中国药品检验标操作规程紫外-可见分光光度法

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1、紫外可见分光光度法1 简述紫外一可见分光光度法是通过被浏物质在紫外光区或可见光区的特定波特长或确定波长范围内的吸光度，对该物质进展定性和定量分析的方法。本法在药品检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量测定。定量分析通常选择物质的最大吸取波特长测出吸光度，然后用比照品或吸取系数求算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定；对物质定性可用吸取峰波长或吸光度比值作为鉴别方法；假设该物质本身在紫外光区无吸取，而其杂质在紫外光区有相当强度的吸取，或杂质的吸取峰处该物质无吸取，则可用本法作杂质检查。物质对紫外辐射的吸取是由于分子中原子的外层电子跃迁所产生，因此，紫外吸取主要打算于分子的电子构造，故紫外光谱又称

2、电子光谱。有机化合物分子构造中如含有共轭体系、芳香环等发色基团，均可在紫外区(200400nm)或可见光区(400850nm)产生吸取。通常使用的紫外一可见分光光度计的工作波长范围为190900nm紫外吸取光谱为物质对紫外区辐射的能量吸取图朗伯一比尔( Lambert-Beer)定律为光的吸取定律，它是紫外分光光度法定量分析的依据，其数学表达式为：式中：A 为吸光度；T 为透光率；E 为吸取系数；c 为溶液浓度，l 为光路长度。如溶液的浓度(c)为 1%( g/ml)，光路长度(l)为 lcm相应的吸光度即为吸取系数，以表示。如溶液的浓度(f)为摩尔浓度(mol/L)，光路长度为 lcm 时，

3、则相应的吸取系数为摩尔吸取系数，以 表示。2 仪器紫外一可见分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、记录仪、显示系统和数据处理系统等局部组成。为了满足紫外一可见光区全波长范围的测定，仪器备有两种光源，即氘灯和碘钨灯，前者用于紫外区，后者用于可见光区。单色器通常由进光狭缝、出光狭缝、平行光装置、色散元件，聚焦透镜或反射镜等组成。色散元件有棱镜和光栅两种，棱镜多用自然石英或熔融硅石制成，对200-400nm 波长光的色散力气很强，对 600nm 以上波长的光色散力气较差，棱镜色散所得的光谱为非匀捧光谱，光栅系将反射或透射光经衍射而到达色散作用，故常称为衍射光栅，光栅光谱是按波长作线性排列，故

4、为匀排光谱，双光束仪器多用光栅为色散元件。检测器有光电管和光电倍增管两种。紫外一可见分光光度计依据其构造和测量操作方式的不同可分为单光束和双光束分光光度计两类。单光束分光光度计有些仍为手工操作，即固定在某一波长， 分别测量比较空白、样品或参比的透光率或吸光度，操作比较费时，用于绘制吸取光谱图时很不便利，但适用于单波长的含量测定双光束分光光度计藉扇形镜交替切换光路使分成样品(S)和参比(R)两光束，并先后到达检测器，检测器信号经调制分别成两光路对应信号，信号的比值可直接用记录仪记录，双光束分光光度计操作简洁，测量快速，自动化程度高，但作含量测定时，为求准确起见，宜用固定波长测量方式3 紫外一可见

5、分光光度计的检定3.1 波长准确度3.1.1 波长准确度的允差范围紫外一可见分光光度计波长准确度允许误差，紫外区为士 Inm,500nm 处士 2nm。3.1.2 波长准确度检定方法3.1.2.1 用低压汞灯检定关闭仪器光源，将汞灯用笔式汞灯最便利直接对准进光狭缝，如为双光束仪器，用单光束能量测定方式，承受波长扫描方式， 扫描速度“慢”(如 15nm/min)、响应“快”、最小狭缝宽度(如 0.1mm)、量程 0 100%，在 200800nm 范围内单方向重复扫描 3 次，由仪器识别记录各峰值假设仪器无“峰检测”功能，必要时可对指定波进步行 “单峰”扫描。单光束仪器以 751G 型为例，可将

6、选择开关放在 XO.1 位置，透光率读数放在100或选择开关放在1，透光率放在 10，关小狭缝，翻开光闸门，缓缓转动波长盘，查找汞灯 546. 07nm峰消灭的位置，假设与波长读数不符，应调整仪器左侧准直镜的波长调整螺丝，如波长向短波长方向移动，应顺时针方向旋转波长调整螺丝，如向长波方向移动，则应反时针方向旋转波长调整螺丝，调整好后，再按汞灯的以下谱线测试，记录每条谱线与仪器波长读数的误差。用于检定紫外一可见分光光度计的汞灯谱线波长：237. 83、253. 65、275. 28、296. 73、302.15、313. 16、334. 15、365. 02、365. 48、366. 33、40

7、4.66紫色、435. 83蓝色、546. 07绿色、576. 96黄色及 579. 07nm。3.1.2.2 用仪器固有的氘灯检定 本法主要用于日常工作中波长准确度的核对取单光束能量测定方式，测量条件同上述低压汞灯的方法，对 486. 02nm 及656lOnm 二单峰进展方向重复扫描 3 次。3.1.2.3 用氧化钬玻璃检定将氧化钬玻璃放入样品光路参比光路为空气，按测定吸取光谱图方法测定校正自动记录仪器时，应考虑记录仪的时间常数，测定样品与校正时取同一扫描速度。氧化钬玻璃在 279.4、287.5、333.7、360.9、418.7、460.0、484.5、536.2及 637. 5nm

8、波特长有锐利的吸取峰，可供波长检定用。氧化钬玻璃因制造的原因，每片氧化钬的吸取峰波长有差异，另外，在放置过程中也会发生波长漂移，因此需定期由计量部门校验。3.1.2.4 用高氯酸钬溶液检定本法可供没有单光束测定功能的双光束紫外分光光度计波长准确度检定用。高氯酸钬溶液的配制方法：取 10%高氯酸为溶剂，参与氧化钬(Ho2O3)配成 4% 溶液即得。高氯酸钦溶液较强的吸取峰波长为 2 41.13、278.10、 287.18、333. 44、345. 47、361.31、416. 28、451.30、485. 29、536. 64、640.52nm.假设是双光束扫描仪器，但不是数据贮存型的指是直接

9、将信号描记于记录纸上，记录的波长可能因记录笔滞后而非真实波长，为了准确测定，建议承受定点检定而不用扫描方式。3.2 吸光度准确度周密称取在 120枯燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，置 100ml 量瓶中，用 0. 005mol/L 硫酸液溶解并稀释至 lOOOml，用配对的1cm 石英池，以 0.005moll。硫酸液为空白，在 235、257、313、350nm 分别测定吸光度，然后换算成，测得值应符合表 1 中规定的允差范围。表 1分光光度法允差范围波长nm吸取强度吸取系数允许误差235最小124.5123.0126.0257最大144.0142.8146.2313最小48.647.05

10、0.3350最大106.6105.5108.5区分率、基线平直度、稳定度、绝缘电阻等项检定，按现行国家技术监视局“双光束紫外一可见分光光度计检定规程”检定，应符合有关项下的规定。日常使用中，对以上两项，即波长和吸光度准确度应依据需要随时检查。3.3 杂散光的检查可按表 2 所列的试剂和浓度，配制成水溶液，置 1cm 石英池中，在规定的波特长测定透光率，应符合表 2 中规定。表 2 杂散光的检查及限度试剂浓度%，g/ml测定波速nm透光率%碘化钠1.002200.8亚硝酸钠5.003400.84 样品测定操作方法4.1 吸取系数测定性状项下按各品种项下规定的方法配制供试品溶液，在规定的波特长参见

11、 5.8 项测定其吸光度，并计算吸取系数，应符合规定范围。4.2 鉴别及检查按各品种项下的规定，测定供试品溶液的最大及最小吸取波长，有的并须测定其在最大吸取波长与最小吸取波特长的吸光度比值，均应符合规定。4.3 含量测定4.3.1 比照晶比较法按各晶种项下规定的方法，分别配制供试品溶液和比照品溶液，比照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的100%10%以内，用同一溶剂，在规定的波特长测定供试品溶液和比照品溶液的吸光度。4.3.2 吸取系数法按各品种项下配制供试品溶液，在规定的波长及该波长2nm 处测定其吸光度，按各该品种在规定条件下给出的吸取系数计算含量。用本法测定时，吸取

12、系数通常应大于 100，并留意仪器的校正和检定，如测定品种的吸取系数，需按后列“吸取系数测定法”的规定进展。4.3.3 计算分光光度法 按中国药典规定，计算分光光度法一般不宜用于含量测定，对于少数承受计算分光光度法的品种，应严格按各品种项下规定的方法进展。用本法时应留意：有一些吸光度是在待测成分吸取曲线的上升或下降陡坡处测定，影响精度的因素较多，故应认真操作，尽量使供试品和比照品的测定条件全都。假设该品种不用比照品，如维生素 A 测定法见中国药典附录，则应在测定前对仪器作认真的校正和检定。4.3.4 比色法 供试品本身在紫外一可见光区没有强吸取，或在紫外光区虽有吸取但为了避开干扰或提高灵敏度，

13、参与适当的显色剂，使反响产物的最大吸取移至可见光区。用比色法测定时，由于显色时影响显色深浅的因素较多，应取供试品与比照品或标准品同时操作。除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替比照品或供试品溶液，然后依次参与等量的相应试剂，并用同样方法处理。当吸光度和浓度关系不呈良好线性时，应取数份梯度量比照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓度绘制标准曲线，再依据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含 量。5 留意事项5.1 试验中所用的量瓶和移液管均应经检定校正、洗净后使用。5.2 使用的石英吸取池必需干净。当吸取池中装入同一溶剂，

14、在规定波长测定各吸取池的透光率，如透光率相差在 0. 3%以下者可配对使用，否则必需加以校正。5.3 取吸取池时，手指拿毛玻璃面的两侧。装样品溶液的体积以池体积的4/5 为度，使用挥发性溶液时应加益，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视应无残留溶剂，为防止溶剂挥发后溶质残留在池子的透光面，可先用醮有空白溶剂的擦镜纸擦拭，然后再用干擦镜纸拭净。吸取池放入样品室时应留意每次放入方向一样。使用后用溶剂及水冲洗干净，晾干，防尘保存，吸取池如污染不易洗净时可用硫酸发烟硝酸(3：1V1V)混合液稍加浸泡后，洗净备用。如用铬酸钾清洁液清洗时，吸取池不宜在清洁液中长时间浸泡，否则清洁液中的铬酸钾结晶会损坏吸

15、取池的光学外表，并应充分用水冲洗，以防铬酸钾吸附于吸取池外表。5.4 含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸取。因此，当作溶剂使用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波长。例如甲醇、乙醇的截止使用波长为 205nm。另外，当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸取。因此，在检查所用的溶剂在供试品所用的波长四周是否符合要求，马上溶剂置 1cm 石英吸取池中，以空气为空白即空白光路中不置任何物质测定其吸光度，溶剂和吸取池的吸光度应符合表 3 规定。表 3 以空气为空白测定溶剂在不同波特长的吸光度的规定波长范围nm220240241250251300300 以上吸光度0.400.200.100.05每次

16、测定时应承受同一厂牌批号，混合均匀的同批溶剂。5.5 称量应按药典规定要求。配制测定溶液时稀释转移次数应尽可能少， 转移稀释时所取容积一般应不少于 5ml。含量测定时供试品应称取 2 份，如为比照品比较法，比照品一般也应称取 2 份。吸取系数检查也应称取供试品 2 份，平行操作，每份结果对平均值的偏差应在0. 5%以内。作鉴别或检查可取样品 1 份。5.6 供试品溶液的浓度，除各品种项下已有注明者外，供试品溶液的吸光度以在 0.3 0.7 之间为宜，吸光度读数在此范围误差较小，并应结合所用仪器吸光度线性范围，配制适宜的读数浓度。5.7 选用仪器的狭缝谱带宽度应小于供试品吸取带半高宽的 10%，

17、否则测得的吸光度值会偏低，或以减小狭缝宽度时供试品溶液的吸光度不再增加为准，对于中国药典紫外分光光度法测定的大局部品种，可以使用 2nm 缝宽，但当吸取带的半高宽小于 20nm 时，则应使用较窄的狭缝，例如青霉素钾及钠的吸光度检查需用 Inm 缝宽或更窄，否则其 264nm 的吸光度会偏低。5.8 测定时除另有规定者外，应在规定的吸取峰2nm 处，再测几点的吸光度，以核对供试品的吸取峰位置是否正确，并以吸光度最大的波长作为测定波长，除另有规定外吸光度最大波长应在该品种项下规定的波长2nm 以内，否则应考虑试样的同一性、纯度以及仪器波长的准确度。5.9 用于制剂含量测定时，应留意供试液与比照液的

18、 pH 值是否全都，如pH 值对吸取有影响，则应调溶液的 pH 值全都后再测定吸光度。6 结果计算6.1 比照品比较法可依据供试品溶液及比照品溶液的吸光度与比照品溶液的浓度以正比法算出供试品溶液的浓度，再计算含量。式中：A 为吸光度值；c 为测试液浓度以 mgml 计。6.2 吸取系数法中国药典规定的吸取系数，系指，即在指定波长时，光路长度为 1cm，试样浓度换算为 1%(gml)时的吸光度值， 故应先求被测样品的 E盏值，再与规定的值比较，可计算出供试样品的含量。式中:A 为供试品溶液测得的吸光度值；c 为供试品溶液的百分浓度，即 100ml 中所含溶质的克数(gml)；l 为吸取池的光路长

19、度(cm)。式中：为依据前式计算出的供试品吸取系数；为药典或药品标准中规定的吸取系数。7 吸取系数测定法本法主要用于品种的吸取系数测定。7.1 测定方法取精制样品周密称取确定量，使样品溶液配成吸光度读数在 0.60.8 之间，置 lcm 吸取池中在规定波特长按 5.8 项的规定测出吸光度读数，然后再用同批溶剂将溶液稀释 1 倍，使吸光度在 0.30.4 之间，再按上述方法测定。样品应同时测定 2 份，同一台仪器测定的 2 份结果，对平均值的偏差应不超过0.3%，否则应重测定。测定时，先按仪器正常灵敏度测试，然后再减小狭缝测定，直到减小狭缝吸光值不增加为止，取吸光度不转变的数据。再用 4 台不同

20、型号的仪器复测。吸取系数可依据朗伯一比尔定律求算，以下例说明。某化合物的分子量为 287，用乙醇配成浓度为 0. 0030%的溶液，在波长297nm 处，用lcm 石英池，测得吸光度为 0.6139，求 El 器值及摩尔吸取系数 E 值。7.2 测定留意事项7. 2.1样品应为精制品，水分或枯燥失重应另取样测定并予以扣除。7.2.2 所用的容量仪器及分析天平应经过检定，如有相差应加上校正值。7.2.3 测定所用的溶剂，其吸光度应符合规定。吸取池应于临用时配对或作空白校正。7.2.4 称取样品时，其称量准确度应按中国药典规定要求。7.2.5 所用的分光光度计应经过严格检定，特 211 是波长准确度和吸光度精度要进展校正。要注明测定时的温度。修订人：周静远天津市药品检验所凌大奎北京市药品检验所