《分子生物学第四次》PPT课件.ppt

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1、DNA复 制 的 特 点 ：1.DNA 半 保 留 复 制2.半 不 连 续 复 制3.需 要 引 物4. 多 为 双 向 等 速 复 制5.有 一 定 的 复 制 起 始 点6.DNA复 制 的 保 真 性 2.DNA复 制 的 几 种 方 式(1).线 性 DNA复 制 的 方 式多 数 为 双 向 复 制 ， 多 个 起 始 位 点 ， 复 制 叉 处 有 眼 状 结 构 ，称 为 复 制 眼 。 线 性 DNA复 制 子 末 端 复 制 1.转 变 为 环 状 或 多 聚 分 子 2.在 DNA末 端 形 成 发 夹 式 结 构 3.在 某 种 蛋 白 的 介 入 下 ， 在 真 正

2、的 末 端 复制 4.真 核 生 物 线 性 染 色 体 由 端 粒 酶 负 责 新 合成 链 5端 RNA引 物 切 除 后 的 填 补 端 粒 结 构 3 5 35 端 粒 结 构端 粒 酶 是 含 RNA的 逆 转 录 酶端 粒 酶 与 细 胞 老 化 有 关端 粒 （ telomeres） ： 是 真 核 细 胞 染 色 体 末端 所 特 有 的 结 构 ， 有 许 多 串 （ 1000串 或 更 多 ）短 的 重 复 序 列 组 成 ， 通 常 3末 端 链 是 富 含 G的短 序 列 。端 粒 酶 :含 有 RNA和 蛋 白 质 （ 起 DNA聚 合 酶 的作 用 ） 两 种 组

3、分 ， RNA分 子 约 150b， 含 有 与 重复 端 粒 结 构 互 补 的 一 个 片 断 ， 可 作 为 端 粒 链 合成 的 模 板 。 (2).环 状 DNA复 制 方 式A.复 制 B. 滚 环 复 制 也 叫 复 制 C. 置 换 式 （ Displacement form ） 又 称 D 环 复制 两 条 链 的 合 成高 度 不 对 称 ,一 条 链迅 速 合 成 出 互 补 链 ,另 一 条 则 形 成 游 离的 单 链 环 (D-环 ) 线 粒 体 和 叶 绿 体 DNA的 复 制 方 式 DNA 复 制 的 调 控原 核 生 物 的 调 控 ， DNA链 的 延 伸

4、 速 度 恒 定 ，复 制 叉 的 数 量 决 定 细 胞 生 长 和 增 值 速 度 。 ColEI 质 粒 DNA 的 复 制 调 控 DNA编 码 两 个 负 调 控 因 子 ， Rop 蛋 白 和 反 义 RNADNA复 制 方 向起始点RNA前 体 100 200 300 400 500 600-500 -400 -300 -200 -100RNA1 Rop基因Rop蛋白63个aaRnaseH 真 核 细 胞 DNA 的 复 制 调 控真 核 细 胞 的 生 活 周 期 分 为 4个 时 期 G1复制 预 备 期 、 S复 制 期 、 G2有 丝 分 裂 准 备期 、 M有 丝 分

5、裂 期真 核 生 物 复 制 有 3个 水 平 的 调 控细 胞 生 活 周 期 水 平 调 控 ， 决 定 细 胞 停 留 在 G1期 还 是进 入 S期染 色 体 水 平 ， 决 定 不 同 染 色 体 或 同 一 染 色 体 不 同 部位 的 复 制 子 按 一 定 顺 序 起 始 复 制复 制 子 水 平 调 控 ， 决 定 复 制 的 起 始 与 否 MG1G2S 聚 合 酶 链 式 反 应 PCR聚 合 酶 链 式 反 应 （ Polymerase Chain Reaction， PCR） 是 体 外 酶 促合 成 特 异 DNA片 段 的 一 种 方 法 ， 为 最 常 用 的

6、分 子 生 物 学 技 术典 型 的 PCR由 （ 1） 高 温 变 性 （ 2） 引 物 与 模 板 退 火 ； （ 3） 引 物 沿 模 板 延 伸三 步 反 应 组 成 一 个 循 环 ， 通 过 多 次 循 环 反 应 ， 使 目 的 DNA得 以 迅 速扩 增 。 其 主 要 步 骤 是 ： 将 待 扩 增 的 模 板 DNA置 高 温 下 （ 通 常 为 93 -94 ） 使 其 变 性 解 成 单 链 ； 人 工 合 成 的 两 个 寡 核 苷 酸 引 物 在 其 合 适的 复 性 温 度 下 分 别 与 目 的 基 因 两 侧 的 两 条 单 链 互 补 结 合 ， 两 个 引

7、 物在 模 板 上 结 合 的 位 置 决 定 了 扩 增 片 段 的 长 短 ； 耐 热 的 DNA聚 合 酶（ Taq酶 ） 在 72 将 单 核 苷 酸 从 引 物 的 3 端 开 始 掺 入 ， 以 目 的 基 因为 模 板 从 5 3 方 向 延 伸 PCR能 在 （ pg） 水 平 起 始 DNA混 合 物 中 的 目 的 基 因 扩 增 达 到 纳 克 、 微 克 、 毫 克 级 的 特 异 性 DNA片 段 。 因 此 ， PCR技 术 一 经 问 世 就 被 迅 速 而广 泛 地 用 于 分 子 生 物 学 的 各 个 领 域 。 它 不 仅 可 以 用 于 基 因 的 分

8、离克 隆 和 核 苷 酸 序 列 分 析 ， 还 可 以 用 于 突 变 体 和 重 组 体 的 构 建 。 课 后 复 习 题 ：DNA半 保 留 复 制DNA 的 半 不 连 续 复 制复 制 子复 制 叉如 果 细 菌 环 状 染 色 体 的 复 制 是 双 向 的 ， 并 且 从 固 定 的 复制 起 点 开 始 ， 每 个 复 制 叉 以 16um/min的 速 度 移 动 ， 细 菌染 色 体 长 1280um,完 成 整 个 染 色 体 复 制 需 要 多 少 时 间 ？ 当细 菌 在 营 养 丰 富 的 培 养 基 每 20min 分 裂 一 次 ， 也 就 是 说第 一 轮

9、复 制 尚 未 完 成 就 开 始 第 二 轮 复 制 ， 此 时 染 色 体 有几 个 复 制 叉 ？ DNA损 伤 的 后 果信 号 传 导 异 常 老 化 肿 瘤 疾 病异 常 增 生 和 代 谢生 理 功 能 紊 乱 细 胞 死 亡细 胞 增 殖 减 少 基 因 表 达 异 常基 因 组 不 稳 定 五 、 DNA 的 修 复DNA 修 复 系 统 功 能错 配 修 复 恢 复 错 配碱 基 切 除 修 复 切 除 突 变 的 碱 基核 苷 酸 切 除 修 复 修 复 被 破 坏 的 DNADNA 直 接 修 复 修 复 嘧 啶 二 体 或 甲 基 化DNA大 肠 杆 菌 中 DNA的

10、 修 复 系 统 1.错 配 修 复大 肠 杆 菌DNA 甲 基 化 位 点新 合 成 的 DNA Mis-paired bases 错 配 修 复 2.直 接 修 复紫 外 线 可 引 起 DNA的 交 联 , DNA与 蛋 白 质 的 交 联 。 DNA紫 外 线 损 伤 的 光 复 合 酶 直 接 修 复 3.碱 基 切 除 修 复指 切 除 和 替 换 由 内 源 性 化 学 物 作 用 产 生 的 DNA碱 基 损 伤 , 是 切 除 修 复 的 一 种 。受 损 碱 基 移 除 是 由 多 个 酶 来 完 成 的 。主 要 针 对 DNA单 链 断 裂 和 小 的 碱 基 改 变

11、及 氧 化 性 损 伤 。 缺 失 碱 基 位 点DNA糖 苷 水 解 酶 Base Excision Repair 4.核 苷 酸 切 除 修 复 体 内 识 别 DNA 损 伤 最 多 的 修 复 通 路 主 要 修 复 扭 曲 双 螺 旋 结 构 的 DNA 损 伤 修 复 时 切 除 含 有 损 伤 碱 基 的 那 一 段 DNA 。 核 苷 酸 切 除 修 复 (基 因 组 修 复 人 ) 5.DNA的 重 组 修 复是 复 制 后 的 修 复DNA链 的 损 伤 并 未 除 去一 直 只 存 在 母 链 上 ！ ！ 若 干代 后 相 当 于 被 稀 释 。胸 腺 嘧 啶二 聚 体

12、6.SOS修 复为 DNA的 损 伤 所 诱 导 ， 而 产 生 缺 乏 校 对 功能 的 DNA聚 合 酶 ， 它 能 在 DNA损 伤 部 位 进行 复 制 而 避 免 了 死 亡 ， 可 是 却 带 来 了 高 的突 变 率 （ 所 以 会 有 2种 结 果 ： 修 复 或 变 异 （ 进 化 ） ，这 属 于 倾 向 差 错 的 修 复 。 1、 反 向 重 复 序 列 与 二 级 结 构 反 向 重 复 序 列 （ inverted repeatitive sequence or inverted repeats IR） 又 称 回 文 序 列 （ 廻 文 ） ： 指 两 段 同 样

13、 的 核 苷 酸 序 列 同时 存 在 于 一 个 分 子 中 ， 但 具 有 相 反 的 方 向 . 有 时 也 有 不 完 全 相 同 的 情 况 RNA和 DNA中 都 可 能 存 在 此 外 还 可 有 directed repeatitive sequence -正 向 重 复 序 列一 些 DNA序 列 的 不 寻 常 结 构 C 反向重复序列间间隔较短或无间隔反向重复序列间间隔较长 * 较 短 的 回 文 序 列 可 能 是 作 为 一 种 信 号 如 ： 限 制 性 内 切 酶 的 识 别 位 点 一 些 调 控 蛋 白 的 识 别 位 点 例 如 限 制 性 内 切 酶 Ec

14、oR 的 识 别 位 点 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 六 、 转 座 基 因 组 是 相 对 稳 定 的 ， 基 因 组 中 的 序 列通 常 处 于 恒 定 的 位 置 。 因 此 ， 我 们 可 以通 过 构 建 遗 传 图 谱 (genetic map)来 鉴 定已 知 基 因 的 基 因 座 。 在 分 子 水 平 上 ， 每 个 个 体 基 因 组 之 间 的差 异 主 要 由 重 组 引 起 ， 但 转 座 元 件（ transposable element） 或 转 座 子（ transposons） 的 存 在 也 可 以 造 成 基 因组 的 改 变 。 1.

15、转 座 子 的 概 念 及 发 现 转 座 子 (transposon 或 transposable element)是 基 因 组 内 相 对 独 立 的 、 可 移 动序 列 ， 它 们 不 必 借 用 噬 菌 体 或 质 粒 的 形 式就 可 以 从 基 因 组 的 一 个 部 位 直 接 转 移 到 另一 个 部 位 ， 这 个 过 程 称 为 转 座（ transposition） 转 座 子 每 次 移 动 时 携 带 着 转 座 必 需 的 基 因一 起 在 基 因 组 内 跃 迁 ， 所 以 转 座 子 又 称 跳跃 基 因 （ jumping gene） 转 座 元 件 首

16、先 是 由 Barbara McClintock于 40年 代 在 玉 米 的 遗 传 学 研 究 中 发 现 的 ，她 称 之 为 控 制 元 件 （ controlling element） ， 因 为 它 不 仅 能 够 在 基 因 组 内转 移 ， 而 且 还 能 够 改 变 基 因 的 活 性 并 引起 功 能 的 改 变 。 现 在 认 为 转 座 子 存 在 于 地 球 上 所 有 的 生物 。 2 特 点 ： 转 座 子 是 基 因 组 的 正 常 组 成 成 分 ， 不 以 独 立 的形 式 存 在 （ 如 噬 菌 体 或 质 粒 DNA） 。 不 必 借 助 同 源 序 列

17、 就 可 移 动 的 DNA片 段 ， 即 转 座作 用 与 供 体 和 受 体 之 间 的 序 列 无 关 。 原 核 生 物 和 真 核 生 物 均 有 转 座 子 。 转 座 序 列 可 沿 染 色 体 移 动 ， 甚 至 在 不 同 染 色 体间 跳 跃 。 转 座 以 很 低 的 频 率 发 生 ， 而 且 转 座 子 的 插 入 是随 机 的 ， 3 种 类 与 特 征 （ A 插 入 序 列 最 简 单 ， 是 细 菌 染 色 体 、 质 粒 和 某 些 噬 菌 体 的正 常 组 分 ， 是 一 个 自 主 的 单 位 ， 每 种 IS均 编 码 自 身转 座 所 需 的 蛋 白

18、 质 。 命 名 ： IS 编 号 （ 鉴 定 类 型 ） 长 度 700 2000bp 每 种 IS元 件 具 有 不 同 序 列 ， 但 有 共 同 的 组 织 形 式 B 复 合 转 座 子 表 示 法 ： 通 常 以 Tn和 后 面 加 上 数 码 表 示 ， 如 Tn903。 结 构 : a. 除 有 转 座 酶 基 因 外 还 有 其 它 表 型 基 因 ， 如 ： 抗 药 基 因 ， 使 宿 主 具 表 性 效 应 。b. 两 侧 有 重 复 序 列 。c. 有 的 转 座 子 的 重 复 顺 序 就 是 IS。 功 能 ： 和 IS 一 样 可 以 从 一 个 位 点 转 座

19、到 另 一 个 位 点 。 Tn1681大 肠 杆 菌 热 稳定 毒 素 I 基 因552 bpIR IR IR IR复 合 转 座 子 结 构 示 意 图IS1 IS1 a) TnA family l 具 有 IR、 转 座 酶 基 因 、 调 节 基 因 （ 解 离 酶 ） 、 抗 抗 生 素 基 因 2.5 kb 20 kb Tn3 IR TnpA TnpR AmpR IR 38bp 38bp 转 座 酶 regulator - 内 酰 胺 酶 两 种 类 型 b） 两 端 重 复 序 列 为 IS的 复 合 转 座 子 e.g. IS插 入 到 功 能 基 因 两 端 ， 可 能 形

20、成 复 合 转 座 因 子 IS IS IS IS L IS R臂 中 心 区 臂 transposition 当 两 个 IS组 件 相同 时 ， 其 中 任 一 个 都可 行 使 转 座 功 能 两 侧 的 IS既 可 以 是IR， 又 可 以 是 DR状 态（ IR多 ） 4. 转 座 发 生 的 机 制 转 座 子 插 入 到 一 个 新 的 部 位 的 通 常 步 骤是 ： 在 靶 DNA上 制 造 一 个 交 错 的 切 口 ， 然后 转 座 子 与 突 出 的 单 链 末 端 相 连 接 ， 并填 充 切 口 。 交 错 末 端 的 产 生 和 填 充 解 释 了 在 插 入 部

21、位 产 生 靶 DNA正 向 重 复 的 原 因 。 链 的 切 口之 间 的 交 错 决 定 了 正 向 重 复 的 长 度 。 1） 复 制 型 转 座 模 式 （ replicative transposition） 复 制 型 转 座复 制 型 转 座 转 座 元 件 作 为 一 个 物 理 实 体 直 接 由 一 个部 位 转 移 到 另 一 个 部 位 。 除 了 引 起 在 新 部 位 序 列 插 入 的 简 单 分 子间 转 座 之 外 ， 转 座 子 还 能 促 进 其 他 类 型的 DNA重 排 。 任 何 一 对 正 向 重 复 序 列 之 间 的 重 组 会 导致 它

22、们 的 序 列 的 缺 失 ； 而 一 对 反 向 重 复序 列 之 间 的 交 互 重 组 可 能 使 重 复 序 列 之间 的 序 列 被 倒 位 ， 而 重 复 序 列 本 身 被 保留 。 玉 米 中 的 控 制 因 子 包 括 ： 自 主 型 因 子 ， 具 有 自 主 剪 接 和 转 座 的 功 能 非 自 主 性 因 子 ， 单 独 存 在 时 很 稳 定 ， 只 当 基 因 组 中 存 在 与 非 自 主 性 因 子 同 家 族 的 自 主 性 因 子 时 才 具 备 转 座 功 能 。 同 一 家 族 的 自 主 性 因 子 能 为 非 自 主 性 因 子 提 供 转 座 酶

23、 。 玉 米 中 转 座 子 的 特 点玉 米 转 座 子 具 有 典 型 的 IS特 征 ， 转 座 子 两 翼 有两 个 倒 转 重 复 序 列 ， 在 靶 DNA插 入 位 点 有 两 个 短的 正 向 重 复 序 列 。在Ac-Ds体系中： Ac转座子的两翼有11bp的倒转重复序列， 在靶DNA位点复制形成8bp正向重复 Ds 是Ac 转座子的缺失体，但两端转座序 列特征完整，如果细胞内有相应的转座酶 活性Ds 就能恢复转座性能 玉 米 转 座 因 子 对 胚 乳 颜 色 的 影 响 果 蝇 中 的 转 座 子诱 发 果 蝇 不 育 的 P转 座 子 ， 几 乎 所 有 的 杂 种 不

24、 育 都 由 P转 座 子 插 入 基 因 组 W位 点 引 起 的P: 两 翼 有 31bp倒 置 重 复 ， 靶 DNA产 生 8bp的 重 复 序 列P转 座 子 产 生 原 初 转 录 产 物 约 为 2.5或 3.0kb体 细 胞 内 内 含 子 3不 被 切 除卵 细 胞 内 内 含 子 3被 切 除转座酶 有 P 因子 转座 P 品 系 (P P ) 雄 性 染 色 体 雌 性 染 色 体 P细 胞 型 阻 遏 物 P 因 子 P因 子 66KD阻 遏 物 抑 制 所 ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 66K P M 雄 性 染 色

25、体 雌 性 染 色 体 P细 胞 型 P 因 子 P因 子 合 成 转 ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 座 酶 87K 杂 种 不 育 M P 雄 性 染 色 体 雌 性 染 色 体 P细 胞 型 阻 遏 物 无 P 因 子 P因 子 66KD阻 遏 物 抑 制 所 ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 66K 有 P因 子 转 座 图 23-57 杂 种 不 育 取 决 于 基 因 组 中 P 因 子 和 不 同 类 型 细 胞 中 66KD 阻 遏 物 的 相 互 作 用 。 (仿 B.Lewin: GENES ,1997, Fig.18.27) 转 座 的 遗 传 效 应转 座

26、 引 起 插 入 突 变转 座 可 以 产 生 新 的 基 因转 座 产 生 染 色 体 积 畸 变转 座 引 起 生 物 进 化 反 转 录 转 座 子(retrotransposon或 retroposon) 指 通 过 RNA为 中 介 ， 反 转 录 成 DNA后 进行 转 座 的 可 动 元 件 。 这 样 的 转 座 过 程 称为 反 转 座 作 用 (retrotransposition)。 反 转 座 作 用 出 现 在 真 核 生 物 ， 包 括 能 自 由 地 感 染宿 主 细 胞 的 反 转 录 病 毒 ， 以 及 通 过 以 RNA为 中 介进 行 转 座 的 DNA序

27、 列 。除 反 转 录 病 毒 外 ， 反 转 录 转 座 子 可 以 分 成 两 类 ：一 类 是 病 毒 超 家 族 (viral superfamily)， 这 类 反 转 录转 座 子 编 码 反 转 录 酶 或 整 合 酶 (integrases)， 能 自 主地 进 行 转 录 ， 其 转 座 的 机 制 同 反 转 录 病 毒 相 似 ，但 不 能 像 反 转 录 病 毒 那 样 以 独 立 感 染 的 方 式 进 行传 播 长 末 端 重 复 序 列 (1ong terminal repeats， LTR) ； 另一 类 是 非 病 毒 超 家 族 (nonviral superfamily)， 自 身没 有 转 座 酶 或 整 合 酶 的 编 码 能 力 ， 而 在 细 胞 内 已有 的 酶 系 统 作 用 下 进 行 转 座 。 课 后 复 习 题 ：1.简 述 转 座 的 机 理 ？2.DNA修 复 的 类 型 与 机 理 ？