1.01 牛胸腺 28.2 21.5 22.5 27.8 1.01 0.96 44.0 0.99 牛脾 27.9 22.7 22.1 27.3 1.01 1.01 44.7 1.04 牛精子 28.7 22.2 22.0 27.2 1.06 1.01 44.2 1.04 人 30.4 19.9 19.9 30.1 1.01 1.0 39.8 1.01 包括 5-甲基胞嘧啶 比值偏离 1 ： 1是实验误差所致 目 录 DNA是反向平行 、 右手螺旋的 双链结构 两条多聚核

10、苷酸链 相互平行但走向相 反 ， 围绕着同一个螺旋轴形成右手双 螺旋结构 由脱氧核糖和磷酸基团构成的亲水性 骨架 （ backbone） 位于双螺旋结构的 外侧 ， 而疏水的碱基位于 内侧 。 直径 为 2 nm， 螺距为 3.4 nm 从外观上看 ， DNA双螺旋结构的表面 存在一个 大沟 （ major groove） 和一个 小沟 （ minor groove） （二） DNA二级结构是右手双螺旋 （ Watson, Crick, 1953） 目 录 DNA双链之间具有碱基互 补关系 碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側 ， 与对側碱基形成 氢键配对 （ 互补 配对形式： A=T; GC） 相邻碱

11、基平面距离 0.34nm， 螺 旋一圈螺距 3.4nm， 一圈 10对碱 基 目 录 DNA双链模型 目 录 碱基互补配对 T A G C 目 录 疏水作用力和氢键维系 DNA双螺旋结构的稳定 相邻的两个碱基对平面在旋进过 程 中 发 生 相 互 重 叠 （ overlapping） ， 由此产生了 疏水性的 碱基堆积力 （ base stacking interaction） 。 这种 碱基堆积力 和互补碱基对的 氢键 共同维系着 DNA双螺旋结 构的稳定 ， 并且碱基堆积力在双 螺旋结构的稳定中起着更为重要 的作用 。 目 录 （三） DNA双螺旋结构有多种类型 目 录 不同类型的 DNA

12、双螺旋结构 目 录 A 型 -DNA B 型 -DNA Z 型 -DNA 螺旋旋向 右手螺旋 右手螺旋 左手螺旋 螺旋直径 2.55 nm 2.37 nm 1.84 nm 每一螺旋的碱基对数目 11 10.5 12 螺距 2.53 nm 3.54 nm 4.56 nm 相邻碱基对之间的垂直距离 0.23 nm 0.34 nm 0.38 nm 糖苷键构象 反式 反式 嘧啶为反式 ,嘌呤为顺式，反式和顺式交替 相邻碱基对之间的转角 33 34.2 每个二聚体为 -60 使构象稳定的相对环境湿度 75% 92% 碱基对平面法线与主轴的夹角 19 1 9 大沟 窄深 宽深 相当平坦 小沟 宽浅 窄深

13、窄深 不同构象 DNA的结构参数 目 录 （四）某些状态下 DNA可形成多链结构 1. Hoogsteen碱基配对 形成三股螺旋 DNA H-DNA的结构 目 录 Watson-Grick和 Hoogsteen DNA螺旋中碱基对间氢键的位置 目 录 2 4条多聚鸟嘌呤核苷酸链形成四螺旋 DNA 目 录 二、 DNA在二级结构基础上形成超螺旋结构 （一）超螺旋结构具有不同的拓扑异构体 DNA在双螺旋结构基础上通过 盘绕和折 叠所形成的空间构象称为 三级结构 。 目 录 超螺旋结构 (superhelix 或 supercoil) 将 DNA的两端固定 ， 使之旋进过分或旋进不足 ， DNA双链

14、上就会产生额外的张力而发生扭曲 ， 以抵 消张力 。 这种扭曲称为 DNA双链的超螺旋结构 。 正超螺旋 (positive supercoil) 旋进过分的方向与 DNA双链的螺旋方向相同 负超螺旋 (negative supercoil) 旋进过分的方向与 DNA双链的螺旋方向相反 松弛态 DNA（ relaxed DNA） 在溶液中是以能量最低的状态存在的线性 DNA 。 目 录 正 超 螺 旋 D N A L k = 2 0 2 负 超 螺 旋 D N A L k = 1 9 8 松 弛 形 环 状 D N A L k = 2 0 0 D L k = - 2 D L k = + 2 目

15、 录 自然条件下的 DNA都是以负超螺旋的构象存在 的 ， 也就是说 ， DNA的实际螺旋数要少于它含有的碱 基对数目应该对应的螺旋数 。 负超螺旋状态有利于解开 DNA双链 。 DNA的复制 、 转录 、 组装等许多过程都需要解 开双链才能进行 。 生物体可以通过 DNA的不同超螺旋结构来控制 其功能状态 。 目 录 （二）原核生物 DNA和线粒体 DNA是环状 DNA的结构 原核生物的 DNA都是闭合环状的双螺旋结构 。 它在细胞内紧密缠绕形成了致密的小体 ， 称为 类核 （ nucleoid） 。 目 录 线粒体和叶绿体是真核细胞中含有核外遗传物质 的细胞器 。 线粒体 DNA(mito

16、chondrial DNA, mtDNA) 是一个封闭的双链环状分子 。 人 mtDNA全长 16,569个 碱基对 ， 共计 37个基因 , 分别编码 13个蛋白质 、 2个 rRNA、 22个 tRNA。 目 录 核小体 (nucleosome)是 染色质 的基本组成单 位 ， 由 DNA和蛋白质构成 。 1双链 DNA缠绕在组蛋白核心上构成核小体 DNA： 约 200bp 组蛋白： H1、 H2A、 H2B、 H3、 H4 （三）真核生物 DNA与组蛋白组成高度有序 的染色质 目 录 核小体的结构示意图 a. 组蛋白八聚体核心 b. 核小体 c. 直径 30nm纤维的剖面图显示 H1的位

17、置 d. 核小体组成串珠样的染色质 a c b d 目 录 目 录 2组蛋白是小分子量的碱性蛋白质 组蛋白 分子质量在 11kD到 21kD之间 ， 组蛋白中 富含精氨酸和赖氨酸 。 各种真核细胞都有 5种组蛋白 ， 但分子质量和氨基酸的顺序有些差异 。 在所有真核生 物中 H3， H4组蛋白氨基酸序列高度保守 ， 提示功能 是相同的 。 但是各种生物的 H1、 H2A、 H2B的相似 性很少 。 目 录 核小体 进一步组装成染色质 /染色体 1核小体组成 30nm纤维 2螺线管进一步折叠、包装为染色质和染色体 目 录 目 录 三、 DNA是生物遗传信息的载体 早在 20世纪 30年代 ， 人

18、们就已经知道了染色体是遗 传物质 ， 也知道了 DNA是染色体的组成部分 。 直到 Avery等人采用 细菌转化实验 （ 1944年 ） ， 后 经 Hershey和 Chase通过 同位素标记噬菌体 DNA感染细 菌实验 （ 1952年 ） 才直接证明了 DNA是遗传的物质基 础 。 （一） DNA是遗传的物质基础 目 录 DNA的遗传信息是以 基因 的形式存在的 。 基因 （ gene） 是编码 RNA或多肽的 DNA片段 ， 其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能 。 DNA利用四种碱基的不同排列对生物体的所 有遗传信息进行编码 ， 经过 复制 遗传给子代 ， 并 通过 转录 和 翻译 确

19、保生命活动中所需的各种 RNA 和蛋白质在细胞内有序合成 。 目 录 （二） DNA全部核苷酸序列组成基因组 基因组 （ genome） 就是一个生物体的全部遗传信息 ， 即 DNA的全部核苷酸序列 。 绝大多数生物个体的基因组 是 DNA， 但有些病毒的基因组是 RNA。 目 录 不同生物体的基因组 物种 总 DNA（ kbp） 染色体数 基因数 大肠杆菌 4 639 1 4 405 酵母 12 068 16 6 200 线虫 97 000 12/11 19 000 拟南芥 125 000 10 25 500 果蝇 180 000 18 13 600 水稻 480 000 24 57 000

20、 小鼠 2 500 000 40 30 000 35 000 人 3 200 000 46 30 000 35 000 玉米 3 000 000 20 鸡 2 100 000 78 注： 1. 酵母染色体数是单倍体数，野生酵母株通常含 8倍体或更多 2. 除酵母外的真核生物的染色体数均为双倍体数 3. 雌性线虫染色体是 12条，雄性 11条 目 录 DNA是生物遗传信息的载体，并为基因复制和转 录提供了模板。它是生命遗传的物质基础，也是 个体生命活动的信息基础。 DNA具有高度稳定性的特点，用来保持生物体系 遗传的相对稳定性。同时， DNA又表现出高度复 杂性的特点，它可以发生各种重组和突变，

21、适应 环境的变迁，为自然选择提供机会。 目 录 第三节 RNA的结构与功能 Structure and Function of RNA 目 录 RNA是 DNA的转录产物 。 RNA通常以单链线性形式存在 ， 但是可以通 过链内的碱基互补配对形成局部的双螺旋结 构 ， 进而形成三级结构 。 与 DNA相比 ， RNA的种类 、 大小 、 结构以及 稳定性表现出了多样化 ， 这与它们的功能多 样化密切相关 。 目 录 真核细胞内主要 RNA的种类和功能 种类 细胞定位 功能 信使 RNA messenger RNA (mRNA) 细胞核、细胞质、 线粒体 蛋白质的合成模板 非均一核 RNA he

22、terogeneous nuclear RNA (hnRNA) 细胞核 成熟 mRNA的前体 转运 RNA transfer RNA (tRNA) 细胞核、细胞质、 线粒体 转运氨基酸 核糖体 RNA ribosomal RNA (rRNA) 细胞核、细胞质、 线粒体 构成核糖体 非编码小 RNA small non-coding RNA (sncRNA) 细胞核、细胞质 参与 hnRNA的剪接和 转运、 rRNA加工、 基因表达调控等 目 录 一、信使 RNA结构含有氨基酸编码序列 hnRNA 内含子 (intron) mRNA * mRNA成熟过程 外显子 (exon) 目 录 （ 一 ）

23、 mRNA 5-末端具有帽结构 大多数真核 mRNA的 5末端均在转录后加上一 个 7-甲基鸟苷 ， 同时第一个核苷酸的 C-2也会被甲 基化 ， 形成帽子结构： m7GpppNm-。 mRNA的帽结构 可以与一类称为帽结合蛋白 （ cap binding proteins, CBP） 的分子结合 。 这种 结合对维持 mRNA的稳定性 、 将 mRNA从细胞核 转运到细胞质中 、 以及与核糖体以及翻译起始因 子的结合等密切相关 。 目 录 真核 mRNA的 5-末端 7-甲基鸟嘌呤核苷帽状结构及核糖甲基化 目 录 （ 二 ） mRNA 3-末端具有多聚 A的尾结构 大多数真核 mRNA的 3

24、末端是一段有 80250 个腺苷酸的多聚腺苷酸结构 ， 称为 多聚 A 尾 (poly(A)-tail) 。 多聚 A 尾 在 细 胞 内 与 poly(A) 结 合 蛋 白 poly(A)-binding protein, PABP相结合而存在 ， 每 10 20个腺苷酸结合一个 PABP单体 。 所以 ， 真 核细胞的 mRNA的 3-端实际上是一个 poly(A)和蛋 白质多聚体形成的复合物 。 目 录 mRNA核内向胞质的转移 mRNA的稳定性维系 翻译起始的调控 帽子结构和 多聚 A尾的功能 目 录 （ 三 ） mRNA含有氨基酸密码子 mRNA的功能是转录核内编码蛋白质信息 的 D

25、NA碱基排列顺序 ， 并携带至细胞质 ， 指导 蛋白质合成 。 mRNA分子从 5-末端的第一个 AUG(起始密 码子 )开始 ， 每 3个核苷酸为一组 ， 决定肽链上一 个氨基酸 ， 称为 三联体密码 (triplet code)或 密码 子 (codon)。 位于起始密码子和终止密码子之间 的核苷酸序列称为 开放阅读框 (open reading frame， ORF)， 可读框内的核苷酸序列决定了 多肽链的氨基酸序列 。 目 录 一条完整的 mRNA包括 5-非编码区 、 编码区和 3-非 编码区 。 编码区包括起始密码子 、 编码氨基酸的序列和终止 密码子 。 目 录 DNA mRNA

26、 蛋白 转录 翻译 原核细胞 细胞质 细胞核 DNA 内含子 外显子 转录 转录后剪接 转运 mRNA hnRNA 翻译 蛋白 真核细胞 目 录 （一） tRNA分子含有稀有碱基 含 10 % 20% 稀有碱基，如 DHU 3末端为 CCA-OH 5末端大多数为 G 具有 TC 二、转运 RNA含有接纳氨基酸和 mRNA 识别序列 目 录 N N H N H N N O C H 3 C H 3 N N N H N NH C H 2 C H C C H 3 C H 3 N H N H O O H H H H N H N H S O N,N二甲基鸟嘌呤 N6-异戊烯腺嘌呤 双氢尿嘧啶 4-巯尿嘧啶

27、 稀有碱基 目 录 tRNA中常见的稀有碱基 目 录 氨基酸 臂 额外环 （ 二 ） tRNA有 “ 三叶草 ” 样二级结构和倒 “ L”形三级结 构 环 氨基酸臂 DHU环 反密码环 目 录 A U A A C A C C GC G G C U U U U G A A A A C G G G G G G U C G A C A C GU GU C G G T A U G C C UC A A A A D D GC GC A U U Cm G m A Y C 5 G 7 G 2 2 O H -3 5 75 70 65 60 55 50 40 35 30 25 20 15 10 5 p A 1

28、G 2 G 7 环 氨基酸臂 DHU环 反密码环 反密码子 tRNA三级结构及氢键的位臵 目 录 氨基酸 臂 额外环 有些氨基酸只有一种 tRNA作为载体 ， 而另外的 一些氨基酸则需要几种 tRNA作为载体 。 目 录 （ 三 ） tRNA有识别 mRNA密码的反密码子 * tRNA的功能 活化 、 搬运氨基酸到核糖体 ， 参与蛋白质的翻译 。 5 反 密 码 子 密 码 子m R N A 3 GUA U A C A C C 酪 氨 酸 目 录 * rRNA的结构 三、核糖体 RNA与核糖体蛋白组成核糖体 目 录 * rRNA的种类（根据沉降系数） 真核生物 5S rRNA 28S rRNA

29、 5.8S rRNA 18S rRNA 原核生物 5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA （一）原核、真核 rRNA分子质量不同 目 录 核糖体的组成 原核生物（以大肠杆菌为例） 真核生物（以小鼠肝为例） 小亚基 30S 40S rRNA 16S 1542个核苷酸 18S 1874个核苷酸 蛋白质 21种 占总重量的 40% 33种 占总重量的 50% 大亚基 50S 60S rRNA 23S 5S 2940个核苷酸 120个核苷酸 28S 5.85S 5S 4718个核苷酸 160个核苷酸 120个核苷酸 蛋白质 31种 占总重量的 30% 49种 占总重量的 35% 目 录 r

30、RNA与 核 糖 体 蛋白质共同构成 核 糖 体 ， 是 蛋白质生物合成的场所 ：为肽链合成所需要 的 mRNA、 tRNA、 多种蛋白因子提供了相互结 合的位点和相互作用的空间环境 。 （三） rRNA参与组成的核糖体是蛋白质 翻译的场所 目 录 四、非信使小 RNA具有多样性 除了上述三种 RNA外 ， 细胞 内 存在的许多 其他种类的小分子 RNA， 统称为 非信使小 RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。 snmRNAs 非编码 RNA(non-coding RNA)专指那些具 有调节作用的小 RNA， 如 siRNA、 miRNA等 。 目 录

31、 snmRNAs的 种类 核内小 RNA（ small nuclear RNA， snRNA） 核仁小 RNA（ small nucleolar RNA， snoRNA） 胞质小 RNA（ small cytoplasmic RNA， scRNA） 催化性小 RNA（ small catalytic RNA） 小干扰 RNA（ small interfering RNA, siRNA） 微 RNA（ microRNA， miRNA）等 在 hnRNA和 rRNA的转录后加工 、 转运中发挥作用 ， 有的参与基因表达调控等；是现代生物学研究的新领域 。 目 录 真核细胞内重要的 snmRNAs

32、种类 英文名称 生物学功能 核内小 RNA small nuclear RNA (snRNA) 参与 hnRNA剪接，包括U1、 U2、 U4、 U5、 U6 核仁小 RNA small nucleolar RNA (snoRNA) 参与 rRNA核糖 C-2的甲基化 胞质小 RNA small cytoplamsic RNA (scRNA) 催化小 RNA small catalytic RNA RNA剪接，包括核酶等 小干扰 RNA small interference RNA(siRNA) 参与转录后调节；对外源入侵 RNA基因的切割 目 录 （一）核内小 RNA与核糖核蛋白结合共同参与

33、 mRNA前体加工 snRNA 长度（ nt） 剪接 hnRNA的靶位点 U1 U2 U4 U5 U6 U7 165 189 145 115 106 63 5-端 内含子腺苷酸分支点 5端，补充分支点 转酯化反应， 3剪接点， 使外显子连接 转酯化反应 组蛋白 H3前体的 mRNA3末端裂解 高等真核细胞 snRNA的特征 目 录 （二）催化性小 RNA参与 RNA剪接加工 一些小 RNA分子具有催化特定 RNA降解的活性 ， 在 RNA合成后的剪接中具有重要作用 。 这种具有催化 作用的小 RNA亦被称为 核酶 (ribozyme)或催化性 RNA (catalytic RNA) 。 （三）

34、核仁小 RNA参与 rRNA甲基化修饰 （四）小干扰 RNA特异阻断体内同源基因的表达 目 录 第 四 节 核 酸 的 理 化 性 质 Chemical and Physical Properties of Nucleic Acids 目 录 核酸的 酸碱及溶解度性质 核酸为多元酸，具有较强的酸性 。 可与金属离子成盐，不溶于乙醇或异丙醇 一、核酸具备多种基本物理化学性质 核酸中的 糖苷键 和 磷酸酯 键都能被酸、 碱和酶水解。 （一）核酸可被酸、碱水解 目 录 NH N N H N O NH 2 N H N N N O H NH 2G NH N H O O N N O H OH U NH N

35、 H O O C H 3 N N O H OH C H 3 T N N N H N N H 2 N H N NH N N H A N N H N H 2 O NH N H N H O C （二）核酸是两性分子 碱基可发生互变异构 碱基在体液环境中以碱性解离为主 核酸分子是酸性化合物 目 录 （三）核酸溶液具有高分子性质 黏滞度 ： DNA RNA dsDNA ssDNA 沉降系数 ： 溶液中的核酸在离心力场中可下沉。 DNA分子 经反复盘曲形成超螺旋后，其沉降系数增加，超螺 旋松解后其沉降系数减小。 目 录 （四）核酸具有紫外线吸收特性 核酸的紫外吸收（ OD260） 单核苷酸 ssDNA（或

36、 RNA） dsDNA 目 录 目 录 1. DNA或 RNA的定量 A260=1.0相当于 50g/ml双链 DNA 40g/ml单链 DNA（或 RNA） 20g/ml寡核苷酸 2. 判断核酸样品的纯度 DNA纯品 : A260/A280 = 1.8 RNA纯品 : A260/A280 = 2.0 A260的应用 目 录 二、核酸 变性、复性是很多分子生物学 技术操作的基础 定义 ： 核酸的变性（ denaturation）指 DNA双螺旋之间 的氢键断裂变成单链、或 RNA局部氢键断裂变成 线性单链结构的过程 方法： 过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素以及某些有 机溶剂如乙醇、丙酮等 变性

37、后其它理化性质变化： A260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失 （一）核酸变性是双链解离为单链的过程 目 录 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 目 录 （二）核酸变性时伴有增色效应 DNA的紫外吸收光谱 增色效应： DNA变性时其溶液 A260增高的现象 。 目 录 热变性 解链曲线： 如果在连续加热 DNA的过程中以温度对 A260值 作图 ， 所得的曲线称为解链曲线 。 融 解 温 度 T m 7 6 1 0 0 C9 69 28 88 48 0 0 . 5 0 0 . 7 0 0 . 6 5 0 . 6 0 0 . 5 5 光 密 度 （ 2 6

38、 0 n m ） 5 0 % 5 0 % 目 录 Tm： 变性是在一个相当窄的温度范围内完成 ， 在这一 范围内 ， 紫外光吸收值达到最大值的 50%时的温度称 为 DNA 的解链温度 ， 又称熔解温度 (melting temperature, Tm)。 影响因素 ： 1 DNA均一性决定熔解温度范围大小； 2 G-C碱基对含量决定熔解温度高低； 3 介质中的离子强度影响变性 。 Tm值是 DNA变性的重要参数 Tm值的经验公式是： Tm = 69.3+0.41（ %G+C） 目 录 （三）变性的 DNA可以复性 DNA复性 (renaturation)的定义 当变性条件缓慢地除去后，两条解

39、离的互补单链 可重新配对结合成为双螺旋结构，或恢复局部双螺旋 结构。这一现象称为 复性 。 减色效应 DNA复性时，其溶液 A260降低。 热变性的 DNA经缓慢冷却后才可复性，这一过 程称为 退火 (annealing) 。 目 录 （四）利用变性、复性可进行分子杂交 将不同来源的 DNA混合在一起 ， 经热变性后 ， 让其慢 慢冷却复性 。 若这些异源 DNA之间在某些区域具有互补的序 列 ， 复性时就会形成 杂化双链 （ heteroduplex） 。 这种杂化双链可以在不同的 DNA单链之间形成 ， 也可 在 RNA单链之间形成 ， 甚至还可以在 DNA单链和 RNA单链 之间形成 ，

40、 其前提条件是两种单链分子之间存在着一定程度 的 碱 基 配 对 关 系 。 这 种 现 象 称 为 核 酸 分子杂交 （ hybridization） 。 目 录 目 录 DNA-DNA 杂交双链分子 变性 复性 不同来源的 DNA分子 目 录 目 录 核酸分子杂交的应用 （ 1） Southern印迹 可检测 DNA （ 2） Northern印迹 用于检测 RNA 此外， 斑点印迹杂交 (Dot blot)和 DNA芯片 (DNA micray)技术也是 利用核酸杂交原理设计的。 目 录 三、核酸与其他分子的相互作用 从开始合成到完全降解 ， 核酸无时无刻地与其周围 环境中的分子发生各种

41、各样的相互作用 （ interaction） 。 这些分子可以是有机小分子 ， 也可以是生物大分子 。 这 些相互作用可以是特异性的 ， 也可以是非特异性的 。 作 用方式可以是共价的 ， 也可以是非共价的 。 作用部位可 以是核酸的碱基 ， 也可以是磷酸骨架或戊糖 。 核酸与蛋白质的相互作用最为常见。 目 录 四、核酸的化学修饰 核酸化学修饰 （ chemical modification） 可发 生在碱基 、 戊糖 ， 甚至磷酸基 。 构成 tRNA的稀有 碱基就是化学修饰的结果 。 最常见的碱基化学修 饰是 甲基化 （ methylation） 。 DNA的磷酸骨架中还能够发生 磷硫酰化

42、修饰 ，从而 解释了为什么硫元素结合到 DNA骨架上会使之降解的奥 秘。 目 录 第 五 节 核酸（水解）酶 Nucleases 目 录 核酸酶 (nuclease)是所有水解核酸的酶的统称 。 核酸酶种类多 ， 功能多样 。 在细胞内 ， 核酸酶的主要生理功能是参与 DNA的 损伤修复 、 转录后加工 、 核酸降解等核酸代谢过 程 ， 也是相关的分子生物学操作中常用工具酶 。 目 录 （一）按底物专一性分类 DNA酶 (deoxyribonuclease, DNase)： 专一降解 DNA RNA酶 (ribonuclease, RNase)： 专一降解 RNA 一、核酸酶有多种 目 录 （

43、二）按对底物作用方式不同分类 核酸内切酶： 分为限制性核酸内切酶和非特异性 限制性核酸内切酶 核酸外切酶： 53 或 35 核酸外切酶 （三）按对底物二级结构的专一性分类 双链酶： 作用于双链核酸 单链酶： 作用于单链核酸 目 录 二、核糖核酸酶是一类 RNA内切酶 （一）胰核糖核酸酶识别嘧啶核苷酸 （二）核糖核酸酶 T1识别鸟嘌呤核苷酸 （三）核糖核酸酶 T2识别腺嘌呤核苷酸 目 录 3种核酸酶作用位点 目 录 三、不同脱氧核糖核酸酶有不同的作用 方式和产物 （一）胰脱氧核糖核酸酶 可切割单链 /双链 DNA （二）脾脱氧核糖核酸酶 产物是 3-磷酸末端的寡 聚核苷酸 （三） 3外切酶活性是 BAL 31核酸酶的主要功能 （四）限制性内切核酸酶具有位点特异性 目 录 四、 N-糖苷酶可移去碱基 N-糖苷酶 （ glycosidase） 有多种 ， 各种非特异 或碱基特异的糖苷酶可以水解核苷酸的 N-糖苷键 ， 去除核苷酸的碱基 。