医学分子生物学dna1课件

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1、第五章第五章DNA及基因组及基因组1TheRunners-UpTheRunners-Up基因编辑技术基因编辑技术基因编辑技术基因编辑技术CRISPRCRISPR成像技术成像技术成像技术成像技术CLARITYCLARITYHumanStemCellsfromCloningHumanStemCellsfromCloning（克隆人体胚胎干细胞）（克隆人体胚胎干细胞）（克隆人体胚胎干细胞）（克隆人体胚胎干细胞）Mini-Organs(Mini-Organs(迷你器官）迷你器官）迷你器官）迷你器官）CosmicParticleAcceleratorsIdentifiedCosmicParticleAc

2、celeratorsIdentified（宇宙粒子加速器）（宇宙粒子加速器）（宇宙粒子加速器）（宇宙粒子加速器）PerovskiteSolarCells(PerovskiteSolarCells(钙钛矿钙钛矿钙钛矿钙钛矿型型型型太阳能电池太阳能电池太阳能电池太阳能电池)WhyWeSleepWhyWeSleep（我们为什么要睡觉）（我们为什么要睡觉）（我们为什么要睡觉）（我们为什么要睡觉）OurMicrobes,OurHealthOurMicrobes,OurHealth（我们的微生物）（我们的微生物）（我们的微生物）（我们的微生物）InVaccineDesign,LooksDoMatterIn

3、VaccineDesign,LooksDoMatter（疫苗设计）（疫苗设计）（疫苗设计）（疫苗设计）2BREAKTHROUGHOFTHEYEAR2013:Runnersup恐龙向鸟类进化The birth of birds年轻血液助推返老还童Young blood fixes old机器人自主合作Robots that cooperate仿人脑芯片Chips that mimic the brain印尼洞穴艺术Europes cave art has a rival治愈糖尿病的细胞Cells that might cure diabetes操控记忆Manipulating memories立

4、方体卫星Rise of the CubeSat扩充生命遗传密码 Giving life a bigger genetic alphabet3BREAKTHROUGHOFTHEYEAR2014:LandingonaCometCombination therapies that help harness T cells and other immune cells in the cancer fight are a key area to watch.American Association for the Advancement of Science Science 2014;346:14505

5、BREAKTHROUGHOFTHEYEAR2015:Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats成簇的、规律间隔的短回文重复序列成簇的、规律间隔的短回文重复序列RunnerUpthe year of the dwarf planetKenna wake human skeletonthe regeneration of Psychologythe discovery of new racefocused on the deep mantle flowthe successful development of the Ebol

6、a vaccine yeast production of opioid drugs the brain has lymphatic channels Baer no loopholes in the experiment to confirm the quantum strange characteristics CRISPRCRISPRCRISPRCRISPRs s s s技术是一种由技术是一种由技术是一种由技术是一种由RNARNARNARNA指导指导指导指导CasCasCasCas蛋白对靶向基因蛋白对靶向基因蛋白对靶向基因蛋白对靶向基因进行修饰的技术。进行修饰的技术。进行修饰的技术。进行

7、修饰的技术。7基因组编辑技术可以实现三种基因组改造，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因基因组编辑技术可以实现三种基因组改造，即基因组编辑技术可以实现三种基因组改造，即基因基因敲除，特异突变的引入和定点转基因敲除，特异突变的引入和定点转基因基因组编辑是研究基因功能的重要手段之一，也可基因组编辑是研究基因功能的重要手段之一，也可基因组编辑是研究基因功能的重要手段之一，也可基因组编辑是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为现代分

8、子生物学的研究热点现代分子生物学的研究热点现代分子生物学的研究热点现代分子生物学的研究热点8AreastoWatchin2016AphysicssatelliteDogevolutionGravitationalwaves一、核酸研究简史一、核酸研究简史 第一阶段：核酸的发现第一阶段：核酸的发现第二阶段：发现核酸是遗传物质第二阶段：发现核酸是遗传物质第三阶段：为分子生物学奠定基第三阶段：为分子生物学奠定基础的时期础的时期第四阶段：分子生物学高速发展时期第四阶段：分子生物学高速发展时期第一节 DNA的结构与功能918891889年年 R.Altman R.Altman 从动物细胞与酵母从动物细胞

9、与酵母 菌中制备了菌中制备了核酸核酸18691869年年 F.Miescher F.Miescher 从脓细胞中得到从脓细胞中得到 核质核质“NucleinNuclein”第一阶段：核酸的发现第一阶段：核酸的发现18941894年年 A.Kossel A.Kossel 和和A.Neumann A.Neumann 从胸腺从胸腺 中提取核酸中提取核酸1019301930年年 正式提出核酸分为两大类：正式提出核酸分为两大类：核糖核酸核糖核酸（RNARNA）脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNADNA）19041904年年 Hammars Hammars 证明核酸中的糖是戊糖证明核酸中的糖是戊糖.19091

10、909年年 LeveneLevene和和JacobsJacobs鉴定核酸中的糖鉴定核酸中的糖 是是D-D-核糖核糖.19121912年年 Levene Levene 认为核酸由认为核酸由4 4种核苷酸种核苷酸 组成组成19291929年年 Levene Levene 和和Jacobs Jacobs 确定胸腺核苷酸确定胸腺核苷酸 中的糖是中的糖是2-2-脱氧脱氧-D-D-核糖核糖 11第二阶段：发现核酸是遗传物质第二阶段：发现核酸是遗传物质 1944 1944年年 AveryAvery等揭示了等揭示了DNADNA是细菌的遗传物质是细菌的遗传物质有荚膜的光滑型肺炎球菌（有荚膜的光滑型肺炎球菌（S型

11、）型）致病致病无荚膜的粗糙型肺炎球菌（无荚膜的粗糙型肺炎球菌（R型）型）不致病不致病12 R R型菌型菌 R R型菌型菌 R R型菌型菌 +S S型菌型菌DNA DNA S S型菌型菌DNA DNA S S型菌型菌DNADNA （经蛋白酶水解）（经蛋白酶水解）（经核酸酶水解）（经核酸酶水解）部分克隆变为部分克隆变为 部分克隆变为部分克隆变为 不能变为不能变为 S S型菌型菌 S S型菌型菌 S S型菌型菌1319521952年年 HersheyHersheyChase Chase 通过噬菌通过噬菌体感染细菌的实体感染细菌的实验表明验表明病毒的遗病毒的遗传物质是传物质是DNADNA。141953

12、年年J.D.Watson和和F.Crick建立建立了了DNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型第三阶段：为分子生物学奠定基础的时期第三阶段：为分子生物学奠定基础的时期151958年年*KornbergKornberg等发现了等发现了DNADNA聚合酶聚合酶 (DNA polymerase)(DNA polymerase)*Meselson等提出半保留复制，等提出半保留复制，阐明阐明DNA复制的机理复制的机理*Crick提出了遗传信息传递的提出了遗传信息传递的中心法则中心法则161965年年中国科学家人工合成牛胰岛素中国科学家人工合成牛胰岛素1970年年Temin等发现了从等发现了从RNADNA反转录

13、现象，反转录现象，使中心法则更完善使中心法则更完善1961年以后年以后Jacob、Nirenberg和和Monod等取得三个等取得三个有意义的进展：有意义的进展：1)证实了证实了mRNA携带着携带着DNA到蛋白质合成机制所到蛋白质合成机制所需要的信息需要的信息2)发现了遗传密码发现了遗传密码3)发现了蛋白质依靠发现了蛋白质依靠tRNA和核糖体的帮助翻译和核糖体的帮助翻译17遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则（centraldogma）DNAmRNA转录转录多肽链多肽链翻译翻译蛋白质蛋白质翻译后加工翻译后加工DNA复制复制逆转录逆转录逆转录逆转录RNARNA复制复制复制复制18第四阶段

14、：分子生物学高速发展时期第四阶段：分子生物学高速发展时期1.19711.1971年年 限制性内切酶发现，限制性内切酶发现，DNADNA的的 分离成为可能分离成为可能192.2.直读核苷酸序列方法直读核苷酸序列方法 (1975(1975年年SangerSanger发明发明)203.DNA3.DNA体外重组技术体外重组技术 (1972(1972年年 BergBerg发明发明)2119821982年年 中国科学家人工合成酵母中国科学家人工合成酵母 丙氨酸丙氨酸tRNAtRNA19851985年年 MullisMullis建立建立PCRPCR技术技术19811981年年 T.CechT.Cech发现四

15、膜虫发现四膜虫rRNArRNA前体的前体的 自我拼接自我拼接,称为称为ribozyme.ribozyme.22人类科学史上的三大工程人类科学史上的三大工程 人类基因组计划人类基因组计划曼哈顿原子计划曼哈顿原子计划阿波罗登月计划阿波罗登月计划 19901990年年 美国正式启动人类基因组计划。美国正式启动人类基因组计划。(human genome project,HGP)(human genome project,HGP)2319991999年年7 7月月 中国：中国：3号染色体短臂号染色体短臂30Mb区域（区域（1%项目）项目）。2001年年8月月26日日,绘制完成绘制完成“中国卷中国卷”人类

16、基因组计划参加国家：人类基因组计划参加国家：美、英、日、法、德、中美、英、日、法、德、中242003年年4月月六国政府首脑联名发表六国政府首脑联名发表六国政府首脑关六国政府首脑关于完成人类基因组序列图的联合声明于完成人类基因组序列图的联合声明。2519971997年年 英国爱丁堡罗斯林研究所首次英国爱丁堡罗斯林研究所首次 育成克隆羊。育成克隆羊。26水稻基因组（水稻基因组（Rice Genome）2001年年10月，月，中科院、科技部和国家计委联中科院、科技部和国家计委联合向全世界宣布，中国率先完合向全世界宣布，中国率先完成水稻（籼稻）基因组工作成水稻（籼稻）基因组工作“框架图框架图”的绘制的

17、绘制2002年年4月月5日，日，在在Science 杂志上以封面文章杂志上以封面文章的形式发表。的形式发表。27*后基因组计划（后基因组计划（post-genome projectpost-genome project）又称为功能基因组学又称为功能基因组学 （functional genomicsfunctional genomics）*蛋白质组（蛋白质组（proteomeproteome）计划）计划 又称为蛋白质组学（又称为蛋白质组学（proteomicsproteomics）28*随着许多新的随着许多新的RNARNA功能陆续被发现，功能陆续被发现，20002000年各国科学家提出了年各国科

18、学家提出了RNARNA组的研究，组的研究，称为称为RNARNA组学（组学（RNomicsRNomics）*生物信息学生物信息学(bioinformatics)*系统生物学系统生物学(systemsbiology)29二、二、DNADNA研究的临床应用研究的临床应用 1.1.疾病发病机理的研究疾病发病机理的研究 1 1）遗传性疾病遗传性疾病 基因变异或基因缺陷是疾病发生的根基因变异或基因缺陷是疾病发生的根 本原因本原因如如:镰刀状红细胞性贫血镰刀状红细胞性贫血的致病因素是由的致病因素是由 于珠蛋白第于珠蛋白第6 6位氨基酸由谷氨酸突变为位氨基酸由谷氨酸突变为 缬氨酸。缬氨酸。30 如：如：心血管

19、疾病心血管疾病 型高脂蛋白血症的形成主要是由于型高脂蛋白血症的形成主要是由于ApoEApoE基因中第基因中第112112位和第位和第158158位的位的G G和和C C发生变异，蛋白质肽链上原来发生变异，蛋白质肽链上原来 Arg Arg 变成变成CysCys，失去与失去与ApoEApoE受体结合的能力，使受体结合的能力，使血脂升高血脂升高312 2）肿瘤肿瘤癌基因激活和抑癌基因激活和抑癌基因失活癌基因失活分分化受阻化受阻肿瘤细肿瘤细胞（永生型）胞（永生型）32 2.2.疾病的基因诊断疾病的基因诊断 DNADNA诊断：诊断：*快速快速DNADNA点杂交点杂交 *限制性内切酶酶谱分析法限制性内切酶

20、酶谱分析法 *DNADNA限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 分析法分析法 （RFLPRFLP）*聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）产前诊断、植床前诊断产前诊断、植床前诊断 33 A BKb 1 2 3 1 2 3 Kb6.7 hcs-B5.8 hcs-A3.8 hGH-N3.0 hGH-V1.2 hHG-V25.021.817.914.8单纯性生长激素缺乏症单纯性生长激素缺乏症(IGHD)(IGHD)(isolatedgrowthhormonedeficience)图中 A为BamHI酶解片段与hGH cDNA探针杂交放射自显影图 B为HindI酶解片段与hGH cDNA探针杂

21、交放射自显影图 1 为正常人.2 为IGHD患者.3 为杂合子DNA hcs 为人绒毛膜促乳素.hGH 为人生长激素8.3 hcs-L34父亲父亲母亲母亲孩子孩子GTCGTACGTGACACACACACACACACACACAGTACGATACGTGTCGTACGTGACACACACACACACACACACAGTACGATACGTGTCGTACGTGACACACACACACACACACACACAGTACGATACGTGTCGTACGTGACACACACACACACACACAGTACGATACGTGTCGTACGTGACACACACACACACACACACAGTACGATACGTGTCGTACGT

22、GACACACACACACACACACAGTACGATACGT父亲父亲母亲母亲孩子孩子46bp42bp40bp42bp42bp46bp40bp42bp40bpPCR结果的凝胶电泳：结果的凝胶电泳：图：某个图：某个CA2核苷酸重复的微卫星在一个家系中的核苷酸重复的微卫星在一个家系中的PCR检测结果示意图检测结果示意图短串联重复短串联重复(short tandem repeat,STR)多态性分析多态性分析35 3.3.疾病的预防与基因治疗疾病的预防与基因治疗 1 1）采用基因工程产生疫苗药物）采用基因工程产生疫苗药物 2 2）基因治疗）基因治疗36构件分子构件分子核苷酸核苷酸nucleotide

23、nucleotide核苷核苷nucleosidenucleoside 磷酸磷酸phosphatephosphate 碱基碱基basesbases 戊糖戊糖pentosepentose 嘧啶嘧啶pyrimidinepyrimidine 嘌呤嘌呤purinepurine 核糖核糖riboseribose 脱氧核糖脱氧核糖deoxyribosedeoxyribose 三、核酸三、核酸的结构的结构核酸核酸（多核苷酸（多核苷酸PolynucleotidePolynucleotide)（一）分子组成（一）分子组成371.1.1.1.含氮有机碱含氮有机碱含氮有机碱含氮有机碱 （1 1 1 1）嘧啶碱：胞嘧啶

24、）嘧啶碱：胞嘧啶）嘧啶碱：胞嘧啶）嘧啶碱：胞嘧啶C C C Cytosineytosineytosineytosine 胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶T T T Thyminehyminehyminehymine 尿嘧啶尿嘧啶尿嘧啶尿嘧啶U U U Uracilracilracilracil （2 2 2 2）嘌呤碱：腺嘌呤）嘌呤碱：腺嘌呤）嘌呤碱：腺嘌呤）嘌呤碱：腺嘌呤A A A Adeninedeninedeninedenine 鸟嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤G G G Guanineuanineuanineuanine 3839碱基上有修饰：碱基上有修饰：核苷的大写字母前加上代表修饰基团核苷

25、的大写字母前加上代表修饰基团的小写字母右上方写明碱基的第几位的小写字母右上方写明碱基的第几位m2G表示表示2-N-甲基鸟苷甲基鸟苷 位置位置 m3227G表示表示N2，N2，7-三甲鸟苷三甲鸟苷 数量数量 S4U表示表示4-硫代尿嘧啶硫代尿嘧啶甲基甲基(3)稀有碱基稀有碱基40R苷苷412.戊糖戊糖42顺式腺苷顺式腺苷反式腺苷反式腺苷3.3.核苷：核苷：C-N C-N 糖苷键糖苷键嘌呤碱嘌呤碱N9嘧啶碱嘧啶碱N1戊糖戊糖C143假尿苷假尿苷（C5C1）1OHOCH2OHOH1NHCOO5HN444.核苷酸核苷酸4512345464753环核苷酸环核苷酸cAMP、cGMP表示磷酸与表示磷酸与3、

26、5核苷核苷羟基相接羟基相接48（二）游离核苷酸的功能（二）游离核苷酸的功能ATP、GTP、UTP、CTP参于代谢参于代谢5-FU（5-氟尿嘧啶）氟尿嘧啶）抗癌药物抗癌药物6-MP（6-巯基嘌呤）巯基嘌呤）抗癌药物抗癌药物AZT抗抗AIDS病毒病毒（Azidothymidine叠氮胸苷）叠氮胸苷）cAMP、cGMP第二信使第二信使 495-氟尿嘧啶氟尿嘧啶 FdUMP 胸苷酸合成酶胸苷酸合成酶（5-FU）dTMP合成合成氨蝶呤氨蝶呤/甲氨蝶呤甲氨蝶呤 二氢叶酸还原二氢叶酸还原酶酶抑制抑制抑制抑制竞争抑制竞争抑制竞争抑制竞争抑制抑制抑制抑制抑制结合结合结合结合胸腺嘧啶胸腺嘧啶(T)5-氟尿嘧啶氟尿

27、嘧啶(5-FU)50次黄嘌呤次黄嘌呤(H)6-巯基嘌呤巯基嘌呤(6-MP)6-巯基嘌呤的结构巯基嘌呤的结构651甲酰甘氨酰甲酰甘氨酰胺核苷酸胺核苷酸（FGAR）PRPP谷氨酰胺谷氨酰胺（Gln）=PRA甘氨酰胺甘氨酰胺核苷酸核苷酸（GAR）甲酰甘氨甲酰甘氨脒核苷酸脒核苷酸（FGAM）5-氨基异咪唑氨基异咪唑-4-甲酰胺核苷酸甲酰胺核苷酸（AICAR）5-甲酰胺基咪唑甲酰胺基咪唑-4-甲酰胺核苷酸甲酰胺核苷酸（FAICAR）IMP次黄嘌呤次黄嘌呤（H）PRPPPPi=AMP=PRPPPPi=腺嘌呤（腺嘌呤（A）GMP=PRPPPPi鸟嘌呤鸟嘌呤(G)6-MP6-MP6-MP6-MP6-MP6-M

28、P52AZT53（三）（三）DNA的一级结构的一级结构1.DNA的一级结构是指脱氧核苷酸的一级结构是指脱氧核苷酸（碱基）在（碱基）在DNA分子中的排列顺序分子中的排列顺序2.DNA分子中脱氧核苷酸的连接方式：分子中脱氧核苷酸的连接方式：3，5磷酸二酯键磷酸二酯键3.直线形直线形DNA有二个末端：有二个末端：5磷酸末端磷酸末端3羟基末端羟基末端 54A.分子结构式分子结构式B线条式线条式C字母式字母式551)1)端粒端粒:真核生物真核生物染色体染色体DNADNA是线性的是线性的,每复制一次，每复制一次，子链的子链的5 5有缺失（有缺失（50-100bp50-100bp）。）。3 3端有特殊的序列

29、端有特殊的序列,线性线性DNADNA末端的复制必须末端的复制必须的的 -端粒端粒端粒特征端粒特征:3 3端是由数百个串联重复端是由数百个串联重复G G丰富的丰富的6 6个核苷酸组成（个核苷酸组成（AGGGTTAGGGTT）n,5-10kb,n,5-10kb,高度保守高度保守人人:5:5-AGGGTTAGGGTTAGGGTT-3AGGGTT-3端粒能稳定染色体端粒能稳定染色体4.端粒（端粒（telomere）DNA结构与功能结构与功能56n线性线性DNA复复制的末端制的末端57荧光原位杂交显示端粒和端粒序列荧光原位杂交显示端粒和端粒序列58端粒端粒DNA的功能的功能a保证线性保证线性DNA的完整

30、复制的完整复制b维持染色体的稳定维持染色体的稳定c决定细胞的寿命决定细胞的寿命592 2）端粒酶（）端粒酶（telomerasetelomerase)-)-防止端粒缩短的酶防止端粒缩短的酶组成组成 蛋白质蛋白质(DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶)+RNA(+RNA(合成端粒合成端粒DNADNA的模板的模板)唯一携带唯一携带RNARNA模板的逆转录酶模板的逆转录酶人端粒酶人端粒酶:模板模板(RNA-(RNA-端粒酶端粒酶):3):3-CAAUCCCAAUC-5-CAAUCCCAAUC-5 合成合成(DNA):5(DNA):5-AGGGTTAGGGTT-3-360正常体细胞缺乏端粒

31、酶活性，故染色体随细胞正常体细胞缺乏端粒酶活性，故染色体随细胞分裂而变短，细胞随之衰老。分裂而变短，细胞随之衰老。人的生殖细胞，部分干细胞染色体，肿瘤细胞人的生殖细胞，部分干细胞染色体，肿瘤细胞和永生细胞系具有端粒酶活性。和永生细胞系具有端粒酶活性。端粒酶和衰老、肿瘤有关：端粒酶和衰老、肿瘤有关：612009诺贝尔生理学或医学奖-端粒酶（telomerase）Elizabeth Blackburn UCSFJack SzostakHHMI Carol GreiderJHU62DNA末端末端1.RNA和和DNA单链单链互补序列识别结合互补序列识别结合2.以以RNA为模板为模板的逆转录过程的逆转录

32、过程3.再发动新一轮的合成延长再发动新一轮的合成延长,合成较长的重复序列合成较长的重复序列3 3）端粒酶的作用机制）端粒酶的作用机制）端粒酶的作用机制）端粒酶的作用机制634.以延长的以延长的DNA单链为模板单链为模板,3-OH为引物合成富含为引物合成富含C的的互补链互补链645.哺乳动物中端粒末端形成大的环状结构哺乳动物中端粒末端形成大的环状结构,环状环状DNA+蛋白质蛋白质保护染色体保护染色体3端的稳定端的稳定 端粒的环状结构端粒的环状结构651)DNA分子十分巨大，最小的分子十分巨大，最小的DNA分子分子也包含有几千也包含有几千bp，分子量在，分子量在106以上。以上。人类基因组含有约人

33、类基因组含有约3.1647109bp。5.DNA的一级结构特点的一级结构特点66672)每一每一物种物种DNA都具有其特有的碱基都具有其特有的碱基组成组成3)有些碱基常被甲基修饰，称为甲基有些碱基常被甲基修饰，称为甲基化化(methylation)，是重要的表观遗传，是重要的表观遗传修饰。修饰。68(1)细菌细菌DNA甲基化甲基化各种细菌都具有一定的甲基化模式，各种细菌都具有一定的甲基化模式，在在DNA分子中平均分子中平均1%的碱基被甲的碱基被甲基化。基化。甲基化最多的是腺嘌呤和甲基化最多的是腺嘌呤和胞嘧啶胞嘧啶69细菌细菌DNA甲基化作用的生物学意义甲基化作用的生物学意义a.影响影响DNA的

34、构象的构象,影响蛋白质与影响蛋白质与DNA的的相互作用相互作用,以调节以调节DNA复制、转录、修复制、转录、修复、重组和包装的过程。复、重组和包装的过程。如：发生在如：发生在-GATC-的腺嘌呤，于的腺嘌呤，于DNA复制产生的错误碱基修复中起作用复制产生的错误碱基修复中起作用b.多发生于内切酶酶切位点，防止噬菌体多发生于内切酶酶切位点，防止噬菌体入侵，是一种细菌自身保护机制。入侵，是一种细菌自身保护机制。70(2)真核细胞的真核细胞的DNA甲基化甲基化胞嘧啶胞嘧啶甲基化最多甲基化最多约约5%,生成为生成为5-甲基胞嘧啶，大多发生在甲基胞嘧啶，大多发生在CpG重复序列中。重复序列中。可逆可逆反应

35、过程反应过程甲基化酶与去甲基化酶成对存在，都对甲基化酶与去甲基化酶成对存在，都对CpG序列有特异性序列有特异性71CpG岛岛多种基因的启动子区和第一外显子（多种基因的启动子区和第一外显子（60）富）富含含CpG，称为，称为CpG岛。岛。长约长约1-2kb，通常为非甲基化状态，通常为非甲基化状态。在人类基因组内，存在有近在人类基因组内，存在有近3万个万个CpG岛；岛；散在的散在的CpG则多为甲基化的。则多为甲基化的。DNA甲基化通常抑制基因表达，与人类甲基化通常抑制基因表达，与人类发育和肿瘤疾病关系密切。发育和肿瘤疾病关系密切。726.DNA的一级结构的测定的一级结构的测定1)双脱氧末端双脱氧末

36、端终止法终止法Sanger法法2)化学法化学法Maxan-Gilbert法法73Sanger双脱氧末端双脱氧末端终止法测序的基本原理终止法测序的基本原理74Maxan-Gilbert化学法测序基本原理化学法测序基本原理75DNA自动序列测定的基本原理自动序列测定的基本原理76第一步：加入复制终止剂第一步：加入复制终止剂荧光检测探头电泳，看谁跑得快77第二步：荧光检测78DNA全自动分析仪：全自动分析仪：ABI Prism 3700型全自动型全自动遗传分析仪遗传分析仪安玛西亚安玛西亚DNA序列分析系统型号：序列分析系统型号：MegaBACE 500/1000/4000 79（四）（四）DNA的二

37、级结构的二级结构 Dr.Crick Dr.Watson801.DNA双螺旋结构双螺旋结构的提出的提出Watson和和Crick在在1953年提出了著年提出了著名的名的DNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型。这个模。这个模型不仅解释了型不仅解释了DNA的理化性质，而的理化性质，而且将结构与功能联系起来，大大推且将结构与功能联系起来，大大推动了分子生物学的发展。动了分子生物学的发展。81*双螺旋提出的根据双螺旋提出的根据1)DNA纤维晶体的纤维晶体的x-衍射研究衍射研究1952年年Wilkins等等2)Chargaff的碱基分析的碱基分析ATGCATGC的比值的比值不同来源不同来源DNA是不同的是不同

38、的3)碱基和核苷酸的结晶学资料碱基和核苷酸的结晶学资料82清晰的清晰的DNADNA X X衍射图衍射图83DNA 的X衍射图Maurice Wilkins1916-2004Rosalind Elsie Franklin19201958 ChargaffChargaff原则原则原则原则 （1 1 1 1）不同种生物）不同种生物）不同种生物）不同种生物DNADNADNADNA分子中的核苷酸排列顺序不同分子中的核苷酸排列顺序不同分子中的核苷酸排列顺序不同分子中的核苷酸排列顺序不同 （有种族特异性）（有种族特异性）（有种族特异性）（有种族特异性）（2 2 2 2）同种生物不同组织器官细胞中）同种生物不

39、同组织器官细胞中）同种生物不同组织器官细胞中）同种生物不同组织器官细胞中DNADNADNADNA分子的核苷酸分子的核苷酸分子的核苷酸分子的核苷酸 排列顺序相同排列顺序相同排列顺序相同排列顺序相同 (无组织器官特异性无组织器官特异性无组织器官特异性无组织器官特异性)（3 3 3 3）某一特定生物，其）某一特定生物，其）某一特定生物，其）某一特定生物，其DNADNADNADNA碱基组成恒定碱基组成恒定碱基组成恒定碱基组成恒定（4 4 4 4）任何生物）任何生物）任何生物）任何生物DNADNADNADNA碱基组成都符合碱基组成都符合碱基组成都符合碱基组成都符合 A=TA=TA=TA=T，G=CG=C

40、G=CG=C，A+G=T+CA+G=T+CA+G=T+CA+G=T+C8485a.DNA双链反向平行双链反向平行b.碱基配对碱基配对*ATGC*碱基是一个平面环分子。碱基平面垂直碱基是一个平面环分子。碱基平面垂直于螺旋轴于螺旋轴*相邻碱基相距相邻碱基相距0.34nm，每，每10个碱基旋个碱基旋转转1圈，双螺旋螺距为圈，双螺旋螺距为3.4nm，相邻两个，相邻两个碱基正好相差碱基正好相差3602.DNA的双螺旋的双螺旋结构的特点：结构的特点：1)B型型DNA结构结构8687 碱基配对结构碱基配对结构基基88c在在DNA双螺旋分子上交替存在着双螺旋分子上交替存在着大沟和小沟大沟和小沟蛋白质通过大沟和

41、小沟识别碱基序蛋白质通过大沟和小沟识别碱基序列的特异性，其中大沟对于的识别、列的特异性，其中大沟对于的识别、结合尤为重要。结合尤为重要。89d d维持双螺旋的力量维持双螺旋的力量 氢键氢键 碱基堆积力（碱基堆积力（base stacking forcebase stacking force）碱基平面叠在一起，存在碱基平面叠在一起，存在Van der WaalsVan der Waals力力 碱基碱基 疏水性，在双螺旋内部形成疏水的力量疏水性，在双螺旋内部形成疏水的力量 -离子键离子键903.DNA的右手螺旋和左手螺旋的右手螺旋和左手螺旋*DNA构象与核苷酸顺序碱基组成有关构象与核苷酸顺序碱基组

42、成有关并取决于环境条件（盐类、相对湿度）并取决于环境条件（盐类、相对湿度）*主要构象类型：主要构象类型：右手螺旋：右手螺旋：A、B、C、D、E、T型型DNA左手螺旋：左手螺旋：Z型型DNA91湿度和盐类对湿度和盐类对DNA构象的影响构象的影响多核苷酸多核苷酸盐类盐类 相对湿度相对湿度 构象类型构象类型Na+75ANa+92BLi+44CLi+66BT2噬菌体DNANa+60TDNA RNA杂合链Na+3392A天然RNA（逆转录病毒）Na+高达92ANa+43ZNa+高达92ALi+81B天然DNAPoly(dG-dC)9293右手螺旋右手螺旋1）B型型生理条件下最普遍的形式生理条件下最普遍的

43、形式2）A型型RNA双螺旋及双螺旋及DNARNA杂交链（空间位阻小，有利于转录）杂交链（空间位阻小，有利于转录）3）C型型线粒体线粒体DNA及一些病毒及一些病毒4）D型、型、E型型存在于噬菌体等生物中存在于噬菌体等生物中943.左手螺旋左手螺旋Z型型DNA1)发现发现:1979年年A.Rich等人工合成六聚体等人工合成六聚体d（CGCGCG）单晶进行）单晶进行X射线射线衍射分析，数据表明是衍射分析，数据表明是Z型骨架型骨架,左手双螺旋左手双螺旋DNA2)ZDNA的结构特点的结构特点:a.每个螺旋由每个螺旋由12个碱基对构成，螺距个碱基对构成，螺距4.46nm，直径，直径1.8nm9596b.脱

44、氧胞苷的碱基取反式构象，脱氧脱氧胞苷的碱基取反式构象，脱氧鸟苷的碱基是顺式。在鸟苷的碱基是顺式。在ZDNA中中GC交替而出现顺式和反式构象交替而出现顺式和反式构象交替。使糖交替。使糖-磷酸的主链的走向呈磷酸的主链的走向呈“之之”字型，这字型，这 样样Z-DNA主链呈锯主链呈锯齿状（齿状（Zig-Zag）走向。）走向。c.大沟消失，小沟变深大沟消失，小沟变深97d.体内存在的体内存在的Z-DNA序列特点序列特点:(1)DNA序列必须是嘌呤嘧啶交替排列序列必须是嘌呤嘧啶交替排列如：如：CGCGCGGCGCGC(2)序列中必须有序列中必须有5-甲基胞嘧啶的存在甲基胞嘧啶的存在98E.与与Z-DNA结

45、合的特殊蛋白质结合的特殊蛋白质FZ-DNA有利于有利于DNA的负超螺旋的负超螺旋打开打开G抗抗Z-DNA抗体抗体993）Z-DNA的功能：的功能：基因表达有关基因表达有关Z-DNA抗体常常紧密地结合在染色抗体常常紧密地结合在染色体的疏松部位体的疏松部位,增强转录活性的位点。增强转录活性的位点。100基因调控基因调控Z-DNA可能参与识别调控蛋白质。可能参与识别调控蛋白质。基因重组基因重组Willia等做的黑粉菌实验指出等做的黑粉菌实验指出,Z-DNA在基因重组中起非常重要的过渡作用在基因重组中起非常重要的过渡作用.在黑粉菌中有一种在黑粉菌中有一种rec1酶能使染色体酶能使染色体第一次配对后互相

46、交换片段第一次配对后互相交换片段,在配对时在配对时由由rec1酶使酶使Z-DNA的双链产生的双链产生,并且这并且这种酶与种酶与Z-DNA亲和力比亲和力比B-DNA高高75倍倍,Z-DNA与与rec1酶紧密结合是这一酶紧密结合是这一时期的主要特征时期的主要特征.101疾病治疗与新药开发疾病治疗与新药开发Kim等研究表明等研究表明,一种关键的天花病毒蛋一种关键的天花病毒蛋白白E3L蛋白蛋白(已知该蛋白是病毒摧毁动已知该蛋白是病毒摧毁动物细胞的防御系统所必需的物细胞的防御系统所必需的)是通过是通过Z-DNA结合、干扰防御系统的运行来结合、干扰防御系统的运行来行使功能的。行使功能的。102表表2右手螺

47、旋与左手螺旋右手螺旋与左手螺旋DNA分子的比较分子的比较_项项目目A-DNAB-DNAZ-DNA_螺旋方向螺旋方向右旋右旋右旋右旋左旋左旋每转每转1圈碱基数圈碱基数1110412螺旋直径螺旋直径2.55nm2.37nm1.84nm螺距螺距2.46nm3.32nm4.56nm碱基平面的倾角碱基平面的倾角19olo9o大沟大沟窄，很深窄，很深宽，较深宽，较深平平小沟小沟很宽，浅很宽，浅窄，较深窄，较深很窄很窄,深深_1034.三螺旋三螺旋DNA（HDNA；triple-helicalDNA）三链三链DNA（triplestrandsofDNA)是一条是一条DNA链在链在DNA的大沟与的大沟与DNA

48、双双螺旋中的一条螺旋中的一条DNA链以氢键相结合形链以氢键相结合形成的三股螺旋结构。成的三股螺旋结构。1041051）三螺旋）三螺旋DNA结构：结构：（1）三螺旋三螺旋DNA是在是在DNA双螺旋结构的双螺旋结构的基础上形成的，三链区的三链均为基础上形成的，三链区的三链均为同型嘌呤（同型嘌呤（homopurineHPU）或）或同型嘧啶同型嘧啶(homopyrimidineHPY）106（2）根据三条链组成及相对位置可分为根据三条链组成及相对位置可分为 Pu-Pu-Py（偏碱性介质中稳定）（偏碱性介质中稳定）Py-Pu-Py（偏酸性介质中稳定）（偏酸性介质中稳定）（3）链中的碱基配对方式链中的碱基

49、配对方式两个碱基符合两个碱基符合Watson-Crick碱基配对碱基配对另个碱基按另个碱基按Hoogsteen模型模型如：如：TA-TCG-C(第三位上的第三位上的“C”必须质子化必须质子化)A A-T107108嘧啶核苷酸嘧啶核苷酸嘌呤核苷酸嘌呤核苷酸(a)嘧啶嘧啶-嘌呤嘌呤-嘧啶三螺旋嘧啶三螺旋DNA序列序列(b)三螺旋三螺旋DNA结构示意图结构示意图ab1092）生物学意义及应用：生物学意义及应用：(1)三螺旋三螺旋DNA结构常位于结构常位于DNA一些重要一些重要的部位。的部位。如：复制的起始点或终点，转录的调如：复制的起始点或终点，转录的调控区或调节蛋白结合位点以及控区或调节蛋白结合位

50、点以及DNA重重组位点，提示与这些功能相关。组位点，提示与这些功能相关。(2)丰富了丰富了DNA结构学说结构学说110b.用寡聚用寡聚DNA片段封闭转录因子结合片段封闭转录因子结合点关闭有害基因活病毒基因。点关闭有害基因活病毒基因。（抗肿瘤，病毒，寄生虫等）（抗肿瘤，病毒，寄生虫等）(3)基因治疗中的应用基因治疗中的应用a.单链单链DNA片段可携带切割剂（核酸片段可携带切割剂（核酸内切酶，内切酶，EDTA-Fe等）携带至等）携带至DNA的特定位点，选择性切断的特定位点，选择性切断DNA。1115.四螺旋四螺旋DNA1)发现在真核染色体末端含有一个发现在真核染色体末端含有一个富含富含G的单链的单

51、链DNA尾巴，它在体内尾巴，它在体内的超螺旋的超螺旋应力作用下，可自身回折应力作用下，可自身回折形成形成HoogsteenG-G碱基对。两个碱基对。两个DNA分子或染色体分子可彼此连接分子或染色体分子可彼此连接起来形成一个局部的四螺旋结构。起来形成一个局部的四螺旋结构。1121132)四螺旋四螺旋DNA的结构的结构*四螺旋结构由多个四螺旋结构由多个G-四碱基体形四碱基体形成右手螺旋，每圈含成右手螺旋，每圈含13个四碱基个四碱基体体DNA。*在四碱基体中，四条链以对称和反在四碱基体中，四条链以对称和反对称构象交替存在。对称构象交替存在。1141153)可能的生物学意义可能的生物学意义两个两个DN

52、A分子或染色体分子可彼此连分子或染色体分子可彼此连接起来形成一个局部的四螺旋结构接起来形成一个局部的四螺旋结构,这种这种结构可能起着稳定染色体的作用结构可能起着稳定染色体的作用116（五）（五）DNA超螺旋结构（三级结构）超螺旋结构（三级结构）1.DNA三级结构就是指双螺旋三级结构就是指双螺旋DNA链链进一步扭曲、盘旋形成超螺旋结构。进一步扭曲、盘旋形成超螺旋结构。*超螺旋：超螺旋：负超螺旋（负超螺旋（negativesupercoil）正超螺旋正超螺旋(positivesupercoil)1172.生物体的闭环生物体的闭环DNA都以超螺旋形式都以超螺旋形式存在存在,如质粒、病毒、线粒体的如质

53、粒、病毒、线粒体的DNA118（六）真核生物染色体（六）真核生物染色体DNA真核生物真核生物DNA分子呈线状，其超螺旋分子呈线状，其超螺旋结构不同于上述环状结构不同于上述环状DNA。它们主要存。它们主要存在于染色体，以在于染色体，以核小体核小体的形式再进一步的形式再进一步盘绕折叠。盘绕折叠。119*核小体核小体Nucleosome 1 1）核小体核心：组蛋白）核小体核心：组蛋白HistoneHistone八聚体八聚体 （H2A,H2B,H3,H4H2A,H2B,H3,H4各两分子）各两分子）各两分子）各两分子）1.75圈圈DNA超螺旋（超螺旋（146bp）2 2）连接区：组蛋白）连接区：组蛋白

54、H1 和和 20-80bpDNA双螺旋双螺旋120121DNA（2nm）核小体链（核小体链（11nm，每个核小体，每个核小体200bp）纤丝（纤丝（30nm，每圈，每圈6个核小体）个核小体）突环（突环（150nm，每个突环大约，每个突环大约75000bp）玫瑰花结（玫瑰花结（300nm，6个突环）个突环）螺旋圈（螺旋圈（700nm，每圈，每圈30个玫瑰花）个玫瑰花）染色体（染色体（1400nm，每个染色体含每个染色体含10个玫瑰花个玫瑰花200bp）真核生物染色体真核生物染色体DNA组装组装122DNA的质量、长度和浓度计算方法的质量、长度和浓度计算方法1.长度长度0.34bp=（nm)2.分

55、子质量分子质量660bp=（dal)3.浓度浓度50OD260nm=g/ml(光径为光径为1cm)123(七七)DNA的变性、复性和杂交的变性、复性和杂交1.变性（变性（denaturation)1）概念）概念：当当DNA的二级结构和三级结构受到物理的二级结构和三级结构受到物理化学等因素的破坏而解体，其一级结构核化学等因素的破坏而解体，其一级结构核苷酸间共价键并不断裂，使配对碱基间氢苷酸间共价键并不断裂，使配对碱基间氢键断裂，有序的螺旋解离成无序单链的过键断裂，有序的螺旋解离成无序单链的过程称为变性。程称为变性。124*引起变性的因素：引起变性的因素：常见的有加热、酸、碱、乙醇、常见的有加热、

56、酸、碱、乙醇、丙酮、尿素、甲酰胺等作用，丙酮、尿素、甲酰胺等作用，1252)变性过程中变性过程中DNA物化性质发生改变物化性质发生改变增色效应增色效应(hyperchromiceffect)浮力密度浮力密度黏度黏度旋光度变小旋光度变小沉淀速度沉淀速度1263）DNA的熔解曲线的熔解曲线(meltingcurve)熔解温度（熔解温度（meltingtemperature,Tm）通常将通常将50%DNA分子变性时的温度分子变性时的温度称为熔解温度。称为熔解温度。*一般一般DNA在生理条件下在生理条件下Tm在在85-95oC之间之间127DNA的熔解曲线的熔解曲线128(2)影响影响Tm的因素的因素

57、.DNA的碱基组成的碱基组成（GC）Tm（GC）每增加）每增加1,Tm线性增加线性增加0.41（GC）为）为40，Tm为为87（GC）为）为60，Tm为为95129.介质中的离子强度介质中的离子强度盐浓度盐浓度Tm,变性过程跨越的温变性过程跨越的温度范围更狭窄度范围更狭窄,如单价离子浓度增如单价离子浓度增加加10倍倍,Tm增加约增加约16.6.变性剂变性剂50甲酰胺可使甲酰胺可使Tm降低降低30.DNA的均一性的均一性130离子强度对离子强度对Tm的影响的影响1312.复性复性(renaturation)(1)概念：概念：变性的两条变性的两条DNA单链在合适条件下，单链在合适条件下，可按原来的

58、碱基配对再结合在一起，形可按原来的碱基配对再结合在一起，形成双螺旋结构。成双螺旋结构。*退火（退火（annealing）:加热变性的加热变性的DNA分子在温度缓慢分子在温度缓慢降低时可恢复到原来正常降低时可恢复到原来正常DNA的结的结构构,这个复性过程又称这个复性过程又称“退火退火”132133图图3-26DNA热变性过程的两种冷却过程示意图热变性过程的两种冷却过程示意图134(2)影响影响DNA复性因素复性因素1）DNA序列序列简单序列简单序列复性快复性快2）DNA浓度浓度浓度高浓度高复性快复性快3）DNA片段大小片段大小小片段小片段DNA易于复性易于复性1354）温度温度复性最佳温度为复性

59、最佳温度为Tm-25（一般为（一般为60，50甲酰胺存在最佳温度甲酰胺存在最佳温度42）5）溶液中离子浓度溶液中离子浓度盐浓度需在盐浓度需在0.4molL以上以上1363.杂交（杂交（hybridization）1)概念概念:不同来源但具有同源性的不同来源但具有同源性的两条两条DNA或或RNA单链，单链，按碱基配按碱基配对的原则结合，这一过程为杂交，对的原则结合，这一过程为杂交，可以是可以是 DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA之间进行。之间进行。1371382)核酸分子杂交常用的技术核酸分子杂交常用的技术Southern印迹分析法印迹分析法1975年英国科学家年英国科学家South

60、ern首先首先提出并利用此方法检查基因组提出并利用此方法检查基因组DNA的特异序列。的特异序列。Northern印迹分析法印迹分析法根据根据Southern法的基本原理，分法的基本原理，分析检测析检测RNA。139斑点杂交斑点杂交细胞原位杂交细胞原位杂交菌落或噬菌斑原位杂交菌落或噬菌斑原位杂交3).分子杂交的探针分子杂交的探针概念概念:探针是分子杂交的必要工具，探针是分子杂交的必要工具，它是带有某种标记的一段碱基序列，它是带有某种标记的一段碱基序列，与待测基因序列的与待测基因序列的DNA或或RNA或寡或寡聚核苷酸互补。聚核苷酸互补。140探针的标记探针的标记）放射性同位素标记）放射性同位素标记如用如用32P、35S、3H）非放射性标记）非放射性标记主要有生物素标记、主要有生物素标记、地高辛标记地高辛标记141142