工程合成生物构建技术1课件

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1、现代制药工艺学现代制药工艺学-生物制药工艺研究生物制药工艺研究赵广荣赵广荣2014-10-22现代制药工艺学现代制药工艺学-生物制药部分的基本要求生物制药部分的基本要求(1)了解前沿进展了解前沿进展(2)掌握基本原理和技术掌握基本原理和技术(3)能设计相关工艺实验研究的技术方案能设计相关工艺实验研究的技术方案(4)重点掌握授课内容重点掌握授课内容(5)下载相关文献下载相关文献,掌握其中核心知识和技术掌握其中核心知识和技术主要内容主要内容第一讲第一讲工程生物的构建原理与技术工程生物的构建原理与技术第二讲第二讲青蒿素前体的合成生物技术青蒿素前体的合成生物技术第三讲第三讲重组人干扰素产品创新与工艺研

2、究重组人干扰素产品创新与工艺研究工程生物engineeredorganismsn通过基因工程、转基因、合成生物学等工通过基因工程、转基因、合成生物学等工程技术创造的生物程技术创造的生物n重组微生物，合成微生物重组微生物，合成微生物n转基因植物转基因植物n转基因动物转基因动物工程生物工程生物n1998-2002年，欧盟第五框架计划实施细胞工厂年，欧盟第五框架计划实施细胞工厂(cellfactory)项目，其目的是全面了解应用微生物项目，其目的是全面了解应用微生物。n美国：生物学角度，美国：生物学角度，最小基因组最小基因组(minimizedgenome)是由一是由一套生物生存必需的最小基因组成。

3、套生物生存必需的最小基因组成。n日本：日本：2001年，年，从工业应用角度，具有最小基因组的工业微从工业应用角度，具有最小基因组的工业微生物就是最小基因组工厂（生物就是最小基因组工厂（minimizedgenomefactory）。最）。最小基因组工厂是具有工业生产必需基因，而非必需基因和有小基因组工厂是具有工业生产必需基因，而非必需基因和有害基因已经被删除的微生物。它不仅简单，而且是又容易工害基因已经被删除的微生物。它不仅简单，而且是又容易工业过程控制。业过程控制。n2002年年创办创办国际国际刊物刊物MicrobialCellFactories，报道微，报道微生物细胞作为重组蛋白、天然产物

4、的生产者，或生物转化的生物细胞作为重组蛋白、天然产物的生产者，或生物转化的催化剂等方面的研究进展和论文。催化剂等方面的研究进展和论文。n中国：中国：2010年以后，人工细胞工厂，人工生物体系，人工生年以后，人工细胞工厂，人工生物体系，人工生物系统物系统最小基因组工厂最小基因组工厂继人类基因组研究之后，生物领域一热门学科，是整继人类基因组研究之后，生物领域一热门学科，是整体系统论生物学思潮在工程学领域的再现。体系统论生物学思潮在工程学领域的再现。合成生物学（syntheticbiology）的概念合成生物学合成生物学按照人类的目的设计并创造新的生命元件器件，功按照人类的目的设计并创造新的生命元件

5、器件，功能模块乃至自然界不存在的生命系统能模块乃至自然界不存在的生命系统;对现有的生命对现有的生命体进行有意义的工程改造，赋予其新的功能。体进行有意义的工程改造，赋予其新的功能。合成生物学的核心思想是，认为生命的所有元件都合成生物学的核心思想是，认为生命的所有元件都能由化学方法来合成制造，并进而通过工程化方式能由化学方法来合成制造，并进而通过工程化方式组装成实用的生物体。组装成实用的生物体。19111911：柳叶刀柳叶刀，出现，出现“合成生物学合成生物学”20002000年以后，迅速发展，注意力转向该领域年以后，迅速发展，注意力转向该领域20042004年（年（MITMIT）Technolog

6、yTechnologyReviewReview，合成生物学评为，合成生物学评为“将将改变世界的十大新技术改变世界的十大新技术”之一之一20042004年开始，全球年开始，全球iGEMiGEM比赛（大学生遗传机器作品）比赛（大学生遗传机器作品）20042004年年6 6月：月：MITMIT，第，第1 1届合成生物学国际会议届合成生物学国际会议(SB 1.0)(SB 1.0)20052005年年5 5月：月：UCUC伯克利伯克利,SB 2.0,SB 2.0；20072007年年6 6月，瑞士，月，瑞士，SB 3.0SB 3.020082008年年1010月：香港，月：香港，SB 4.0SB 4.0

7、；20112011年年6 6月月:Stanford U,SB:Stanford U,SB 5.05.020132013年年7 7月，英国伦敦，月，英国伦敦，SB 6.0SB 6.020122012年，年，ACS Synthetic BiologyACS Synthetic Biology合成生物学的学术交流合成生物学合成生物学 概述2002年年Cello等合成脊髓灰质炎病毒的等合成脊髓灰质炎病毒的cDNA（Science,2002，297：1016-1018），），2005年年Endy等合成噬菌体等合成噬菌体T7基因组（基因组（MolSystemsBiology，2005，1：1-10）200

8、7年年CraigJ.Venter研究所（研究所（CJVI）实现了基因组的物）实现了基因组的物种间人工移植（种间人工移植（Science，2007，317:632-638）2008年该所人工全合成了生殖衣原体细菌基因组（年该所人工全合成了生殖衣原体细菌基因组（Science,2008，319：1215-1220）2009年利用酵母对克隆的基因组进行工程化组装（年利用酵母对克隆的基因组进行工程化组装（Science,2009，325:1693-1696），），2010年年CJVI合成活细菌合成活细菌20112011年合成酵母染色体臂年合成酵母染色体臂20142014年，合成酵母年，合成酵母IIII

9、II号染色体号染色体基因组合成的技术发展从头合成DNA的里程碑事件n1955,二聚体 dTdT(2 nt)n1968,酵母丙氨酸转移RNA(77 nt)n1981,人干扰素a(514 bp)n2002,脊髓灰质炎病毒(7501 bp)n2004,6脱氧红霉素内酯B合成酶基因簇DEBS(31656 bp)n2008,支原体基因组(582 970 bp)n2010,支原体细菌n2014，酵母染色体基因组工程基因组合成基因合成合成生物学合成生物学合成生物的单元合成生物的单元合成生物的设计与优化合成生物的设计与优化生物元器件生物元器件类型类型计算机计算机生命生命系统系统system全局全局全球网全球网

10、生命体生命体局部局部局域网局域网组织或器官组织或器官个体个体单台单台细胞细胞器件器件devices芯片芯片基因组，复制基因组，复制/转录转录/翻译装置翻译装置功能单功能单元元模块模块代谢途径代谢途径元件元件parts电子元电子元件件生物元件生物元件合成生物学与计算机工程的层阶比较 合成生物学合成生物学1 1、基因、基因元件元件基因基因（生物）元件：具有某种特定的生物学功能的（生物）元件：具有某种特定的生物学功能的DNADNA，是设计和合成生物的基本单位。，是设计和合成生物的基本单位。n特性：信号接受和输入功能，信号发送和产物输出功特性：信号接受和输入功能，信号发送和产物输出功能，调节信息流、代

11、谢和生物合成的功能，和其他元能，调节信息流、代谢和生物合成的功能，和其他元件相互作用，具有特定的工作环境。件相互作用，具有特定的工作环境。n功能元件：编码功能元件：编码1 1个个/组生化反应酶功能基因组生化反应酶功能基因/基因簇；基因簇；编码组成细胞组分蛋白质的基因编码组成细胞组分蛋白质的基因n界面调控元件界面调控元件:包括功能基因转录、蛋白质翻译与修包括功能基因转录、蛋白质翻译与修饰、功能酶反应等的调控基因。饰、功能酶反应等的调控基因。合成生物的单元合成生物学合成生物学生物元器件基因元件的图形编码-制图复制子 启动子 阻遏子 诱导子 终止子 RBS 功能基因 MCS 抗性 合成生物学合成生物

12、学生物元器件基因（生物）元件：具有某种特定的生物学功能基因（生物）元件：具有某种特定的生物学功能的的DNADNA，是设计和合成生物的基本单位。，是设计和合成生物的基本单位。生物部件：由一个或多个基因元件组成生物部件：由一个或多个基因元件组成最简单的能行使催化功能的生物部件是完整的最简单的能行使催化功能的生物部件是完整的编码酶基因表达盒。编码酶基因表达盒。启动区启动区功能基因功能基因终止区终止区合成生物学合成生物学生物元器件生物模块是一组细胞内区域化的生物部件，由内在功生物模块是一组细胞内区域化的生物部件，由内在功能联系在一起，执行特定的复杂功能。能联系在一起，执行特定的复杂功能。n如代谢途径、

13、信号转导途径、调控途径等。如代谢途径、信号转导途径、调控途径等。n模块：通过某种（逻辑模块：通过某种（逻辑/功能）关系把生物元件连接功能）关系把生物元件连接而成而成与电子科学中的电路类似，在合成生物学，不同功能与电子科学中的电路类似，在合成生物学，不同功能的生物砖联接后，能像电路一样运行，形象地称为基的生物砖联接后，能像电路一样运行，形象地称为基因线路（因线路（genetic circuitgenetic circuit）。）。按功能分为按功能分为:代谢线路代谢线路,调控线路调控线路,信号线路等信号线路等生物模块与基因电路合成生物学合成生物学生物元器件nEndy DEndy D提出了合成生物学

14、设计的工程策略：标准化、提出了合成生物学设计的工程策略：标准化、解耦联和抽提。解耦联和抽提。n标准化：确立基本生物元件的方法、对生物功能的定标准化：确立基本生物元件的方法、对生物功能的定义和特征描述。义和特征描述。n解耦联：复杂系统解分成具有独立功能的简单组分。解耦联：复杂系统解分成具有独立功能的简单组分。n抽提：建立元件和模块的层阶。抽提：建立元件和模块的层阶。合成生物的设计与优化合成生物学合成生物学生物元器件n抽提：一个反应对应一个酶，一个酶对应一个基因。抽提：一个反应对应一个酶，一个酶对应一个基因。n功能模式：基因表达调控的操纵子模型。功能模式：基因表达调控的操纵子模型。n优化：功能基因

15、密码子、启动子、核糖体结合位点。优化：功能基因密码子、启动子、核糖体结合位点。n适合于不同宿主表达的生物元件。适合于不同宿主表达的生物元件。1、生物元件的设计与优化合成生物学合成生物学生物元器件n生物砖构建基因电路的困难是，把相同功能的不同生生物砖构建基因电路的困难是，把相同功能的不同生物来源的生物砖集成基因电路后，不一定具有功能。物来源的生物砖集成基因电路后，不一定具有功能。n优化方法可以是基于数学模拟的理性设计，也可以是优化方法可以是基于数学模拟的理性设计，也可以是生物元件的直接进化。生物元件的直接进化。2.基因电路的设计与优化合成生物学合成生物学生物元器件iGEM（Internation

16、alGeneticallyEngineeredMachine）竞赛，在美国麻省工学院（）竞赛，在美国麻省工学院（MIT）收集）收集每年参赛者贡献的生物元器件，建立了标准生物元每年参赛者贡献的生物元器件，建立了标准生物元件库（件库（RegistryofStandardBiologicalParts）(http:/parts.igem.org)。经过经过10年的收集，该文库的元器件以年的收集，该文库的元器件以BBa为字头，为字头，容量已达到约容量已达到约2万个。万个。生物元件库生物元件库合成与装配数据库数据库RegulonDB中，大肠杆菌天然操纵基因中有中，大肠杆菌天然操纵基因中有1000余个启动

17、子，及其他功能元件序列。余个启动子，及其他功能元件序列。数据库数据库BIOFAB（InternationalOpenFacilityAdvancingBiotechnology，http:/biofab.org/data）有）有数千个人工合成并表征的启动子、核糖体结合位点等数千个人工合成并表征的启动子、核糖体结合位点等元件。元件。天津大学生物信息学中心建有必需基因数据库天津大学生物信息学中心建有必需基因数据库（http:/ AB BC CD DE EF FG G抽提抽提工程生物构建的基本过程基因元件设计基因元件设计基因线路合成基因线路合成制药工程生物制药工程生物功能底盘细胞功能底盘细胞遗传转化

18、遗传转化底盘细胞设计底盘细胞设计基因组编辑基因组编辑基因元件合成基因元件合成适配性筛选适配性筛选氨基酸，维生素，抗生素，抗癌药物，聚酮，萜类等氨基酸，维生素，抗生素，抗癌药物，聚酮，萜类等第一讲第一讲工程生物的构建原理与技术工程生物的构建原理与技术DNADNA体外重组技术体外重组技术/基因工程基因工程生物元件的组装技术生物元件的组装技术/元件工程元件工程基因组的编辑技术基因组的编辑技术/基因组工程基因组工程体体外外重重组组是是把把不不同同来来源源的的DNADNA分分子子用用特特异异性性酶酶切切割，然后将两者连接成杂合分子。割，然后将两者连接成杂合分子。体外重组的两大工具体外重组的两大工具:核酸

19、限制性内切酶和连接酶，如同剪刀和胶水。核酸限制性内切酶和连接酶，如同剪刀和胶水。DNA片段1DNA片段2酶切酶切可连接的片段可连接的片段载体载体重组重组DNA分子分子连接酶连接酶DNA元件的体外重组元件的体外重组基因的体外重组基因的体外重组基基因因重重组组示示意意图图载体载体/质粒质粒酶：限制性内切酶，连接酶，聚合酶酶：限制性内切酶，连接酶，聚合酶DNA体外重组工具基因元件载体基因元件载体载体载体kb容量容量kb宿主宿主导入方式导入方式复制子复制子质粒载体质粒载体 3-55-10Ec转化转化ColE1噬菌体噬菌体30-447-23Ec转导转导ColE1黏粒黏粒5-830-45Ec转导转导Col

20、E1P13070-100Ec转导转导P1PAC20130-150Ec电转化电转化P1BAC7-9120-300Ec电转化电转化FYAC10-15250-2000Yeast转化转化ARS载体载体/质粒质粒VectorVector：基因的携带者：基因的携带者复制起始点复制起始点选择标记选择标记多克隆位点多克隆位点质粒载体质粒载体基因元件的载体基因元件的载体1.1.结构结构自主复制性自主复制性:复制起始点以及控制复制频率的调控基因。复制起始点以及控制复制频率的调控基因。不不相相容容性性:具具有有相相同同或或相相似似复复制制子子结结构构及及特特征征的的的的质质粒粒不不能稳定地存在于同一受体细胞内。能稳

21、定地存在于同一受体细胞内。转移性：转移性：从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞。从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞。选择标记：选择标记：抗生素抗性基因等。抗生素抗性基因等。表达功能表达功能:能转录、翻译合成外源基因的产物。能转录、翻译合成外源基因的产物。基因元件的载体基因元件的载体2.质粒的特性质粒的特性克隆质粒：克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。用于克隆和扩增外源基因。测序质粒：测序质粒：用于基因测序。用于基因测序。整合质粒：整合质粒：用于外源基因与宿主染色体用于外源基因与宿主染色体整合。整合。穿梭质粒：穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在能在两种宿主细胞存在。表达质粒：表达质粒：能表达基因产物。能

22、表达基因产物。基因元件的载体基因元件的载体3.质粒的类型质粒的类型v噬噬菌菌粒粒载载体体：由由丝丝状状噬噬菌菌体体DNADNA复复制制起起始始位位点点序序列与质粒组成的杂合分子。列与质粒组成的杂合分子。vM13M13噬菌体间隔区克隆到质粒上，形成噬菌粒。噬菌体间隔区克隆到质粒上，形成噬菌粒。v特点特点：象质粒一样，自主复制而稳定遗传。象质粒一样，自主复制而稳定遗传。象噬菌体一样，包装成颗粒，分泌胞外。象噬菌体一样，包装成颗粒，分泌胞外。基因在基因在M13M13载体和质粒载体之间的转移。载体和质粒载体之间的转移。v激激活活过过程程：辅辅助助丝丝状状噬噬菌菌体体感感染染带带有有噬噬菌菌粒粒的的受受

23、体体细细胞胞，反反式式激激活活噬噬菌菌粒粒上上的的间间隔隔区区位位点点，启启动动噬噬菌菌粒粒以以丝丝状状噬噬菌菌体体DNADNA的的复复制制模模式式进进行行复复制制。分别包装成颗粒并分泌到受体细胞外。分别包装成颗粒并分泌到受体细胞外。基因元件的载体基因元件的载体噬菌粒载体噬菌粒载体含有噬菌体含有噬菌体f1f1间隔区的载体：间隔区的载体：pBS，pGEM11Zf，pBluescript。基因元件的载体基因元件的载体由由 DNA DNA的的coscos区与质粒区与质粒DNADNA重组而成，重组而成，主要用于基因文库的构建。主要用于基因文库的构建。DNA cosDNA cos位点及其位点及其附近区域

24、的附近区域的DNADNA片段片段为为1.7 kb1.7 kb质粒质粒DNADNA为为3.3 kb3.3 kb构成的黏粒总共构成的黏粒总共5 kb5 kb最大装载量达最大装载量达45 kb45 kb基因元件的载体基因元件的载体黏粒载体，考斯质粒黏粒载体，考斯质粒大肠杆菌-哺乳动物细胞穿梭载体pUC复制子，C31整合酶，位点特异性整合在链霉菌基因组的att位点oriT大肠杆菌与链霉菌接合转移aac3(IV)安普抗性基因，大肠杆菌和链霉菌中筛选标记BamHI克隆位点：天然产物生物合成基因簇大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pRS313,大肠杆菌-酵母穿梭载体酵母复制子酵母复制子大肠杆菌筛选标记大肠杆菌筛选标记

25、大肠杆菌复制子大肠杆菌复制子酵母筛选标记酵母筛选标记多克隆位点多克隆位点大肠杆菌-链霉菌-酵母穿梭载体大肠杆菌-棒杆菌穿梭载体KanR，可移动整合表达载体整合表达载体游离表达载体游离表达载体概念：概念：在特异位点上催化双链在特异位点上催化双链DNADNA分子的断裂，分子的断裂，产生相应的限制性片段。产生相应的限制性片段。种类：种类：I I类限制性内切酶：类限制性内切酶：识别位点和切点不同，切断识别位点和切点不同，切断部位不定。部位不定。IIII类限制性内切酶：严格识别类限制性内切酶：严格识别,特异性切割。特异性切割。IIIIII类限制性内切酶：特异性切割，识别部位和类限制性内切酶：特异性切割，

26、识别部位和切点不同。切点不同。1.概念与种类概念与种类限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶基基本本名名称称：生生物物拉拉丁丁文文名名称称属属名名的的第第一一个个大大写写字字母母和和种种名的前两各小写字母缩写构成（斜体）。名的前两各小写字母缩写构成（斜体）。如果酶存在于一种菌株中，加株名的一个大写字母。如果酶存在于一种菌株中，加株名的一个大写字母。如如果果酶酶的的编编码码基基因因位位于于噬噬菌菌体体（病病毒毒）或或质质粒粒上上，用用一个大写字母表示这些非染色体的遗传物质。一个大写字母表示这些非染色体的遗传物质。酶酶名名称称的的最最后后部部分分为为罗罗马马数数字字，表表示示该该生生物物体体中中发发现现

27、此酶的先后次序。此酶的先后次序。举举例例：HinHind d，Haemophilus Haemophilus influenzaeinfluenzae d d 株株中中发发现第三个酶。现第三个酶。2.2.类限制性核酸内切酶的命名规则类限制性核酸内切酶的命名规则基因的体外重组基因的体外重组4 4、5 5或或6 6个碱基对，而且具有个碱基对，而且具有180180旋转对旋转对称的回文结构。称的回文结构。Eco RIEco RI的识别序列为：的识别序列为：55 GAATTC GAATTC 3 333 CTTAAG CTTAAG 5 5 有些酶切割后产生平末端有些酶切割后产生平末端,大部分酶切割后大部分

28、酶切割后产生黏末端，产生黏末端，55或或33突出末端。突出末端。3.3.内切酶的识别序列内切酶的识别序列基因的体外重组基因的体外重组EcoR酶切后形成酶切后形成5突出端突出端EcoR酶切后形成平末端酶切后形成平末端Pst酶切后形成酶切后形成3突出端突出端基因的体外重组基因的体外重组活活性性单单位位（1U1U）定定义义：为为50 50 ll反反应应体体系系中中，特特定定温温度度下经过下经过1 1小时反应，完全分解小时反应，完全分解1 g DNA1 g DNA所需酶量。所需酶量。甲甲基基化化：从从带带有有DNADNA甲甲基基化化酶酶基基因因的的宿宿主主中中分分离离制制备备DNADNA，其其碱碱基基

29、一一部部分分被被甲甲基基化化，影影响响酶酶识识别别和和切切割割能能力力，甚甚至不能切割。至不能切割。星星号号活活性性：限限制制性性酶酶对对底底物物的的特特异异性性降降低低，导导致致切切割割非非特特异异识识别别位位点点，电电泳泳弥弥散散（smearsmear）。尽尽可可能能降降低低甘甘油油浓度，在中性浓度，在中性pHpH和高盐离子浓度下进行酶切反应和高盐离子浓度下进行酶切反应。4.4.影响酶切的因素影响酶切的因素基因的体外重组基因的体外重组缓缓冲冲液液与与温温度度：每每种种酶酶都都有有最最适适反反应应缓缓冲冲液液，应应在在最佳工作温度下和反应缓冲液中进行。最佳工作温度下和反应缓冲液中进行。酶量与

30、反应时间：增加酶量，相应缩短时间。酶量与反应时间：增加酶量，相应缩短时间。质质粒粒纯纯度度不不很很高高，酶酶切切反反应应通通常常在在数数倍倍过过量量酶酶的的条条件下进行。件下进行。基因的体外重组基因的体外重组4.4.影响酶切的因素影响酶切的因素DNADNA连连接接酶酶催催化化的的基基本本反反应应:DNA:DNA 双双链链上上相相邻邻的的 33羟羟基基和和 55磷磷酸酸基基因因共共价价结结合合形形成成 3355磷磷酸酸二二酯酯键，使原来断开的键，使原来断开的DNADNA缺口重新连接起来。缺口重新连接起来。T4T4噬噬菌菌体体的的DNADNA连连接接酶酶:以以ATPATP作作为为辅辅助助因因子子，

31、它它在在与与酶形成复合物的同时释放出焦磷酸基团。酶形成复合物的同时释放出焦磷酸基团。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶:以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADNAD+）作为辅助因子。活化后的酶复合物结合在）作为辅助因子。活化后的酶复合物结合在DNADNA的缺的缺口处，修复磷酸二酯键，并释放口处，修复磷酸二酯键，并释放AMPAMP。T4-DNA T4-DNA 连接酶比大肠杆菌连接酶具有更广泛底物适连接酶比大肠杆菌连接酶具有更广泛底物适应性。应性。连接反应与连接酶连接反应与连接酶基因的体外重组基因的体外重组基因的体外重组基因的体外重组DNA连接酶的各种特性连接酶的各种特性连接

32、酶连接酶平端平端/突端突端/切口补平切口补平/T4 DNA连连 接接酶酶15-25437大大肠肠杆杆菌菌DNA连接酶连接酶10-1537热稳定性热稳定性DNA连接酶连接酶24-3765-72DNA/RNADNA/RNA聚聚合合酶酶：催催化化合合成成DNA/RNADNA/RNA分分子子的的酶酶。体体外外进进行行聚聚合合反反应应与与体体内内相相似似，一一般般需需要要模模板板，合合成成产产物物为为模模板板的的互互补补序序列列。根据聚合酶依赖的模板，可分为：根据聚合酶依赖的模板，可分为：依依赖赖于于DNADNA的的DNADNA聚聚合合酶酶：大大肠肠杆杆菌菌DNADNA聚聚合合酶酶I I及及其其大大片片

33、段段、T4T4和和T7 DNAT7 DNA聚合酶及热稳定性聚合酶及热稳定性DNADNA聚合酶；用于聚合酶；用于DNADNA复制和扩增复制和扩增依赖于依赖于DNADNA的的RNARNA聚合酶：转录酶，基因的转录聚合酶：转录酶，基因的转录依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶：反转录酶，病毒的复制聚合酶：反转录酶，病毒的复制不不依依赖赖于于模模板板的的聚聚合合酶酶：把把核核苷苷酸酸加加到到DNADNA分分子子的的末末端端，即即末末端端转移酶。转移酶。四、四、DNADNA聚合反应与聚合酶聚合反应与聚合酶基因的体外重组基因的体外重组各种聚合酶特性各种聚合酶特性基因的体外重组基因的体外重组酶酶温

34、度温度 模板模板聚合活性聚合活性外切活性外切活性大肠杆菌大肠杆菌DNA聚聚合酶合酶16-22ssDNA,ssRNA535335Klenow片段片段16-22ssDNA,ssRNA5335T4DNA聚合酶聚合酶37ssDNA5335末端转移酶末端转移酶37dsDNA53无无多核苷酸聚合酶多核苷酸聚合酶 37ssRNA53无无T7RNA聚合酶聚合酶37dsDNA53无无SP6RNA聚合酶聚合酶 40dsDNA53无无53外切活性外切活性35外切活性外切活性53聚合活性聚合活性5 5 3 3 聚聚合合活活性性35外切活性外切活性5 5 3 3 外外切切活性活性基因的体外重组基因的体外重组聚合酶活性大

35、肠杆菌大肠杆菌DNA DNA 聚合酶聚合酶I I的大片段的大片段Klenow Klenow 酶用途：酶用途：1 1）3 3凹端补平，使之成为平末端；凹端补平，使之成为平末端；2 2）对）对DNADNA片段进行标记，合成探针；片段进行标记，合成探针；3 3）用于催化）用于催化cDNAcDNA第二链的合成；第二链的合成；4 4）用于双脱氧末端终止法测定）用于双脱氧末端终止法测定DNADNA的序列。的序列。T4-DNA T4-DNA 聚合酶：聚合酶：修平非平头的修平非平头的cDNAcDNA分子以及由某些限制性核酸内分子以及由某些限制性核酸内切酶水解产生的切酶水解产生的3 3突出末端。突出末端。基因的

36、体外重组基因的体外重组聚合酶的用途聚合酶的用途KlenowKlenow酶酶末端转移酶：转移活性比其他聚合酶高，用于末端转移酶：转移活性比其他聚合酶高，用于RTRT和和PCRPCR反应物、载体末端加同聚物和反应物、载体末端加同聚物和3 3末端标记反应。末端标记反应。多核苷酸聚合酶：用于多核苷酸聚合酶：用于RNA 3RNA 3标记和加标记和加poly(A)poly(A)。RNARNA聚合酶：可用于合成聚合酶：可用于合成RNARNA探针、体外翻译，可用探针、体外翻译，可用T7T7转录系统在大肠杆菌、酵母中表达外源基因。转录系统在大肠杆菌、酵母中表达外源基因。基因的体外重组基因的体外重组聚合酶的用途末

37、端转移酶聚合酶的用途末端转移酶碱碱性性磷磷酸酸酶酶来来源源于于大大肠肠杆杆菌菌和和牛牛小小肠肠。细细菌菌碱碱性性磷磷酸酸单单酯酯酶酶和和牛牛小小肠肠碱碱性性磷磷酸酸单单酯酯酶酶（CIAPCIAP）均均能能催催化化DNADNA、RNARNA核核苷苷酸酸的的55端端单单酯酯水水解解，除除去去磷磷酸酸，需需要要辅辅基基ZnZn2 2，但但不不能能催催化化磷磷酸酸二二酯酯和和三三酯酯的的水解。水解。在在DNADNA重重组组实实验验中中，该该酶酶用用于于载载体体DNADNA的的55末末端端除除磷磷操操作作，以以提提高高重重组组效效率率。外外源源DNADNA片片段段的的55端端除除磷磷磷磷酸酸基基，则则可

38、可有有效效防防止止外外源源DNADNA片片段段之之间间的的连连接接，提提高高重重组组效效率率。在在核核酸酸55末末端端标标记记前前，用用碱碱性磷酸酶除去磷酸，可得到较高的标记效率。性磷酸酶除去磷酸，可得到较高的标记效率。基因的体外重组基因的体外重组聚合酶的用途碱性磷酸酶聚合酶的用途碱性磷酸酶基因的体外重组基因的体外重组聚合酶的用途聚合酶的用途其他酶其他酶核酸酶模板用途核糖核酸酶HDNA/RNAcDNA克隆、除去mRNApoly(A)末端。核糖核酸酶ARNA除去质粒或DAN-RNA、RNA-RNA杂合体中未杂交的单链RNA，突变检测S1核酸酶ssRNA,ssDNAS1作图，dsDNA末端平化，除

39、去DNADNA和RNADNA杂交体中的单链部分绿豆核酸酶ssRNA/ssDNA杂交作图，双链DNA末端平化外切酶IIIdsDNA测序，DNA缺失，DNA蛋白质相互作用分析脱氧核糖核酸酶IssDNAdsDNA体外转录后除去模板DNA，切口平移反应，DNA蛋白质相互作用分析，降解RNA中的DNAPCR(Polymerase chain reaction,PCR)PCR(Polymerase chain reaction,PCR)：聚合酶链式反应，是由聚合酶链式反应，是由DNADNA聚合酶催化下，对特定的聚合酶催化下，对特定的DNA DNA 序列进行的复制反应。序列进行的复制反应。本质：本质：根据生

40、物体的根据生物体的DNADNA复制原理在体外合成基因。复制原理在体外合成基因。发明者：发明者：MullisMullis，19831983年，生物技术革命性象征。年，生物技术革命性象征。PCR及其衍生技术及其衍生技术-目标基因组装一、一、PCRPCR技术技术目标基因组装目标基因组装(2)退火（退火（55）(4)完成一个循环完成一个循环(3)延伸（延伸（72）目标基因扩增目标基因扩增(1)变性（变性（94）1.PCR1.PCR单反应原理与过程单反应原理与过程产物计算：产物计算：Y Yn nY Y0 0（1 1X X）n n其中其中Y Yn n为为n n循环后的拷贝数，循环后的拷贝数，Y Y0 0为

41、起始拷贝数，为起始拷贝数，X X为扩增效率，为扩增效率，n n为循环数。为循环数。2.PCR2.PCR循环循环目标基因扩增目标基因扩增模板模板 DNADNA：目标序列目标序列,100,10010 000bp,pg10 000bp,pg引物：引物：两条寡核苷酸。两条寡核苷酸。脱氧核苷酸：脱氧核苷酸：4 4种种dNTP,dNTP,即即dATP,dCTP,dGTP,dTTPdATP,dCTP,dGTP,dTTPDNADNA聚合酶聚合酶:Taq Taq聚合酶，耐高温聚合酶，耐高温缓冲溶液：缓冲溶液：50 mM KCl50 mM KCl、10 mM Tris10 mM TrisHCl,1.5 HCl,1

42、.5 mM MgClmM MgCl2 2 3.PCR3.PCR扩增的反应体系组成扩增的反应体系组成目标基因组装目标基因组装长度：长度：2030bp，与模板配对长度与模板配对长度1825bp。GC含量含量:4060，4种碱基分布均匀。种碱基分布均匀。Tm值计算值计算:151520 bp20 bp，TmTm2 2（A AT T）4 4（C CG G）。）。141440 bp40 bp：TmTm81.581.516.6(lgK16.6(lgK+)0.41(G+C%)0.41(G+C%)引物引物TmTm之差之差不能大于不能大于55，产物，产物TmTm值与引物值与引物TmTm值之差不值之差不能低于能低于

43、1010。一般在一般在50506565之间，温度越高特异性越强。之间，温度越高特异性越强。4.PCR4.PCR操作指南操作指南引物设计引物设计目标基因扩增目标基因扩增酶识别序列碱基对数0123ApaIGGGCCCBamHIGGATCCClaIATCGATEco RIGAATTCEcoRVGATTACHindIIIAAGCTTNotIGCGGCCGCPstICTGCAGSacIGAGCTCSalIGTCGACSmaICCCGGGSpeIACTAGTXbaITCTAGAXhoICTCGAG4.PCR操作指南操作指南酶切位点设计酶切位点设计目标基因扩增目标基因扩增聚合酶外 切 活性温度稳定性错误率1

44、06Taq53758097.5,9min20100rTth53758097.5,20min20Tbr 53758096,150minPwo 356065100,2hrDeepVent357080100,480min2045Pfu 35727895,240min1.6Tli 357080100,100min2045Tfl07070,120min100Taqstoffel0758097.5,21min504.PCR4.PCR操作指南操作指南DNADNA聚合酶的选择聚合酶的选择目标基因扩增目标基因扩增Mg离子浓度：离子浓度：1.55.0mM。退火温度：退火温度：根据产物基因的根据产物基因的Tm值和长

45、度计算。值和长度计算。退火时间：一般退火时间：一般30秒至秒至2分钟，根据长度计算。分钟，根据长度计算。延伸时间：一般延伸时间：一般13分钟。分钟。循环次数：循环次数：2540次，根据模板含量。次，根据模板含量。PCRPCR反应应该包括正、负对照，无模板、无引物、反应应该包括正、负对照，无模板、无引物、无聚合酶等对照，以便检测无聚合酶等对照，以便检测PCRPCR的进行和结果分析。的进行和结果分析。整个过程在整个过程在PCRPCR仪内，编程后自动完成。仪内，编程后自动完成。4.PCR4.PCR操作指南操作指南循环参数设计循环参数设计目标基因扩增目标基因扩增常常规规操操作作：冷冷启启动动，在在冰冰

46、上上把把反反应应物物混混合合后后，设设计计最佳程序，直接进行。最佳程序，直接进行。热热启启动动操操作作：先先把把引引物物和和模模板板混混合合并并加加热热到到高高于于非非特异性结合温度，加入聚合酶，启动特异性结合温度，加入聚合酶，启动PCRPCR。降降序序操操作作：PCRPCR过过程程优优化化的的最最佳佳选选择择。前前两两个个扩扩增增循循环环的的复复性性温温度度比比富富含含GCGC引引物物与与模模板板完完全全配配对对的的熔熔链链温温度度高高33。随随后后的的循循环环中中，复复性性温温度度逐逐渐渐降降低低11。总有一个温度点是特异性扩增的温度。总有一个温度点是特异性扩增的温度。用于兼并引物、模板用

47、于兼并引物、模板DNADNA序列复杂和进行多重序列复杂和进行多重PCRPCR。降低非特异性扩增。降低非特异性扩增。5.PCR5.PCR操作方式操作方式目标基因扩增目标基因扩增反反转转录录PCRPCR（Reverse Reverse Transcription Transcription PCR,PCR,RTRT PCRPCR）:以以mRNAmRNA为为起起始始材材料料，通通过过反反转转录录酶酶合合成成cDNAcDNA，再再以以cDNAcDNA为模板，扩增合成为模板，扩增合成DNADNA片段。片段。应用：克隆基因的末端序列、表达的功能区段应用：克隆基因的末端序列、表达的功能区段 检测基因表达和诊

48、断遗传病和感染的病毒等检测基因表达和诊断遗传病和感染的病毒等二、反转录二、反转录PCRPCR技术技术目标基因扩增目标基因扩增第一步第一步:反转录反应反转录反应第二步第二步:PCR:PCR扩增反应扩增反应1.RT1.RTPCRPCR原理与过程原理与过程目标基因扩增目标基因扩增2.RT反应体系的组成反应体系的组成目标基因扩增目标基因扩增成分成分浓度浓度用量用量mRNA1pg100ng缓冲液缓冲液102l4种种dNTPs混合液混合液20mmol/L1l引物引物520pmol/L1lRNase抑制剂抑制剂20U1lMgCl250mmol/L1l反转录酶反转录酶100200U1lH2O13l总体积总体积

49、20l3.3.反转录酶特性与选择反转录酶特性与选择目标基因扩增目标基因扩增酶酶温度温度 模板模板聚合活聚合活性性RNaseH产物产物AMV41-45ssRNA,ssDNA53强强短短MMLV37ssRNA,ssDNA53弱或无弱或无长长（1 1）样品变性。）样品变性。7575变性变性RNA 5RNA 5分钟，冰上冷却。分钟，冰上冷却。（2 2）反反转转录录。加加入入其其他他成成分分，混混合合。在在4242或或3737下，合成下，合成cDNAcDNA第一链，一般第一链，一般1 1小时。小时。（3 3）终止反应。）终止反应。9595加热加热5 5分钟，使反转录酶失活。分钟，使反转录酶失活。设设置置

50、相相关关的的正正负负对对照照，便便于于监监测测反反应应过过程程和和分分析析反反应应结果。结果。反反转转录录之之后后，对对产产物物稀稀释释至至一一定定倍倍数数，然然后后作作为为模模板板，建立建立PCRPCR反应体系，进行反应体系，进行PCRPCR扩增。扩增。4.RT4.RT反应操作反应操作目标基因扩增目标基因扩增溶菌酶和溶菌酶和SDSSDS处理处理:破裂细胞后，释放出内容物。破裂细胞后，释放出内容物。碱碱变变性性:蛋蛋白白质质、细细菌菌染染色色体体和和质质粒粒都都发发生生变变性性。蛋蛋白白质质、细细胞胞壁壁碎碎片片和和染染色色体体DNADNA相相互互缠缠绕绕形形成成大大型型复复合物，被合物，被S

51、DSSDS包裹。包裹。酸酸中中和和：加加入入乙乙酸酸钾钾，使使碱碱性性溶溶液液至至中中性性，染染色色体体分分子子巨巨大大，无无法法复复性性，质质粒粒很很快快复复性性,进进入入上上清清液液SDSSDS包包裹裹蛋蛋白白质质、染染色色体体及及细细胞胞碎碎片片被被沉沉淀淀下下来来。离离心心:除除去去蛋蛋白白质质、染染色色体体DNADNA及及细细胞胞碎碎片片等等沉沉淀淀，质质粒保留在上清，最后用乙醇或异丙醇沉淀。粒保留在上清，最后用乙醇或异丙醇沉淀。质粒载体的分离与纯化原理质粒载体的分离与纯化原理1.SDS1.SDS碱裂解制备提取质粒的原理碱裂解制备提取质粒的原理基因的体外重组基因的体外重组去污剂去污剂

52、：Triton X100Triton X100煮煮沸沸加加热热：使使细细胞胞壁壁裂裂解解，同同时时使使蛋蛋白白质质、核酸等变性沉淀。核酸等变性沉淀。降降低低温温度度：冰冰浴浴迅迅速速降降温温，质质粒粒得得以以复复性性，其他生物大分子不能有效复性其他生物大分子不能有效复性.离心离心:除去杂质，收集质粒。除去杂质，收集质粒。加热裂解制备提取质粒的原理加热裂解制备提取质粒的原理:基因的体外重组基因的体外重组质质粒粒大大小小：大大于于15 15 kbkb，温温和和的的SDSSDS碱碱法法提提取取，操操作作过过程程也也要要尽尽量量轻轻柔柔，避避免免质质粒粒被被机机械械剪剪切切而而断断裂裂。小小于于10

53、kb10 kb的质粒可用剧烈的加热裂解法提取。的质粒可用剧烈的加热裂解法提取。碱碱或或加加热热处处理理时时间间：对对提提取取质质粒粒的的质质量量影影响响很很大大，时时间延长会使质粒不可逆变性，应注意避免。间延长会使质粒不可逆变性，应注意避免。除除去去RNARNA：由由于于含含有有大大量量的的RNARNA，要要用用RNase RNase A A处处理理。RNase ARNase A可在第一步加入，节省时间。可在第一步加入，节省时间。溶溶菌菌酶酶：小小量量提提取取，不不加加溶溶菌菌酶酶。大大量量提提取取时时添添加加7 7 溶菌酶，并给予一定时间处理。溶菌酶，并给予一定时间处理。注意事项注意事项基因

54、的体外重组基因的体外重组质粒的电泳检查质粒的电泳检查：2 23 3带带：2 23 3种种螺螺旋旋构构型质粒的电泳速率不同型质粒的电泳速率不同最亮带：负超螺旋质粒最亮带：负超螺旋质粒中间带：缺口开环质粒中间带：缺口开环质粒滞滞后后带带：两两条条链链都都断断裂裂的线性质粒的线性质粒出出现现两两条条带带，开开环环质质粒粒带很弱，是正常的。带很弱，是正常的。基因的体外重组基因的体外重组质质粒粒不不能能酶酶切切：可可在在沉沉淀淀质质粒粒之之前前，用用苯苯酚酚或或苯苯酚、氯仿抽提，提高质粒的质量。酚、氯仿抽提，提高质粒的质量。质质粒粒的的纯纯化化：现现在在多多用用离离子子交交换换、吸吸附附、凝凝胶胶过过滤

55、等原理纯化，有很多商品化的试剂盒。滤等原理纯化，有很多商品化的试剂盒。转化转化:某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的细胞的DNADNA，使其基因型和表型发生相应变化的现象，使其基因型和表型发生相应变化的现象.转染转染:除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程体的过程.转转导导:用噬菌体做载体，将一个细胞的基因传递给另用噬菌体做载体，将一个细胞的基因传递给另一个细胞的过程一个细胞的过程.遗传转化与筛选鉴定遗传转化与筛选鉴定一、转化一、转化1.1.概念概念遗传转化操作：将重组遗传转化操作：将重组DNA

56、DNA分子导入受体细胞过程。分子导入受体细胞过程。物理方法：热击诱导，电穿孔法，基因枪物理方法：热击诱导，电穿孔法，基因枪化学方法：化学方法：PEGPEG介导，脂质体转染介导，脂质体转染 接接合合转转移移：细细菌菌细细胞胞之之间间的的直直接接接接触触导导致致DNADNA从从一一个个细胞转移至另一个细胞的过程。细胞转移至另一个细胞的过程。噬噬菌菌体体转转染染:-DNA-DNA体体外外包包装装成成为为噬噬菌菌体体颗颗粒粒,转转染染细菌。细菌。2.转化方法转化方法大肠杆菌热击诱导转化：制备感受态细胞，加入大肠杆菌热击诱导转化：制备感受态细胞，加入DNADNA，热击，热击4242C 90sC 90s，

57、冷却，涂平板，冷却，涂平板电转化：电转仪，控制高压放电。受体细胞制备（减电转化：电转仪，控制高压放电。受体细胞制备（减少细胞壁的形成）。酵母电转化：少细胞壁的形成）。酵母电转化：YPADYPAD培养基培养基(50(50 ml)ml)培养酵母菌培养酵母菌 at 30C at 30C，250 rpm 250 rpm，4 45 h 5 h，OD600=0.8OD600=0.81.01.0。4 4C C，4000 rpm 4000 rpm，5 min5 min收集细收集细胞。洗涤并重悬于胞。洗涤并重悬于250 ul/1 M cold 250 ul/1 M cold 山梨醇。取山梨醇。取 50 50 u

58、l ul 酵母与酵母与4ul DNA 4ul DNA 混合物于混合物于0.2 cm0.2 cm杯，杯，1.5 kV1.5 kV转化。转化。与与YPADYPAD混合后，混合后，3030C C 培养培养1 h1 h。收集细胞，洗涤重。收集细胞，洗涤重悬悬sorbitol sorbitol。取。取303050ul 50ul 涂平板，涂平板，SC-UraSC-Ura，30C 30C 2 24d4d筛选转化子。筛选转化子。基因枪：高压打击基因枪：高压打击;花粉管通道：植物花粉管通道：植物物理转化方法物理转化方法PEGPEG介介导导：制制备备原原生生质质体体，加加入入DNADNA载载体体，加加入入PEGP

59、EG，混合，离心，除去上清，涂原生质体再生平板混合，离心，除去上清，涂原生质体再生平板脂质体转染：脂质体包裹脂质体转染：脂质体包裹DNADNA，与细胞混合，主要用，与细胞混合，主要用于动物细胞转化于动物细胞转化氯化铯转化酵母：氯化铯转化酵母：化学转化方法化学转化方法受体菌：制备链霉菌新鲜孢子，热击受体菌：制备链霉菌新鲜孢子，热击5050度度10min/10min/预萌预萌发发制备供体菌感受态：把质粒转化制备供体菌感受态：把质粒转化ET12567/PUZ8002ET12567/PUZ8002大大肠菌，过夜培养，在对数期，洗涤收集细胞肠菌，过夜培养，在对数期，洗涤收集细胞把大肠杆菌与孢子混合，涂平

60、板把大肠杆菌与孢子混合，涂平板2424小时后，涂抗生素，抑制大肠杆菌，筛选转化子小时后，涂抗生素，抑制大肠杆菌，筛选转化子接合转移方法接合转移方法未连接的外源未连接的外源DNADNA片段片段载体片段载体片段载体的自连物载体的自连物非正确连接的重组分子非正确连接的重组分子正确连接的重组分子正确连接的重组分子重组子的筛选与的鉴定重组子的筛选与的鉴定外源外源DNADNA片段与载体片段与载体DNADNA的连接反应物：的连接反应物：非转化子：没有导入外源非转化子：没有导入外源DNADNA的非转化宿主细胞的非转化宿主细胞转化子：导入外源转化子：导入外源DNADNA的转化细胞的转化细胞非重组子：仅含有空载体

61、分子的转化子非重组子：仅含有空载体分子的转化子重组子：含有重组重组子：含有重组DNADNA分子的转化子分子的转化子目标重组子：含有连接正确的重组分子目标重组子：含有连接正确的重组分子非目标重组子：不含目的基因重组子非目标重组子：不含目的基因重组子转化后的细胞转化后的细胞类型类型：筛选与鉴定的目的：找出正确连接的重组子筛选与鉴定的目的：找出正确连接的重组子原原理理：利利用用载载体体DNADNA分分子子所所携携带带的的选选择择性性遗遗传传标标记记基基因因筛筛选选重重组组子子。标标记记基基因因所所对对应应的的遗遗传传表表型型与与受受体体细细胞胞是是互互补补的的，因因此此在在培培养养基基中中施施加加合

62、合适适的的选选择择压压力力，即即可可保保证证重重组组子子显显现现，而非重组子不现（不生长）。而非重组子不现（不生长）。大大肠肠杆杆菌菌/链链霉霉菌菌/棒棒杆杆菌菌等等细细菌菌抗抗生生素素筛筛选选法法：抗抗生生素素的的抗抗性基因，氨苄青霉素。性基因，氨苄青霉素。篮白斑：篮白斑：lacZlacZ基因，重组子白色，非重组子蓝色。基因，重组子白色，非重组子蓝色。噬菌斑：转化子被裂解形成噬菌斑，而非转化子正常生长噬菌斑：转化子被裂解形成噬菌斑，而非转化子正常生长营营养养缺缺陷陷型型筛筛选选法法：酵酵母母用用氨氨基基酸酸缺缺陷陷型型，动动物物细细胞胞用用核核苷苷酸缺陷型筛选酸缺陷型筛选筛选方法筛选方法载体的遗传标记法载体的遗传标记法菌菌落落原原位位杂杂交交法法：核核酸酸分分子子探探针针序序列列特特异异性性地地杂杂交交目的基因。目的基因。限制性酶切图谱法：酶切，相应位点、片段大小。限制性酶切图谱法：酶切，相应位点、片段大小。DNADNA序列测定法：序列、方向、边界等。序列测定法：序列、方向、边界等。外外源源基基因因表表达达产产物物检检测测法法：外外源源基基因因编编码码产产物物是是蛋蛋白白质质，产产物物表表达达、功功能能、结结构构来来筛筛选选和和鉴鉴定定期期望望重重组子。组子。筛选方法筛选方法其他方法其他方法谢谢！